平成11年度研究報告
分担研究者:宮崎 奉之(東京都立衛生研究所)
研究協力者:鈴木 隆 (国立医薬品食品衛生研究所)
(1)FDAデータ
1987年にローマで開催された32nd JECFA(FAO/WHO専門者会議)の「動物及び食品中における 動物用医薬品の残留」の会議において、天然ホルモンのエストラジオール、プロゲステロン、テストステロンについて、これら各種のホルモン剤使用による場合と天然のバックグラウンド値の比較データが掲載されている。さらに、52nd JECFA(1999.Feb)により、これらホルモンが再評価され、ADI値が設定された。今回、これまでの最も多くのデータが掲載されている、D.Arnold:hormones,Revised working paper on residues によりまとめられたものを参考にバックグラウンド値について検討した。
掲載されたデータの測定法はいずれもラジオイムノアッセイ(RIA)である。バックグラウンドをみるためのデータもあるが、多くはホルモン剤(天然型、合成型)の埋め込み実験を行った時の対象としたコントロール値を抜き出したものである。ここでは雌雄別にしてデータをまとめた。
(1) 雄牛組織中のE1,E2測定データ
D. Arnoldに掲載されたデータの雄牛組織中のエストロン(E1),エストラジオール−17β(E2)濃度より表2〜表14を作成した。表1はこれら表2から表14までのデータのうち、筋肉中のE1,E2濃度をまとめたものである。E1濃度(平均値が多い)は、去勢牛では1.53〜17pg/gの範囲であり、中間値は1.7、2.4pg/gである。子牛の去勢牛のデータでは表4のようにE1濃度は若干幼児期ほど低い傾向にあり、また一般的な去勢牛より低めであった。未去勢牛のE1濃度は子牛、成牛とも、7.0から10.8pg/gで去勢牛に比べ高い値を示した。部位別の濃度差は脂肪組織が最も高く、脂肪組織>肝臓>筋肉≧肝臓等の順が多く見受けられたが、変動も見られた。
E2濃度については、去勢牛では0.30〜44.5pg/g、中間値は2.1pg/gであり、E1濃度に近い値を示した。子牛の去勢牛のE2濃度は0.51〜2.91pg/gであり、一般的な去勢牛より低めであった。未去勢牛は子牛も成牛も去勢牛に比べ、E1同様に高めの値を示し、5.0から6.8pg/gの間にあった。部位別のE2濃度差は脂肪組織>腎臓>肝臓≧筋肉の順が多く、E1に近いものであった。しかし、未去勢牛では腎臓>脂肪組織>肝臓>筋肉や、肝臓>脂肪組織>腎臓>筋肉などの場合が見られた。
表1 表2から表14より集計した各種雄牛筋肉部のE1,E2濃度の比較
E1(pg/g) | E2(pg/g) | |
Steers | 1.53, 1.56, 1.7, 2.4, 8.4, 17 | 0.30, 0.68, 0.77, 0.97, 2.1, 8.6, 10.4, 22.5, 44.5 |
Calves Steers | 0.57〜1.95 | 0.51 〜 2.91 |
Bull | 7.2, 7.7 | 5.0, 6.3 |
Bull Calves | 7, 10.8 | 5, 6.8 |
表2 去勢牛のバリデーション研究による測定(n = 6,pg/g)
Muscle | Fat | Kidney | Liver | ||
Steers | E1 | 2.4 ±1.53 | 8.0±6.1 | − | − |
(T7) | E2 | 0.30±0.14 | 1.7±0.32 | − | − |
表3 去勢牛のバリデーション研究による測定(n = 1,pg/g)
Muscle | Fat | Kidney | Liver | ||
Steers | E1 | 1.8 | 10.2 | 13 | 3.4 |
(T8) | E2 | 0.97 | 1.4 | 25.4 | 4.4 |
表4 子牛(雄牛)にSYNOVEX C and SYNOVEX S 埋め込み実験のコントロール
(pg/g)
(FDA/CVM,NADA file 9-576)
Calves | day | Muscle | Fat | Kidney | Liver | |
Steers |
61 |
E1(n=5) | 0.94±0.36 | 5.36±3.15 | 1.05±0.40 | 1.78±0.27 |
E2(n=5) | 1.11±0.30 | 3.3±0.64 | 1.46±0.8 | 1.78±1.05 | ||
119 |
E1(n=5) | 0.57±0.31 | 6.10±7.73 | 1.03±0.45 | 1.06±0.16 | |
E2(n=5) | 0.51±0.14 | 6.73±9.03 | 1.28±0.82 | 1.57±0.26 | ||
241 |
E1(n=5) | 1.73±0.55 | 4.83±1.99 | 2.92±0.48 | 1.69±0.54 | |
E2(n=5) | 2.21±0.32 | 3.28±1.07 | 2.09±0.97 | 3.45±0.79 | ||
301 |
E1(n=5) | 0.93±0.34 | 3.09±1.40 | 1.20±0.77 | 1.27±0.57 | |
E2(n=5) | 2.91±3.36 | 2.88±1.12 | 5.64±6.25 | 2.48±0.67 | ||
329 |
E1(n=5) | 1.95±0.48 | 5.07±1.98 | 2.41±0.98 | 1.26±0.31 | |
E2(n=5) | 1.23±0.43 | 3.16±0.90 | 3.29±2.54 | 1.77±0.09 | ||
360 |
E1(n=5) | 1.61±1.20 | 3.64±2.10 | 2.55±0.48 | 1.72±0.45 | |
E2(n=5) | 1.68±1.44 | 5.81±3.4 | 2.77±0.92 | 3.62±0.45 |
表5 去勢牛にSYNOVEX S 埋め込み実験のコントロール
(n=21,700 - 750 lbs,pg/g)
(JECFA)
Steers |
Muscle(16) | Fat(21) | Kidney(18) | Liver(18) | |
E1 | 1.53 | 7.37 | 1.02 | 0.73 | |
E2 | 0.68 | 1.91 | 1.53 | 0.87 |
表6 去勢牛にSYNOVEX S 埋め込み実験のコントロール
(n=21,700 - 750 lbs,pg/g)
(FDA/CVM,NADA file 9-576)
Steers (T9) |
Muscle |
Fat |
Kidney |
Liver |
|
E1 | 1.56±0.65 | 8.62±5.14 | 1.03±0.50 | 0.65±0.24 | |
E2 | 0.77±0.35 | 1.89±1.14 | 1.7 ±0.6 | 0.91±0.42 |
表7 去勢牛にSTEER−oid 埋め込み実験のコントロール(n = 8,pg/g)
(FDA/CVM,NADA file 110-315)(1982)
Steers (T-23) |
Muscle |
Fat |
|
E2 | 44.5±11.7 | 166.8±29.9 |
表8 子牛(未去勢)にCOMPUDOSE埋め込み実験のコントロール(pg/g)
(JECFA, vol.1, p.218)
(n) | Lean | Kidney fat | Kidney | Liver | |
Bull calves (T37) |
E1(17) | 10.8±8.71 | 13.9±4.88 | 9.8±4.55 | 9.1±3.56 |
E2(17) | 6.8±3.45 | 11.2±14.94 | 10.6±5.28 | 14.7±5.76 |
表9 未去勢牛にCOMPUDOSE埋め込み実験のコントロール(pg/g)
(JECFA, vol.1, p.254)
(n) |
Lean |
Kidney fat |
Kidney |
Liver |
|
Bulls (T38) |
E1 (6) | 7.7±3.1 | 15.3±8.2 | 8.7±3.0 | 6.0±1.2 |
E2 (6) | 6.3±2.0 | 9.1±2.0 | 10.0±3.4 | 8.5±3.2 |
表10 去勢牛にTORELOR 埋め込み実験のコントロール(pg/g)
(FDA/CVM,INAD file 4216)(1986)
Steers (T42) |
Muscle |
Fat |
Kidney |
Liver |
|
E2 | 22.5±12.4 | 13.7±7.4 | 15.5±3.4 | 20.5±6.9 | |
Conjugated E2 | 9.3±8.4 | 9.7±7.9 | 41.0±4.1 | 34.5±9.2 | |
Total E2 | 31.8±13.2 | 23.3±14.7 | 56.5±7.1 | 55.0±9.2 |
表11 去勢牛にE2, trenbolone acetate 埋め込み実験のコントロール(pg/g)
(FDA/CVM,NADA file 140-992)
Steers (T-45a) |
Muscle | Fat | Kidney | Liver | |
E2 | 2.1 | 6.6 | 21.2 | 0.0 |
表12 去勢牛にCOMPUDOSE 埋め込み実験のコントロール(pg/g)
Steers (T-54) |
Muscle |
Fat |
Kidney |
Liver |
|
E1 | 8.4 | 10.9 | 9.1 | 8.3 | |
E2 | 10.4 | 6.3 | 9.4 | 5.9 |
表13 去勢牛にCOMPUDOSE 埋め込み実験のコントロール(pg/g)
ZEBU Steers (T-58) |
Muscle | Fat | Kidney | Liver | |
E1 | 17 | 5.3 | - | 8.0 | |
E2 | 8.6 | 5.0 | - | 8.1 |
表14 子牛(雄未去勢)にCOMPUDOSE 埋め込み実験のコントロール(pg/g)
Bulls (T-56) |
Muscle |
Fat |
Kidney |
Liver |
|
E1 | 7 | 13 | 8 | 9 | |
E2 | 5 | 5 | 11 | 14 |
表15 成雄牛(未去勢)にCOMPUDOSE 埋め込み実験のコントロール(pg/g)
Bulls (T-57) |
Muscle |
Fat |
Kidney |
Liver |
|
E1 | 7.2 | 13.6 | 8.5 | 5.5 | |
E2 | 5.0 | 9.0 | 9.7 | 8.7 |
(2)雌牛組織中のE1,E2測定データ
表16に表17から表21までのデータの筋肉中のE1,E2濃度をまとめた。まず、E1濃度については、未経産牛では2.3〜5.9pg/gであり、中間値は2.54pg/gである。子牛の未経産牛のデータでは0.91〜3.07pg/gであり、幼児期ほど、E1濃度は低い傾向にあった。部位別の濃度差は一般的には脂肪組織が高いがその他の組織ではかなりの変動が見られた。なお、妊娠牛ではE1濃度は極めて上昇しており、通常時の100倍近くまでなっている。組織内の濃度としては、やはり、脂肪組織が際立って高いがそれ以外は変動が見られ、脂肪組織>腎臓≧筋肉≧肝臓の状況であった。
E2濃度については、未経産牛では0.5〜34.9pg/gであり、中間値は5.80, 7.1pg/gであった。E1濃度に比べ、若干高い値であった。子牛の未経産牛のデータでは1.14〜9.51pg/gであり幼児期ほど、E2濃度は低い傾向にあった。未経産牛では子牛は成牛に比べ、E1同様に低めの値を示した。部位別の濃度差は未経産牛で脂肪組織で高い場合が多いが、妊娠時には腎臓>肝臓>脂肪組織>筋肉などの場合が多く見られ、これまでの傾向とは異なっていた。
表16 表17から表21より集計した各種雌牛筋肉部のE1,E2濃度
(day) | E1(pg/g) | E2(pg/g) | |
Heifers | 2.3,2.54,5.9 | 0.5,5.80,7.1,34.9 | |
Heifer Calves | 0.91〜3.07 | 1.14〜9.51 | |
Pregnant Heifers |
120 | 156 | 13.2 |
180 | 482 | 27.3 | |
240 | 528 | 32.7 | |
Pregnant Heifers |
188 | 110 | 14.6 |
243 | 458 | 44.9 | |
266 | 638 | 42.6 |
表17 子牛(雌牛)にSYNOVEX C and SYNOVEX H 埋め込み実験のコントロール
(FDA/CVM,NADA file 9-576) (pg/g)
Calves | day | Muscle | Fat | Kidney | Liver | |
Heifers (T16-19) |
61 | E1(n=5) | 0.91±0.20 | 3.88±1.87 | 0.83±0.17 | 0.64±0.10 |
E2(n=5) | 1.42±0.39 | 2.43±0.92 | 1.38±0.39 | 1.43±0.22 | ||
119 | E1(n=5) | 3.07±1.26 | 3.72±2.2 | 1.67±0.36 | 1.30±0.52 | |
E2(n=5) | 1.14±0.24 | 2.94±0.84 | 1.96±0.52 | 1.71±0.33 | ||
241 | E1(n=5) | 2.61±0.40 | 9.92±8.94 | 2.91±0.44 | 1.22±0.13 | |
E2(n=5) | 3.68±2.99 | 5.58±1.38 | 2.76±0.59 | 3.15±1.45 | ||
301 | E1(n=5) | 1.68±0.41 | 5.28±1.58 | 2.94±1.36 | 1.88±0.26 | |
E2(n=5) | 3.42±2.03 | 6.19±3.38 | 7.13±1.07 | 7.56±0.41 | ||
329 | E1(n=5) | 1.39±0.33 | 7.88±2.51 | 2.68±1.94 | 1.02±0.15 | |
E2(n=5) | 2.97±2.35 | 9.19±9.04 | 2.46±1.53 | 2.38±0.49 | ||
360 | E1(n=5) | 2.91±0.89 | 13.9±4.85 | 1.08±0.43 | 1.67±0.33 | |
E2(n=5) | 9.51±6.03 | 5.36±1.11 | 2.02±0.32 | 1.91±0.51 |
表18 未経産牛(未妊娠)にSYNOVEX H埋め込み実験のコントロール(400 lbs 以上)
(FDA/CVM,NADA files 9-576) (pg/g)
Tissues(n) | Muscle(15) | Fat(35) | Kidney(15) | Liver(10) | |
Heifers (T10) |
E1 | 2.54±1.12 | 10.9±5.94 | 1.42±0.56 | 1.7 ±1.15 |
E2 | 5.80±9.05 | 13.4±14.1 | 2.89±2.50 | 1.54±1.12 |
表19 未経産牛にHEIFER-oid 埋め込み実験のコントロール(n = 8)
(FDA/CVM,NADA file 110-315)(1982)
Heifers | Muscle | Fat | |
(T-28) | E2 | 34.9±15.8 | 96.1±38.7 |
表20 未経産牛にE2, trenbolone acetate埋め込み実験のコントロール(pg/g) (FDA/CVM,NADA file 140-992)
Heifers | Muscle | Fat | Kidney | Liver | |
(T-45b) | E2 | 0.5 | 0.1 | 17.0 | 0.0 |
表21 未経産牛にCOMPUDOSE 埋め込み実験のコントロール(pg/g)
Heifers (T-55) |
Muscle | Fat | Kidney | Liver | |
E1 | 5.9 | 5.3 | 6.5 | 7.5 | |
E2 | 7.1 | 5.6 | 8.5 | 8.2 |
表22 妊娠牛のバリデーション研究による測定(n = 1,pg/g)
Pregnant | (days) | Muscle | Fat | Kidney | Liver | |
Heifers |
188 |
E1 | 110 | 1,920 | 207 | 10.4 |
E2 | 14.6 | 55.6 | 280 | 81.7 | ||
243 |
E1 | 458 | 4,880 | 500 | 258 | |
E2 | 44.9 | 139 | 417 | 630 | ||
266 |
E1 | 638 | 5,330 | 602 | 584 | |
E2 | 42.6 | 131 | 484 | 1,590 |
表23 妊娠牛にSYNOVEX H 埋め込み実験のコントロール
(FDA/CVM,NADA file 11-427)
(pg/g)
Pregnant | days | Muscle | Fat | Kidney | Liver | |
Heifers |
120 (n=10) |
E1 | 156±79.3 | 1,283±885 | 85.3±69.4 | 18.2±15.2 |
E2 | 13.2±5.2 | 42.1±19.8 | 118±58.6 | 82.5±75.9 | ||
180 (n=11) |
E1 | 482±301 | 2,717±1.259 | 166±94.0 | 115±82.6 | |
E2 | 27.3±14.3 | 71.5±37.2 | 230±99.9 | 380±280 | ||
240 (n=4) |
E1 | 523±240 | 2,788±1,497 | 142±41.2 | 145±55.4 | |
E2 | 32.7±16.1 | 67.5±34.6 | 274±84.8 | 1,027±365 |
表24 未経産牛にSYNOVEX H埋め込み実験のコントロール(中間値)
(pg/g) (JECFA)
Heifers | (n) | Muscle(15) | Fat(35) | Kidney(15) | Liver(10) |
(T-48) | E1 | 2.3 | 10 | 1.4 | 1.4 |
(3)まとめ及び考察
以上、これまでの結果をまとめると、E1,およびE2濃度は雌牛の未経産牛で経産牛より高く、特に妊娠牛では通常のE1濃度の100倍に近い濃度まで上昇している。E2濃度についても10倍程度の上昇が見られた。一方、雄牛の未去勢牛は去勢牛に比べて、E1, E2濃度とも高い傾向を示した。このように、雌雄、去勢、未去勢、妊娠、未妊娠によりE1、E2濃度は大きく変動した。エストロゲン作用を評価する場合、化合物として、エストロン、エストラジオール-17β、エストラジオール-17α,さらにこれらのグルクロン酸、硫酸抱合体などがあり、特にエストロン(E1)の活性は表25に示したようにE2の1/2〜1/3程度を示している。エストロゲン作用を論ずる場合、これらのことを含めて評価する必要があると考える。
表25 エストロゲン類の効力比較
Estrogen | Relative uterotrophic potencies | |
Subcutaneous route | oral route | |
Estrone | 1.0 | 1.0 |
Estradiol-17β | 3.41 | 2.01 |
Estradiol-17α | 0.05 | 0.07 |
(2) 環境ホルモン対策事業による牛肉中のホルモン測定結果
平成10年度厚生科学研究費補助金(生活安全対策総合研究事業)の中の「内分泌かく乱物質の食品、食器等からの暴露に関する調査研究」のうちの、「畜水産食品中の内分泌かく乱作用化学物質残留実態調査」報告書をもとにして、牛肉中の天然ホルモン濃度、特にエストラジオール-17β濃度についてまとめた。今回開発した、測定法はRIAで検出限界は食肉組織中 1 pg/gであり、検出限界以下については、検出限界値の1/2、すなわち、0.5 pg/gを入力してデータ解析を実施した。
(1)国産及び輸入牛肉中のエストラジオール-17β(E2)濃度
国産牛肉60検体(和牛20検体、ホルスタイン種40検体、雌雄半々などの条件)、外国産牛肉40検体(米国、オーストラリア産それぞれ20検体、検体の詳細は不明)のE2濃度を測定した。表1のように、国産の牛肉中のE2(エストラジオール-17β)の濃度範囲は 1 >〜 12.8 pg/g、平均値と標準偏差は1.15 ± 1.87 pg/gであり、外国産牛肉中の濃度範囲は1 >〜 10.0 pg/g、平均値は3.33 ± 2.83 pg/gであった。この結果のように外国産が国内産に比較して、約3倍高い値を示した。なお、外国産のうち、米国産の平均濃度は3.56 ± 3.03 pg/g,オーストラリア産では3.11 ± 2.68 pg/gとほぼ同様な値を示した。
表1 国産及び輸入牛肉中のエストラジオール-17β(E2)濃度
試料数 | E2 濃度(pg/g) | |
外国産 | 40 | 3.33 ± 2.83(1 >〜 10.0 ) |
国内産 | 60 | 1.15 ± 1.87(1 >〜 12.8 ) |
(2)国内産牛肉の品種、性別による E2濃度
国内産牛肉の由来の牛についての品種(和牛、ホルスタイン)、雌雄、経産、未経産、去勢、未去勢別に分類した時のE2濃度を表2に示す。雌雄別のE2濃度の平均は、雌の牛肉では 1.51 ± 2.41(1 >〜12.8)pg/g 、雄の牛肉では 0.80 ± 1.01(1 >〜 5.8 )pg/gであり、約2倍程度雌で高い値を示した。なお、高い値としては雌の未経産牛で4.04 ± 2.85 pg/g(和牛)、雄の未去勢牛で5.8 pg/g(和牛)という結果で、いずれも若い牛で高い値を示した。品種別としてホルスタイン、和牛ではその差異は余りないようであるが、検体数が少ないなどの理由で、結論を出すのは無理と考えられた。
表2 国産牛肉の品種、性別による E2濃度
性 | 品種 | 数 | 脂肪(%) | E2濃度平均±標準偏差 (範囲,pg/g) |
|
雌 |
経産牛 |
ホルスタイン | 19 | 2.94 | 1.11 ± 0.99 (1>〜 3.9 ) |
和牛 | 5 | 9.86 | 0.68 ± 0.60 (1>〜 1.4 ) | ||
未経産 |
ホルスタイン | 1 | 12.6 | 1> | |
和牛 | 5 | 2.80 | 4.04 ± 2.85 (1>〜12.8 ) | ||
(30) (1.51 ± 2.41)(1>〜12.8 ) | |||||
雄 |
去勢 |
ホルスタイン | 19 | 12.57 | 0.66 ± 0.41 (1>〜 2.1 ) |
和牛 | 9 | 8.94 | 0.57 ± 0.20 (1>〜 1.1 ) | ||
未去勢 |
ホルスタイン | 1 | 7.1 | 1> | |
和牛 | 1 | 2.6 | 5.8 | ||
(30) (0.80 ± 1.01)(1>〜 5.8 ) |
(3)国産雌牛肉の性周期とE2濃度
雌の牛肉試料についは同じ牛の卵巣を同時に採取し、その性周期について調査して、ホルモン濃度との相関を調査した。表3に示したように、E2濃度は黄体期で平均 0.87±0.66 pg/g、卵胞期で 4.05±5.90 pg/g 、卵胞期の排卵直後で1.58±2.05 pg/gであり、卵胞期では黄体期の約5倍程度高い値を示した。なお、卵胞期の排卵直前ではE2濃度は減少し、黄体期の約2倍程度となっている。卵胞期で高い値を示すことは、血液や乳では解明されており、筋肉中の濃度もこれと同様に連動することが推測された。
表3 国産雌牛肉の性周期とE2濃度性周期 | 試料数 | E2 濃度(平均±標準偏差、範囲pg/g) |
黄体期 |
17 |
0.87 ± 0.66 (1 >〜 2.6 ) |
卵胞期 |
4 |
4.05 ± 5.90 (1 >〜 12.8 ) |
卵胞期(排卵直後) |
5 |
1.58 ± 2.05 (1 >〜 5.2 ) |
(4)まとめ及び考察
以上の測定結果及び前章のFDAのデータから考察を加えてみたい。牛肉中のE2濃度は外国産と国内産の値ともFDAの値と単純に比較して、特に高いというものではなかった。なお、外国産の牛肉は国内産に比較して3倍程度E2濃度が高かった原因として、米国およびオーストラリアでは肥育牛にこれらのホルモン剤が使用されており、一方、我が国では使用実態はないという現状が考えられる。しかし、これが原因と短絡的に決めるのには無理があると考える。国内産については種、雌雄別など、考慮して試料採取に当たったが、外国産については全く試料についての情報が得られていない。また、試料数についても特に多いとは言えない状況があり、結論をだすためには今後のデータの積み重ねがどうしても必要である。
今回は牛肉中のエストロゲンとしてはE2の測定のみであったが、エストロゲン作用を有するエストロン(E1)、エストラジオール-17α,さらにE2を含めたこれらのグルクロン酸、硫酸抱合体など等についても、今後、測定について検討する必要がある。
文献
(1) D.Arnold.:Hormones, Revised working paper on residues(26.02.99)
(2) 平成10年度厚生科学研究費補助金(生活安全対策総合研究事業)「内分泌かく乱物質の食品、食器等からの暴露に関する調査研究」「畜水産食品中の内分泌かく乱作用化学物質残留実態調査」報告書(1999.4)
(3)ホルモン分析法の現状
牛組織である筋肉、脂肪、肝臓、腎臓中のエストラジオール-17β(E2)などを測定する方法として、ラジオイムノアッセイ(RIA)が用いられてきた。しかし、米国とEUとのホルモン論争の中で、EUはRIAの低濃度の測定の信頼性に関して問題を提起している。ところで、近年、脚光を浴びている内分泌かく乱化学物質の検出の発展に伴って、酵母を用いた血漿中のエストラジオール-17β(E2)測定法が開発され、その測定感度はRIAの100倍であると報告された。このような状況下、本報告では、E2についての測定法をこの6年間に渡って、Chemical Abstractsより検索し、まとめた。その主な測定法の分類を表1に示す。また、主な文献リストは最後の項に掲載した。E2などエストロゲンについての測定法として測定原理から、主に1)エストロゲンレセプターへの結合能を利用する方法、2)抗原抗体反応を利用する方法、3)分析機器を利用する方法等に分類できる。
エストロゲンレセプター利用法については次の項で紹介することとする。
抗原抗体反応を利用する方法としてはRIA、エンザイムイムノアッセイ(ELISA,EIA)等があるが、年々改良が加えられ、感度等も上昇している。高感度測定法として、RIAによる測定例が最も多い。高感度な分析機器による方法として、GC/MS,LC/MSなどがある。GC/MSはトリメチルシリル化など誘導体化操作が必要であり、ホルモン剤の分析としては測定例が報告されている。最近、LC/MS,特にLC/MS/MSの技法は発展してきたので期待がもたれる。現在のところはGC/MSと同程度の感度であるので、RIAの感度には遠く及ばない。しかし、確認手段としての可能性はあると考える。
表1 エストロゲン類の高感度分析法の比較
No. | 方法 | 感度 | 原理、試料、長所短所など | 主な文献 |
1 |
酵母法 ・YES ・RCBA ・Two hyb- rid yeast assay |
0.02 (pg/ml) (ppt)
|
血清中のエストロゲン類の検出限界。
(RCBAは別紙で紹介) Two hybrid yeast assay はわが国のみで多用されている。 |
・Environ Health Perspect, 104, 544- 8('96), ・J Clin Invest 94,2475-80 (' 94) ・Toxicol Appl Pharacol,15 4,76- 83('99) |
2 | 培養細胞 E-screen |
14pgEEQ/L(ppt) | MCF-7細胞を使用 | ・Sci.Total Environ, 225 (1 2), 33-43('99) |
3 | Receptor binding assay | 5nM(1. 36μg), | Beacon 2000(Fluorescence polarization) | ・Environ .Health Perspect. 106, 551- 7('98) |
4 | RIA | 6pg/ml 5 pg/ml 0.1pg/ml |
血漿中、ultrasensitive method 血清中10-20pg/mlから2-10pg/mlへ 感度アップ(チューブ固定法)。 血漿中、エーテル抽出法 |
・Int J.Biol. Markers,12(3), 102-5('97) ・J Clin Endocrinol Metab, 74, 571-6('92) |
5 | EIA(ELISA) | 38pg/ml ( 25 pg /well |
UV照射,モノクロナール抗体反応 牛の血清中の濃度。エストロンとは100%交差反応 |
・Anal.Chem. 21(5)1002-8 ('99) ・J.Reprod.Dev.43(5) J9-14 ('97) |
6 | CLIA | 100-1400 ng/L (ppt) | Chemiluminesencese Immunoassay。RI Aに比較し、感度は若干低いが安定は高い(70-1000ng/L)。
|
・Clin.Lab. 43(10),863-874 ('97) |
7 | LC-MS LC-MS/MS |
1ng/L (ppt) 30pg/ml |
水試料を予め濃縮して測定。 牛の血清中の定量限界。 (LC-APCI-MS-MS測定) |
・F'.J.Anal.Chem., 363,767-70('99) |
8 | GC-MS GC-MS/MS |
20-100ng/kg (ppt) |
食肉試料、抽出、精製、シリル化後SIM。 | Analyst,123(12),2605-9 ('98) |
9 | CALUX | 6pM(1.6 ng), | Chemical activated luciferase gene expression (CALUX) assay | J.Chromatogr.,B,70,4(1,2), 105-117('97) |
(3)−2エストロゲンレセプターを応用したエストロゲン作用物質の検出法
エストロゲン類のエストロゲンレセプターを応用した検出法として、下記に示したように主に3種の方法がある。
(1) 受容体結合試験
蛍光偏光度測定システム(Full-Range Beacon 2000 System:PanVera Corp.)を用いたエストロゲン受容体結合活性測定キットが市販されている。
我が国では宝酒造(株)で販売しており、環境庁、通産省などで使用が増加している。
FP Screen-for-Cmpetitors Kit, ER-α, high sensitivity
(2) 酵母を用いた試験
受容体遺伝子(receptor)を組み込んだプラスミドと応答領域遺伝子及びレポーター遺伝子を組み込んだプラスミドを酵母に入れたもの。
・YES: Yeast Estrogen Screen
・RCBA:Recombinant Cell Yeast Bioassay(Klein、Coldhamら) 0.02 pg/ml
・Two Hybrid Assay:Nishikawa ら(日本), Sumpterらの方法がある。
(3) 培養細胞を用いた試験
受容体遺伝子(receptor)を組み込んだプラスミドと応答領域遺伝子及びレポーター遺伝子を組み込んだプラスミドを培養細胞に入れたもの。
培養細胞:MCF-7(ヒト乳ガン由来の培養細胞株)、HeLa(ヒト子宮頸ガン由来の上皮細胞株)、HepG2(ヒト肝ガン由来の培養細胞株)
3−2)細胞増殖を指標とする方法
培養細胞:MCF-7(ヒト乳ガン由来の培養細胞株)、MDA-MB-453(ヒト乳ガン由来の培養細胞株)、LNCap(ヒト前立腺ガン由来の培養細胞株)
・ E-Screen: MCF-7: Sotoら
これら3種の方法の主な長所、短所は以下の通りである。
1) 受容体結合試験:蛍光偏光度測定システム(Full-Range Beacon 2000
System:Pan Vera Corp.)はタカラ(宝酒造(株))から装置及びキットを販売されており、高感度で迅速に測定が可能であるが、装置及びキットが高価な点が短所である。
2) 酵母を用いた試験:酵母には細胞壁があって化学物質の透過性が悪いことから、化合物によっては感度が若干低下することがある。しかし、酵母の維持は培養細胞より容易で、コスト的に培養細胞より安価である。
3) 培養細胞を用いた試験:培養細胞系では通常牛胎仔血清あるいはヒト血清を添加するため、すでに血液中に含まれている性ステロイドホルモンなどの存在を考慮する必要があり、低濃度の定量性には問題がある。
以上、いずれの方法も、エストロゲンレセプターと結合する物質、すなわち、化学構造の近いものは陽性となる。そして、その構造の違いにより検出感度が異なり、原理的にエストラジオール−17β(E2)のみが検出される訳ではない。例として、合成ホルモンのDESはE2と同じ程度か、それ以上の活性を持つ場合が多い。天然のイソフラボン類も陽性を示す。
牛肉組織中のE2を測定するための応用としては、1),2)の方法の可能性があるが未だ報告は見当たらない。なお、2)の酵母法の応用例の1つであるRCBAによりヒト及び牛血漿中のエストロゲン類を測定例があり、牛組織中E2への応用が期待される。なお、RCBAについては次項で議論する。
(3) −3 RCBA(Recombinant Yeast Cell Bioassay):酵母を用いたエストロゲンの測定法
今回のエストロゲン類の測定法で最も高感度な測定法として注目を浴びている方法でその評価が問題となっている。文献としては以下の5報が論議の中心である。
(1)RCBAの検出限界等について
文献(1)のkleinの報告によると、標準血漿にE2を加えた場合の測定濃度範囲は3桁、測定感度は< 0.02 pg/mlであり、このように感度はRIAに比較して、2桁(100倍)程良い。その測定精度(バラツキ)は 2 pg/ml (CV:15%)、pg/ml(CV:〜50%)であり、選択性(交差反応)としてはE2を100%として、Estrone:0.3 %, DES:<3 %, Estriol 0.03 %,Estrogen metabolite (sulfate, glucuronide):<2 %であった。なお、文献(3)のColdhamらによる報告では、交差反応はこれより大きく。17β-EST(E2)を100として、E2-17α 5.25, Ethinyl estradiol(E2E2) 88.8, diethylstylbestrol(DES) 74.3 hexestrol(HES) 30.6,Dienestol(DIS) 25.4, Coumestrol 0.67, Genestein などであった。本法は15pg/ml以上の濃度でRIAとの相関係数は90(p<0.001)(40人の女性血清)と高く、測定値はRCBAがやや高めの値を示した。なお、Kleinの文献(2)ではRCBA,RIAの相関係数は0.79(p<0.01, n=14)であった。
(2)ヒト、牛血漿などにおけるRCBA,RIA測定結果の相違
測定例として、文献(1)の思春期前の男子、女子の血漿中のE2濃度をRCBAとRIAにより比較したところ、表2に示すように RCBAによる測定値はRIAに比較し、極めて低い値を示した。RCBA,及びRIAによる高い濃度では相関性あるが、低濃度領域ではRIAに比較して極めて低い値であった。同じ、Kleinによる文献(2)では表3に示したように女性乳ガン患者の血清中のレベルについて薬剤投与(Letrozole)による変化を追跡しているが、RCBA測定値はRIAによるものと比較して23%の値と低かった。
表2 思春期前の男子、女子の血清中のエストロゲン濃度
男子 | 女子 | |
RCBA | 0.08 pg/ml | 0.6 pg/ml |
RIA | 7.5 pg/ml | 〜 8 pg/ml |
表3 女性乳ガン患者の血清中のエストロゲンレベル(薬剤投与後の変化)
baseline | week-6 | week-12 (pmol/L) | |
RCBA | 7.2 ± 1.9 | 0.26 ± 0.11 | 0.48 ± 0.18 |
RIA | 22.0 ± 5.1 | 2.54 ± 0.41 | 2.1 ± 0.33 |
この相違する理由として、1) RIAは低濃度でブランク、交差反応があるためである。2) 血清中に低濃度の場合、RCBAの反応を妨害する物質がある可能性がある。などが議論されているが未だ、明快な結論は出されていない。
文献(3)によれば文献(1)のKleinによる牛血漿から抽出の際、血漿:エーテル比率を(1:1)では回収率は20.6±7.3 %であったという。これをエーテル比率を1:6に上昇させることで、回収率は97.1±0.7 %(n=3)に上昇したという。
文献(4)によるラジオアイソトープを利用した実験によれば各操作の回収率は表4のように、エーテル抽出操作、150μlエーテル溶解操作は回収率が良好であったが、培地への溶解の回収率が31.4±4.5%という低い結果であった。また、雌牛血漿中のE2を測定する際、Helix pomatia を作用させ、抱合体を加水分解した後にRCBAにより測定すると、RIAの値及び濃度パターンに近づいたという。しかしながら、RCBA,RIAの信頼度については未だ結論はでていないのが現状と考える。
表4 各操作におけるE2の回収率
エーテル抽出操作(1:6法) | 97.1 ± 0.7 % |
150μLx2エーテル溶解 | 86.1 ± 0.6 % |
Mininal培地へ溶解 | 31.4 ± 4.5 % |
(3) 相違の原因についての意見
文献(5)の英国のレポートにはRCBAとRIAのデータの相違についての様々な意見が掲載されているので参照されたい。いずれにしても結論は今後の展開に待つしかないと考える。
(4) 今後の考察
今後、この相違の原因は明らかにされるであろうが、現在はRCBA法とRIAの新たな報告を待つか、自ら証明するしかない。今後、最終的には理化学的な手法であるGC-MS/MS, LC-MS/MSなど、の情報量の多い方法を用いて確認する必要があると考える。しかし、現在のところ、この濃度で測定できる機器及び方法は報告されていないのが現状である。
(参考文献)
エストロゲン類検出法等の主な文献リスト
[RCBA]
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