平成１１年度研究報告
分担研究者：菅野純 （国立医薬品食品衛生研究所）
研究協力者：伊藤明弘（広島大学原爆放射能医学研究所）
１．はじめに
エストロゲンの生物学的影響は、便宜上、生理的作用と有害効果の二つに大別して考えることが出来る。エストラジオール−17β（E2）の胎児期及び出生前後での生理的作用としては、性の分化、脳の発達、性腺機能の決定など器官形成とそれらの機能発現に重要な役割を演じていることが挙げられる。これらの機構を発現するためには、母胎、胎児、性腺、副腎、脳などで合成されるステロイドが10-12g/ml前後の濃度で機能を発揮すると考えられる。これは、E2依存性培養細胞を用いた研究において10-12〜10-9g/mlの範囲で細胞増殖活性を示すことからも支持される。これに対し、従来の毒性評価法により検出されている有害効果は、本報告書全体の科学的知見の中に詳述されている発がん性、遺伝毒性、生殖毒性、催奇形性などに当たるが、これらの効果は、E2の血中濃度がほぼ10-9g/ml以上で認められている。
２．エストラジオール−17β（E2）の代謝と作用発現
エストラジオール−17β（E2）は18個のcarbonを有し、ヒトや多くの哺乳類に対し最も強力な天然型エストロゲンである。卵胞より分泌され、細胞の分化、増殖に影響し、エストロジェン受容体α（ERα）、β（ERβ）と結合して、その効果を示すことが知られている。これら受容体蛋白はαα或いはββ（αβも少なくとも試験管内では形成される）の２量体を形成し、その乖離係数は0.1〜1.0nMにある。芳香性A−環と３−OHがリガンド結合活性をもち、受容体の活性化を行う最も重要な部位である。E2の代謝産物の多くはERαとの結合能を大幅に減弱しているが、2-OH-E2、4-OH-E2体はE2に比べてそれぞれ100と150％のERαとの結合能を有している。
薬理代謝：牛にE2を投与する場合、estradiol benzoateとして耳の皮下部分に投与する。これらは体内で直ちにE2に変換され、内因性E2と区別出来なくなる。血中E2の増加に伴い、下垂体より成長ホルモン(GH)の分泌が増加する。体内での代謝物として、筋肉内でその多くは17α-E2として、或いはE1として存在する。脂肪組織内でもほぼ同様の結果が得られている。肝、腎での代謝産物が最も多く、それらは17α-E2、17α-E2グルクロナイド、E2、E1などである。ヒトの体内で見いだされている2-OH、4-OH、16α-OH-E2などは牛との共通代謝産物と考えられているが、未だに定量的デ−タは報告されていない。
ヒトの体内ではC-1，C-2，C-3、C-4，C-6，C-7，C-11、C-14、C-15、C-16，C-18のcarbonを含んだ部位で酸化反応が起こる。血中や尿中で最も多く見いだされるのは2−水酸化代謝産物である。肝はエストロゲン代謝の中心臓器であり、P4501A2、P4503A3、P4503A4などにより2-α、16-αの水酸化が行われる。4−水酸化物は、少量しか代謝されないが、E2バランスの重要な役割を占めている。肉や肉製品にかかわるE1、エストラジオール−17βの吸収、分解、排泄に関する情報は全く示されていない。2mg経口投与された17β-E2の20%は吸収され、血中半減期は2〜16時間とされている。
３．E2の細胞内動態とそのメカニズム
（１）受容体を介するシステム
ジェンセン、ジャコブソンらにより1960年代に発表されたトリチウム標識E2の子宮内膜でのオ−トラジオグラフィ−によって標的細胞におけるE2の局在性が検出され、その所見が、ER受容体研究の幕開けとなった。その後、ERの存在をめぐって、下垂体、肝、乳腺、子宮などで生化学的、形態学的研究が発表され、細胞質内あるいは核内受容体として認識されるようになった。このように、従来より知られていたペプタイドホルモンなどの細胞膜受容体と異なった存在様式が示されたが、それはステロイドホルモンが脂溶性であるため細胞膜のリン脂質を介して容易に膜を通過する事からも支持されている。現在では核内受容体の分子構造の決定とcloningが行われ、その遺伝子配列も明らかにされている。その結果、E2受容体は他のステロイドホルモンであるprogesterone, glucocorticoid hormoneなどの受容体と共通のDNA結合ドメインを有し、生物学的結合部位が各ホルモン特有の遺伝子構造を有することも明らかとされた。
図１．核受容体ス−パ−ファミリ−のドメイン構造
| A/B | C | D | E | F |
受容体ス−パ−ファミリ−の分子構造は、アミノ酸配列の相関性と機能から６つのドメイン（A-F）に区分される（図１）。A/B domain は各々ステロイドホルモンのアミノ酸配列が最も異なる部位で、転写活性化（AF-1）や細胞特異的効果の発現にあずかる。C domainは塩基配列を認識し、標的遺伝子への特異的な結合にあずかり、受容体の2量体形式反応にも関与する。D domainは蝶番（hinge）構造をとり、高次構造の変換部位となる。甲状腺ホルモン受容体(TR)やレチノイン酸受容体（RAR, RXR）では転写抑制にもあづかる。E/F domainはリガンドとの結合、2量体の形成（homo-dimer）、転写制御（AF-2）、そして核内移行と多機能性領域を構成する。受容体はホルモン分子の100倍の大きさを有することも明らかとなった。
（２）受容体を介さない影響
先に触れた如く、ステロイドホルモンはステロイド環を骨格の中心にもち、水溶性ペプチドホルモンと異なって、脂溶性である。血中にあっては、その多くはserum globulin binding protein (SGBP)及びアルブミンと結合した状態で存在し、10%以下がfree のestrogenとして存在することが明らかにされている。その標的臓器は、脳、肝などの主要臓器、ほとんどの内分泌系臓器、あるいは皮膚などであるが、その全貌は未だ明らかにされていない。（１）で述べた受容体を介したシグナル伝達は、ホルモン作用発現の機序としては、充分説明可能であるが、E2の有する細胞障害性、変異原性など生体に対する有害影響のメカニズムについては十分なが説明されていない。E2やその水酸化代謝物によるDNA adductの形成、Free radical の発生などは受容体を介さず、直接細胞構成生体分子との結合によりもたらされると考えられる。
以前はDESと異なりE2自身のgenotoxicityやmutagenicityは推測の域を出ていなかった。しかし、近年の多くの分子生物学的手法の導入により、例えば腫瘍化の一つの指標であるmicrosatellite instability、更には水酸化E2による乳腺でのDNA付加体の形成、細胞質内微小管の変性の誘導、DNAのsingle strand切断などの現象が明らかとなり、少数の動物実験のデ−タと併せ考えると、現在ではE2がイニシエーション及びプロモ−ションの両面の作用を有していると考えられる。
４．受容体の分子生物学
ジェンセンとゴルスキ−は、受容体の存在が示唆された10年後に始めて実験的に受容体の構造を明らかにした。その最初のものは、17β-estradiolに対する受容体であり、続いてテストステロン、プロゲステロン、グルコ・コルチコイド、甲状腺ホルモン、ビタミンD、レチノイドなどであり、これらは核内受容体のファミリーを構成していた。続いて、これらの核受容体の生理的制御を行うco-regulators（共役因子群）の存在が明らかとなった。
遺伝子操作手技の発達に伴い、ステロイドレセプター・ス−パ−ファミリ−遺伝子に対する改変導入実験が行われ、受容体欠失動物による機能解析が行われるに至った。最初にエストロジェン受容体欠失マウスが作製されたとき、エストロゲン受容体は、エストロゲン標的組織において広く分布してその生物活性のfirst messengerの役割を果たす唯一の分子であるとして認識されていため、ホモ欠失個体は生まれてこないものと予想されていた。しかし、予想に反し、成獣にまで生育するホモ欠失個体が得られた（不妊ではあるが）。1996年に至り、複数の研究室より第二のER受容体の存在が示され、その結果、古典的ERがERα, 新規のERがERβと呼ばれることとなった。
ERαは約９つのエクソンから成る約6.3kbの転写産物であり、マウスの場合599個のアミノ酸配列よりなる66kDaの分子量を有する。
ヒト、ラットではややアミノ酸数が異なっている。マウスではchr#10に存在し、ヒトではchr#6に存在する。これらERαは多くの組織や細胞で変異株がみられており、腫瘍組織では突然変異種も観察されている。
一方、ERβは485のアミノ酸より成り、約54kDaの分子量を有するものでERαよりやや小さい構造を示している。その差はN-末の部位のアミノ酸構造がやや小さくなっていることによる。ERα欠失マウス、ERβ欠失マウスおよびERα ERβ重複欠失マウスが作出されている。
５．エストロゲンα、β受容体の遺伝子操作での所見
表１にERα欠失(ERKO)及びERβ欠失(BERKO)マウスの主な表現型を示した（Endocrine Rev. 20:358-417, 1999）。
ERKOは1.8kbのNeo遺伝子をERα遺伝子のexon2に導入したものであり、同じく1.8kbのNeo遺伝子をERβ遺伝子のexon3に入れたものがBERKOマウスである。ERα、ERβの発現をRT-PCRで観察すると、ERαは、卵巣、子宮、乳腺、下垂体、肝、皮膚、筋肉、精巣、副精巣に強発現し、卵管、視床下部、心、血管、肺、腎などに中〜弱発現している。一方、ERβは、副精巣で強発現する以外は、子宮、視床下部、副腎皮質、肺、精巣、前立腺で少量発現している。
ERKOで最も注目された現象は、ホモ欠失マウスが生まれてきたということである。E2が性の分化、脳をはじめ各臓器の機能的な分化に重要な役割を果たしていることを考えると、ERKOマウスでは胎児や新生児の致死が想定されたが、結果は野生型と同じくほとんど正常に産まれ、生育する事が観察された。また、ERKOマウスは、性腺でのステロイドの合成能を有していた。
雌性生殖器：子宮重量はERKOで減、BERKOで軽度減、子宮内腔、膣上皮いずれもERKOで高度の増殖低下、BERKOでは軽度低下。卵巣では、ERKOで黄体の欠如と出血卵胞がみられる特徴がある。BERKOではこれらの変化はみられないが成熟卵胞からの排卵障害がみられ、リッターサイズが低下する。血中のE2やtestosterone値は、ERKOマウスで野生型に比べ、雌では高度に、雄では軽度に上昇している。
乳腺：乳腺の原基は新生児期に既に配置されているが、その増殖・分化の発達は思春期前後に種々のホルモンの影響下で開始される。ERKOマウス乳腺は、その思春期前後に達しても新生児期のままの乳腺の構造を保っている。即ち、性成熟に伴う発育・分化・増殖という状態を欠いている。このことは、ERαの欠如に伴い、その下流にある種々の増殖関連遺伝子の活化が起こらない結果として考えられる。BERKOマウスでは、ほぼ正常の乳腺分化を示すことが報告されている。
Wnt-1マウスモデルを用いた乳癌発生におけるERαの役割 （Cancer Res 1999 , 59:1869-76）：Wnt-1マウスはMMTV-Wnt-1トランスジェニックマウスの略で、高率に乳癌を発生するモデルとして知られている。即ち、雌では１年以内に100%、雄でも15%に乳癌或いは乳腺の過形成が自然発生する。このWnt-1マウスの野生型とERKOのマウスを交配し、ERαを欠いたマウスに於けるWnt-1遺伝子の影響を検討した。ERαを欠いたマウスでは乳癌の発生が高度に遅れて発生することが明らかとなった。このことは、Wnt-1による乳癌発生にはERαは不要であるが、発生母地のサイズあるいは発がん促進過程にERαが関与していることを示唆している。
６．E2により誘導される増殖因子
E2により誘導、増幅される遺伝子群にはc-fos, c-jun, c-mycなどが、核内に分布する増殖因子として、また、EGF、IGFなどが膜結合型増殖因子として知られている。臓器特異的なものとしては、下垂体のpit-1/GHF-1、プロラクチン、オキシトシン、等があり、また、乳腺、前立腺などでも特有の増殖因子が挙げられている（表２）。
７．考察と結論
E2の生体への作用は以上の如く、受容体を介するシステムと受容体を介さないシステムの二大メカニズムが明らかにされている。これらの系を通じてエストロゲン及びエストロジェン様化学物質は生体に対し種々の作用を発揮する事も分子生物学や生物学の発展で明らかとなった。そして、生体側からみると、その作用は理論的には、生理的作用、あるいは可逆的な作用の範囲に収まるものと、生体に有害効果を起こす場合とに分けることが出来る。この両者は用量の立場からは連続した事象であることが想定され、その境界を明確に示すことは、現在のところ困難である。
参考文献
1. Assessment of potential risks to human health from hormone residues in bouine meat and meat products. Opinion of The Scientific Committee on Veterinary Measures Relating to Public Health, 30 April. 1999.
2. ホルモンの分子生物学 序説. 日本比較内分泌学会編, 学会出版センタ−, 1996.
3. Bocchinfuso WP and Korach KS: Mammary gland development and tumorigenesis in estrogen receptor knockout mice. J Mammary Gland Biology Neoplasia 2, 323-334, 1997.
4. Bocchinfuso WP, Hively WP, Couse JF, Varmus HE and Korach KS: A mouse mammary tumor virus-Wnt-1 transgene induced mammary gland hyperplasia and tumorigenesis in mice lacking estrogen receptoer-α. Cancer Res 59, 1869-1876, 1999.
5. Couse JF, Lindzey J, Grandien K, Gustafsson J-A and Korach KS: Tissue distribution and quantitative analysis of estrogen receptor-α (ERα) and estrogen receptor-β (ERβ) messenger ribonucleic acid in the wild-type and ERα-knockout mouse. Endocrinology 138: 4613-4621, 1997.
6. Couse JF, Korach KS. Estrogen receptor null mice; what have we learned and where will they lead us? Endocrine Review 20, 358-417, 1999.
7. Curtis SW, Washburn T, Sewall C, DiAugustine R, Lindzey J, Couse JF and Korach KS: Physiological coupling of growth factor and steroid receptor signaling pathways: Estrogen receptor knockout mice lack estrogen-like response to epidermal growth factor. Proc Natl Acad Sci USA 93, 12626-12630, 1996.
8. Das SK, Taylor JA, Korach KS, Paria BC, Dey SK and Lubahn DB: Estrogenic responses in estrogen receptor-α deficient mice reveal a distinct estrogen signaling pathway. Proc Natl Acad Sci USA 94, 12786-12791, 1997.
9. Eddy EM, Washburn TF, Bunch DO, Goulding EH, Gladen BC, Lubahn DB and Korach KS: Targeted disruption of the estrogen receptor gene in male mice causes alteration of spermatogenesis and infertility. Endocrinology 137, 4796-4805, 1996.
10. Hanstein B, Liu H, Yancisin MC and Brown M: Functional analysis of a novel estrogen receptor-β isoform. Molecular Endocrinology 13, 129-137, 1999.
11. Iafrati MD, Karas RH, Aronovitz M, Kim S, Sulivan TR, Lubahn DB, O'Donnell TF Jr., Korach KS and Mendelsohn ME: Estrogen inhibits the vascular injury response in estrogen receptor α-deficient mice. Nature Medicine 3, 545-548, 1997.
12. Gu Q, Korach KS and Moss RL: Rapid action of 17β-estradiol on kainate-induced currents in hippocampal neurons lacking intracellular estrogen receptors. Endocrinology 140, 660-666, 1999.
13. Lubahn DB, Moyer JS, Golding TS, Couse JF, Korach KS and Smithies O: Alteration of reproductive function but not prenatal sexual development after insertional disruption of the mouse estrogen receptor gene. Proc Natl Acad Sci USA 90, 11162-11166, 1993.
14. Ogawa S, Lubahn DB, Korach KS and Pfaff DW: Behavioral effects of estrogen receptor gene disruption in male mice. Proc Natl Acad Sci USA 94, 1476-1481, 1997.
15. Ogawa S, Eng V, Taylor J, Lubahn DB, Korach KS and Pfaff DW: Roles of estrogen receptor-α gene expression in reproduction-related behaviors in female mice. Endocrinology 139, 5070-5081, 1998.
16. Rissman EF, Early AH, Taylor JA, Korach KS and Lubahn DB: Estrogen receptors are essential for female sexual receptivity. Endocrinology 138, 507-510, 1997.
17. Schomberg DW, Couse JF, Mukherjee A, Lubahn DB, Sar M, Mayo KE and Korach KS: Targeted disruption of the estrogen receptor-α gene in female mice: Characterization of ovarian responses and phenotype in the adult. Endocrinology 140, 2733-2744, 1999.
18. Schreihofer DA, Resnick EM, Soh AY and Shupnik MA: Transcriptional regulation by a naturally occurring truncated rat estrogen receptor (ER), truncated ER product-1 (TERP-1). Molecular Endocrinology 13, 320-329, 1999.
19. Scully KM, Gleiberman AS, Lindzey J, Lubahn DB, Korach KS and Rosenfeld MG: Role of estrogen receptor-α in the anterior pituitary gland. Endocrinology 11, 674-681, 1997.
20. Smithson G, Couse JF, Lubahn DB, Korach KS and Kincade PW: The role of estrogen receptors and androgen receptors in sex steroid regulation of B lymphopoiesis. J Immunol 161, 27-34, 1998.
21. Sudhir K, Chou TM, Messina LM, Hutchison SJ, Korach KS, Chatterjee K, Rubanyi GM: Endothelial dysfunction in a man with disruptive mutation in oestrogen-receptor gene. Lancet 349, 1146-1147, 1997.
22. Sudhir K, Chou TM, Chatterjee K, Smith EP, Williams TC, Kane JP, Malloy MJ, Korach KS and Rubanyi GM: Premature coronary artery disease associated with a disruptive mutation in the estrogen receptor gene in a man. Circulation 96, 3774-3777, 1997.
23. Wang W, Dong L, Saville B and Safe S: Transcriptional activation of E2F1 gene expression by 17β-estradiol in MCF-7 cells is regulated by NF-Y-Sp1/estrogen receptor interactions. Molecular Endocrinology 13, 1373-1387, 1999.
24. Wersinger SR, Sannen K, Villalba C, Lubahn DB, Rissman EF and De Vriest GJ: Masculine sexual behavior is disrupted in male and female mice lacking a functional estrogen receptor α gene. Horm Behav 32, 176-183, 1997.
25. Young LJ, Wang Z, Donaldson R and Rissman EF: Estrogen receptor α is essential for induction of oxytocin receptor by estrogen. Neuroendocrinology 9, 933-936, 1998.
26. Zou A, Marschke KB, Arnold KE, Berger EM, Fitzgerald P, Mais DE and Allegretto EA: Estrogen receptor β activates the human retinoic acid receptor α-1 promoter in response to tamoxifen and other estrogen receptor antagonists, but not in response to estrogen. Molecular Endocrinology 13, 418-430, 1999.
平成１１年度研究報告
分担研究者：藤森観之助（国立医薬品食品衛生研究所）
研究協力者：渡辺 民朗（岩手県立大学）
１ エストラジオール−17βの代謝
（１） ヒトでの代謝
エストロゲンの代謝は非妊娠時と妊娠時で若干異なる。非妊娠時ではエストラジオール−17β(E2-17β)はいったんエストロン（E1)となり、E1が16位の水酸化を受けて16α-hydroxy-estroneとなり、次いで17-ketoneが還元されてエストリオール(E3)となる。妊娠時での母体のE3は胎児副腎由来dehydro-epi-androsteroneが胎児・胎盤系で16α水酸化され生じた16-hydroxy-dehydro-epi-androsteroneが胎盤で代謝されて出来たE3が主である。E1とE2-17β間には相互可逆的変化が自由に行われる(Ryan & Engel, 1953)。E1とE2-17βの相互転換を行うestradiol-17β-ol-dehydrogenaseは肝の他に赤血球にも存在する(Jacobsohn et al., 1975)。主代謝経路はE2-17βから estradiol-17-glucuronide(E2-17G)に至る経路とE1からSteroid 16α-hydroxylaseにより16α-hydroxy-estroneとなり、さらにE3を経てestriol-16Gとなる経路であるが、E2-17βから直接Estradiol 16α-monooxygenaseによりE3になる経路もある。エストロゲンは肝において広範な代謝を受ける。ヒト血中に存在するエストロゲンは主としてE1とE2-17βであり、E1の約９０%はC-3に硫酸が抱合(E1-3S)している。E1-3Sは15α-hydroxy-estrone-3-sulfate-15-N-acetylglucosaminideなどへ代謝される。E2-17βの一部は主に17位グルクロナイド抱合体として、一部は遊離体、一部は血清蛋白(steroid binding β-globulin)などとの結合体として血中に存在する。E1およびE3も一部は蛋白結合体として血中に存在する。E1からエストラジオール-17α(E2-17α)への転換は草食動物では一般的であるが、ヒトでは一般には認められない。ヒトにE2-17αを与えるとグルクロナイド抱合体として排泄される。（ヒトでの代謝経路図:本庄英雄1979）
（２） ウシでの代謝
文献（１：Ivie, G. W. et al., 1986）ウシに14C-Estradiol-17βを筋肉内投与すると、１１日までに尿中に４２％排泄し、内訳はE2-17αが8 - 18 %、E2-17βグルクロナイドが73 - 82 %、E1が2 %、estrone-βグルクロナイドが5 - 6 %であった。糞中には５８％排泄し、内訳はE2-17βとして9 - 13 %、E2-17αとして62 - 67 %、E1として12 - 14 %、尿糞中にはE3は同定できていない。
文献（２：Hoffmann, G. et al., 1997）妊娠中のウシの尿糞中の内因性エストロゲンのHPLCで測定した結果では、糞中の主代謝物は遊離のE2-17α(57%)、遊離のE2-17β（32 %）、遊離のE1 (11 %)であり、抱合体は検出されていない。尿中主代謝物はE1硫酸抱合体、次いでE2-17αグルクロナイド、E2-17βグルクロナイドであり、E2-17α硫酸抱合体およびE2-17β硫酸抱合体は痕跡程度である。
（３） ブタでの代謝
文献（Bottoms, G.D. et al. 1977）ブタに14C-Estradiol-17βを経口投与し、0.13 - 4時間以内に採血した静脈血の血漿中放射活性は用量に関係なく、ほとんどが抱合体であり、TLCで検討すると、そのうち８２-９１％がモノグルクロナイド抱合体で、５-１０％がモノ硫酸抱合体であった。モノグルクロナイド抱合体の内訳はE1が７６-８５％、E2-17βが１０-１８％、E3が２-４％であった。モノ硫酸抱合体の内訳はE1 が9 - 27％、E2-17βが12 - 55％、E3が33 - 79％であった。
文献（Beckmann, D.et al., 1975）14C-Estroneのミニブタ切片における代謝結果では、雄ではE3-3-mono-glucuronideのみ、雌では他にE2-17βおよび E1の3-mono-glucuronideが認められている。
文献（Mascheler, I. Et al., 1983）ブタ子宮切片の灌流実験において、E2-17βはE1に転換後、次いで6α-hydroxy-estroneおよび7α-hydroxy-estroneに代謝されることが報告されている。
文献（Jones-Witters, P. et al. 1975）雌ブタ（放射活性）エストロゲンをiv注後の尿中主代謝物はE1-monoglucuronideと微量のE2-17βとE3様物質および2-methoxy-estroneが推定されている。
（４） 脊椎動物における代謝 (in Biochemical Pathways, 1999)
一般に脊椎動物ではE1は 4-Androstene-3,17-Dioneから、E2はTestosteroneからのC-19位メチル基の酸化的脱メチルおよびそれに続くA環の芳香環化により生成される。4-Androstene-3,17-DioneからE1に至る芳香環化はNADPHと酸素を要求する数段階からなるモノオキシゲナーゼ反応（アロマターゼ）からなる。アロマターゼはシトクロムP450の一種であり(CYP-Arom)、様々な組織に存在する。アロマターゼの芳香環化反応の第一段階は19位の水酸化であり、次に19位水酸化メチル基を失い、A環はC-3位水酸基を有する芳香環となる。芳香環化によるエストロゲン合成は雌動物では主に卵巣顆粒膜で行われ、他に副腎皮質、脂肪組織および筋肉、肝臓、脳がある。雄動物では主にエストロゲン合成は肝臓、副腎皮質、精巣で行われる。妊娠動物の胎盤中ではdehydro-epi-androsterone sulfateから16α水酸化、アロマターゼによる芳香環化を経て大量のEstriol-sulfateが生成する。dehydro-epi-androsteroneは胎児副腎皮質および母体循環から供給される。E1とE2間には酸化還元反応による相互可逆的変化が行われる。エストリオールはエストロンから16α水酸化および17-ketone還元により生成する。エストロンおよびエストラジオールの2-水酸化によりCatechol-エストロゲンが生成する。この反応は胎盤型アロマターゼにより行われる。ウマは大量のエストロゲンを産生する。妊娠ウマは１日100mg以上のエストロゲンを分泌する。
２ 代謝物
（１） ヒト
ヒトではE1, E2-17β, E3の他、2位の水酸化およびメチル化、および6α、6β、10β、16α、16βの水酸化により、2-hydroxy-E2, 2-methoxy-E2, 2-hydroxy-E1, 2-methoxy-E1, 6α-hydroxy-E3, 7α-hydroxy-E2, 6α-hydroxy-E2, 16α-hydroxy-E1, 16-epi-E3, 16-keto-E2およびestrone-3S, estradiol-17G, estradiol-3S-17G, estriol-16G, E3-3S-16G、他に微量の15α-hydroxy-E1, 15α-hydroxy-E2, 18-hydroxy-E1およびこれらエストロゲンの硫酸およびグルクロナイドのモノあるいはジ抱合体など50種類以上の代謝物が認められている。通常ではEstradiol-17α (E2-17α)は存在しない。胎児由来として6α、6β、7α、15α、16α-hydroxy-E1、6α、6β、7α-E2、16βの水酸化体と15α-hydroxy-E3 (estetrol)が、妊婦胆汁中にE3-S-16G, E3-16G, E3-3S、他にE3, E1, 2-methoxy-E1, E2-17β, E2-17α, 11-dehydro-E2-17α, 16-epi-E3, 17-epi-E3, 16α-hydroxy-E1、16β-hydroxy-E1,16-oxo-E2-17β, 15α-hydroxy-E1, 15α-hydroxy-E3が、妊婦尿中に15β-hydroxy-E1, 15β-hydroxy-E2が報告されている。（Gurpide et al. 1966)
（２） ウシ
ウシではE1,E2-17α、E2-17βの他、E1-S、E1-βG、E2α-G、E2β-G、E2α-SおよびE2β-Sが報告されている。E3は確認されていない。(Purdy, R.H. et al., 1980)
（３） ブタ
ブタではE1-3-monoG, E2-3-monoG, E3-3-monoG, E1-S, E2-S, E3-S,6α-hydroxy-E1、7α-hydroxy-E1および2-methoxy-E1が報告されている。
（４） ウマ
ウマでは他にEquilinおよびEquileninが検出されている。(in Biochemical Pathways, 1999)
３．組織内残留
（１）生理レベル
正常月経周期の血漿中総エストロゲンは平均で周期前期で約100 pg/ml、排卵前後で200-1500 pg/ml、黄体期には200-500 pg/mlに達する。(表１：Tagatz, GE, and E. Gurpide,1973, Vande Wiele & Dyrenfurth, 1973)。一方、妊娠女性の総産生量から推測すると妊娠女性の血漿中総エストロゲン濃度はそれの2-30倍と思われる(表２：Farber TM, M. Arcos, 1983)。妊娠動物では大量のエストロゲンが産生されることが知られている(Kellie, A.E., 1971)。
表１．血漿中濃度および１日産生量（Tagatzら）
| エストロゲン | 時期 | 血漿中濃度 pg/ml |
総産生量 μg/day |
卵巣産生量 μg/day |
| Estradiol-17α | 卵胞期初期 卵胞期後期 黄体期中期 |
60 330-700 200 |
81 445-945 270 |
70 400-0.800 0.250 |
| Estrone | 卵胞期初期 卵胞期後期 黄体期中期 |
50 150-300 110 |
110 331-662 243 |
80 250-500 160 |
表２．１日産生量（Farberら）
| ヒト | エストラジオール μg/日 | |||||||||||||||
|
|
|||||||||||||||
|
|
２） ウシ
非妊娠未経産ウシのE2-17βおよびE1レベルは低く（いずれも10pg/g以下）、組織間濃度にも差はなく、雄ウシの値とほぼ同じである。一方、妊娠ウシでは妊娠の経過と共にE2-17βおよびE1レベルは増加し、妊娠後期ではE2-17βは肝臓に特に高く、非妊娠未経産ウシの１００倍以上（1ng/g以上）のレベルを示し、一方E1は脂肪に高く、非妊娠未経産ウシの５００倍近く（2.8-5.3 ng/g）上昇している。(表３)
表３．ウシ生理的レベル：pg/g (total: enzymatic hydrolysis)
| 筋肉 | 肝 | 腎 | 脂肪 | 文献 | |
| 非妊娠未経産 | Stieck et al. | ||||
| Estradiol-17β | 7.1 ± 3.3 | 8.2± 4.0 | 8.5 ± 4.0 | 5.6 ± 1.1 | |
| Estrone | 5.9 ± 1.6 | 7.5± 4.8 | 6.4 ± 3.0 | 5.3 ± 1.1 | |
| 妊娠未経産 | 妊娠120日 | Kushinsky | |||
| Estradiol-17β | 13.3 ± 5,2 | 82,5± 75.9 | 118 ± 58.6 | 48.1±19.8 | 1983 |
| Estrone | 156 ± 79.3 | 18.2± 15.1 | 85.3± 69.4 | 1283±885 | |
| 妊娠180日 | |||||
| Estradiol-17β | 27.3 ± 14.3 | 380 ± 280 | 230 ± 99.9 | 71.6 ± 37.2 | |
| Estrone | 482 ± 301 | 115 ± 82.6 | 166 ± 94 | 2717 ± 1259 | |
| 妊娠240日 | |||||
| Estradiol-17β | 32,7 ±16.1 | 1027 ±365 | 274 ±84.8 | 67.5 ±34.6 | |
| Estrone | 523 ±240 | 145 ±55.4 | 142 ±41.2 | 2786 ±1497 | |
| 雄牛 | Decker et al. | ||||
| Estradiol-17β | 6.3 ±2.0 | 8.5±3.2 | 10.0±3.4 | 9.1±2.0 | 1985 |
| Estrone | 7.7±3.1 | 6.0±1.2 | 8.7±3.0 | 15.3±8.2 | |
| 雄子牛 | Syntex Res. | ||||
| Estradiol-17β | 0.3 ±0.1 | 1.7±0.3 | FDA/CVM | ||
| Estrone | 2.4±1.5 | 8.0 ±6.1 | File 11-427 | ||
| 妊娠 | 妊娠183日 | ||||
| Estradiol-17β | 14.6 | 81.7 | 280 | 55.6 | |
| Estrone | 110 | 10.4 | 207 | 1920 | |
| 妊娠243日 | |||||
| Estradiol-17β | 44.9 | 630 | 417 | 139 | |
| Estrone | 458 | 258 | 500 | 4880 | |
| 妊娠266日 | |||||
| Estradiol-17β | 42.6 | 1590 | 484 | 131 | |
| Estrone | 638 | 584 | 602 | 5330 |
（２）投与後の組織内レベル （JECFA D. Arnold, 1999）
（I）表４は Compudose (23-45 mg estradiol/implant): implant 100 日設置後Implant 除去前および12時間後の腎脂肪中のE1とE2濃度である。306-307例の対照群の値はEstrone= 6.5 ± 4.8 (1.0-38), Estradiol= 3.6 ± 1.7 (1.0-11) pg/gであり、埋め込み100日でもEstroneは２倍程度（8-11pg/g）、Estradiolは４倍程度(12-13pg/g)であった。
（II) 表５．Synovex S (20 mg of E2-benzoate+200 mg of progesterone)処理後の組織内分布の中でEstroneの脂肪内最高値はimplant 61日目で48.3 pg/g、Estradiol-17βの脂肪内最高値はimplant 30日目で61.5 pg/gであった。（Progress report: S. Kushinsky & J. Duffy, IBS, Syntex Res. 5, 204, FDA/CVM NADA file 9-576, 1979.）
（III）Synovex H (20 mg of E2-benzoate+200 mg of testosterone)処理後の組織内分布の中でEstroneの脂肪内最高値はimplant 30日目で105 pg/g、Estradiol-17βの脂肪内最高値はimplant 30日目で260 pg/gであった。
（IV） 表６：TORELOR (40 mg of estradiol+200 mg of trebolone- acetate)1999年JECFAにおける残留評価に関して検討されている製剤中最も
implant中にEstradiolが高く、かつ組織内残留濃度が高いTORELOR (40 mg of estradiol+200 mg of trebolone- acetate)における最高値は、第２回implant後３０日目に認められ、最高濃度を示す組織はTotalでは肝臓（1172pg/g）, free では脂肪（284pg/g）であった。なお血漿、筋肉、脂肪中のEstradiolのほとんどは遊離体であり、肝臓、腎臓中のEstradiolのほとんどは抱合体である。（ILOB report 561a, TNO Washington, 1986, C.J.M.Arts et al., FDA/CVM INAD file 4216, vol.2, p72）インプラント開始後いずれの時期においても総エストロゲン濃度は妊娠後期のウシの内因性総エストロゲン濃度よりも低値である。
表４：Compudose (23-45 mg estradiol/implant: 100 days)
(radioimmunoassay)
| Withdrawal hr | Estradiol | Estrone | |
| 対照群n=306-307 | 3.6 ± 1.7 | 6.5 ± 4.8 | |
| Implant (100日) | |||
| Colorado n=68 | 24 | 8.1 ± 3.9 | 5.3 ± 1.0 |
| Georgia n=10 | 0 | 12.9 ± 6.1 | 11.4 ± 4.1 |
| n=58 | 24 | 7.8 ± 3.9 | 5.1 ± 0.5 |
| Idaho n=10 | 0 | 12.2 ± 5.3 | 8.0 ± 1.8 |
| N=59 | 24 | 6.3 ± 2.3 | 5.0 ± 0.1 |
表５．Synovex S埋め込み後の組織中エストロゲン濃度 (pg/ml)(HPLC/RI)
| 組織 | 埋込後 日 |
Estrone | Estradiol-17β | |||||
| 例数 | min | max | 平均 | min | max | 平均 | ||
| 脂肪 | Control | 21 | 1.41 | 18.9 | 8.62 | 0.10 | 3.66 | 1.89 |
| 15 | 8 | 11.4 | 39.2 | 20.2 | 25.3 | 51.2 | 41.4 | |
| 30 | 8 | 3.04 | 25.8 | 14.4 | 5.13 | 61.5 | 28.6 | |
| 61 | 8 | 9.65 | 48.3 | 25.9 | 20.0 | 52.4 | 39.9 | |
| 90 | 7 | 13.2 | 27.8 | 18.0 | 12.2 | 48.3 | 26.8 | |
| 120 | 7 | 7.66 | 24.4 | 16.6 | 4.06 | 30.0 | 14.5 | |
| 筋肉 | Control | 16 | 0.67 | 2.61 | 1.56 | 0.34 | 1.21 | 0.77 |
| 15 | 8 | 1.39 | 3.05 | 2.12 | 4.58 | 15.3 | 9.60 | |
| 30 | 8 | 0.75 | 3.51 | 1.96 | 1.00 | 15.3 | 8.27 | |
| 61 | 8 | 0.77 | 5.21 | 2.35 | 3.75 | 11.3 | 7.34 | |
| 90 | 7 | 0.76 | 2.55 | 1.79 | 0.97 | 7.81 | 4.51 | |
| 120 | 7 | 0.92 | 3.02 | 1.79 | 1.04 | 3.33 | 2.18 | |
| 腎臓 | Control | 18 | 0.18 | 2.34 | 1.03 | 0.55 | 2.78 | 1.70 |
| 15 | 8 | 3.10 | 7.31 | 4.44 | 8.88 | 17.0 | 18.7 | |
| 30 | 8 | 1.20 | 4.39 | 2.55 | 1.42 | 17.6 | 9.45 | |
| 61 | 8 | 1.30 | 2.61 | 1.99 | 4.37 | 9.53 | 6.40 | |
| 90 | 7 | 0.41 | 2.98 | 1.43 | 1.39 | 12.7 | 5.70 | |
| 120 | 7 | 0.63 | 2.56 | 1.70 | 2.37 | 6.39 | 4.20 | |
| 肝臓 | Control | 18 | 0.28 | 1.00 | 0.65 | 0.36 | 1.72 | 0.91 |
| 15 | 8 | 1.32 | 3.85 | 2.04 | 1.92 | 8.05 | 5.36 | |
| 30 | 8 | 0.96 | 3.44 | 1.79 | 2.76 | 16.8 | 6.74 | |
| 61 | 8 | 0.54 | 10.9 | 2.09 | 0.70 | 17.4 | 4.51 | |
| 90 | 7 | 0.46 | 2.46 | 1.21 | 0.85 | 15.6 | 5.41 | |
| 120 | 7 | 0.50 | 0.93 | 0.72 | 0.69 | 2.07 | 1.39 | |
表６．TORELOR埋め込み後の組織中エストロゲン濃度(pg/g) (HPLC/RI)
| 組織 | I:第１回 II:第２回 |
Estrone | Estradiol-17β | |||||
| min | max | 平均 | 遊離E2平均 | 総E2 min | 総E2 max | 総E2平均 | ||
| 筋肉 n=6 |
I:60 | 30 | 15 | 48 | 31 | |||
| +II:15 | 30.3 | 0 | 38 | 24.6 | ||||
| + 30 | 100 | 110 | 177 | 130 | ||||
| + 60 | 86.6 | 94 | 178 | 128 | ||||
| 肝臓 n=5-6 |
I:60 | 5 | 94 | 35.6 | 41.8 | 32 | 732 | 321 |
| +II:15 | 11 | 56 | 25.5 | 24 | 0 | 542 | 183 | |
| + 30 | 14 | 194 | 57 | 37.6 | 122 | 1172 | 366 | |
| + 60 | 14 | 57 | 28.4 | 17 | 63 | 207 | 119 | |
| 腎臓 n=5-6 |
I:60 | 65.6 | 139 | 307 | 240 | |||
| +II:15 | 73.3 | 0 | 412 | 190 | ||||
| + 30 | 109 | 204 | 422 | 348 | ||||
| + 60 | 83.2 | 166 | 303 | 239 | ||||
| 脂肪 | I:60 | 39 | 69 | 54.8 | 124 | 77 | 180 | 129 |
| +II:15 | 35 | 97 | 65.8 | 130 | 0 | 184 | 106 | |
| + 30 | 46 | 119 | 88.6 | 284 | 169 | 416 | 292 | |
| + 60 | 65 | 109 | 80.6 | 194 | 112 | 298 | 198 | |
| 血漿 | I:60 | 11 | 4 | 18 | 11 | |||
| +II:15 | 9.25 | 0 | 16 | 7.4 | ||||
| + 30 | 46.2 | 10 | 135 | 49.6 | ||||
| + 60 | 13.2 | 19 | 29 | 24.8 | ||||
４．生物活性
(1) エストロゲンの生物活性
（１） エストロゲンの主な生物活性は哺乳動物では発育および生殖機能の成熟作用を卵生動物では卵の成熟である(表７)。
（２） ウシでの子宮刺激作用で比較するとE2-17βの生物活性は異性体であるE2-17αの約３０−６０倍であると考えられる。
表７．エストロゲンの脊髄動物における生物活性
| Species | Stages | Organ | Effects |
| 全ての動物種 哺乳動物 哺乳動物 哺乳動物 哺乳動物 ヒト 爬虫類, 両生類 鳥類, 魚類 |
胎生 思春期 思春期 思春期 思春期 思春期 成熟 |
性管 卵巣 子宮内膜 子宮・膣内膜 乳腺 毛髪、脂肪組織 卵管、肝臓 |
発育 性サイクル サイクル性増殖誘導 サイクル性変化 発育 成人型 卵蛋白の産生 |
表８．ウシにおける生物活性の比較
| エストロゲン | 子宮刺激作用比 | |
| 皮下注射 | 経口投与 | |
| Estrone | 1 | 1 |
| Estradiol-17β | 3.41 | 2.01 |
| Estradiol-17α | 0.05 | 0.07 |
（２） 2-methoxy estradiol (endogenous metabolite)はBPAEC migration,
basic fibroblast growth factor を阻害する (IC50=0.71 uM). (Yue TL et al., 1997）。2-methoxy E2-17βはNOS含量の増加に従ってNOの産生を増加し、2-methoxy E2-17βは腫瘍の血管形成を阻害することが報告されている(Tsukamoto et al., 1998)。
５．考察
エストロゲン濃度から安全性を評価するとJECFAにおける残留評価に関して検討されている製剤中最もimplant中にEstradiolが高いTORELOR適用後のウシ血漿中の総エストロゲン濃度は最高値でも女性の卵胞期初期の血漿中の生理的総エストロゲン濃度とほぼ同じであり、卵胞期後期、黄体期の総エストロゲン濃度と比較すると1/3-1/10の濃度である。
６．参照文献
(1)Arnold, D., working paper on residues; JECFA 1999.
(2) Beckmann, D. & Breuer H. Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 356, 1743-51, 1975
(3) Biochemical Pathways: in An Atlas of Biochemistry & Molecular Biology.
Ed. G. Michal, J. Wiley & sons Inc. NY. 1999
(4)Bottoms, G.D. et al. J. Anal. Sci., 46, 674-685, 1977
(5) Cushman M., He, H.M., Katzenellenbogen, J.A., Lin, C.M., Hamel, E., J.Med.Chem. 9,2041-3049, 1995
(6) Decker, O.D., Turner, L.G., Study No. AAC 8410, Lilly Research Lab., submitted to FAO by Elanco Prod. Co., 1985
(7) Farber TM, M. Arcos:. in Anabolics in animal Production, Ed.: Meissonnier, E, Paris. 289-296, 1983
(8) Gurpide, ., J. Schwers, M.T. Welch, J. Clin. Endocrinol., 26, 1355, 1966
(9) Hoffmann, B., Goes de Pinho, T., Schuler, G., Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 105, 296-303, 1997
(10)本庄英雄、日本臨床37, 46, 1979
(11) ILOB report 561a, C.J.M. Arts et al., FDA/CVM INAD file 4216, vol.2, 1986
(12) Ivie, G. W. , R.J. Christopher, C.E. Mungar, C.E. Coppock, J. Anim. Sci., 62, 681, 1986
(13) Jacobsohn, G.M., E.T. Siegel and M.K. Jacobsohn: J. Clin. Endocrinol. Metab. 40, 177, 1975.
(14) Jones-Witters, P., Hurtley, M.J., Phillips, R., Brown, B.L., Erb, R.E., J. Dairy Sci. 58, 41,1975
(15)Kellie A.E., Ann. Rev. Pharmacol. 11, 97, 1971
(16)Kushinsky, S., Study submitted to FAO by Syntex Inc., 1983
(17) Mascheler, I., Ball, P., Bayerkohler, G., Gauses, J., Knuppen, R. , Steroids 41, 597-607, 1983
(18) Progress report: S. Kushinsky & J. Duffy, IBS, Syntex Res. 5, 204, FDA/CVM NADA file 9-576, 1979.
(19) Purdy, R.H., C.K.Durocher, P.H.Moore, P.N. Rao, J. Steroid Biochem.13, 1307, 1980
(20)Ryan & Engel, Endocrinology, 52, 287, 1953
(21) Stieck, R.F., Turner, L.G., Wagner, J.F., Basson, R.P., Study submitted to FAO by Elanko Prod. Co., 19??
(22) Tagatz, GE, and E. Gurpide: Handbook of Physiology-Endocrinology III. part 1: 603, 1973.
(23) Tsukamoto, A., Kaneko, Y., Yoshida, T., Han, K., Ichinose, M., Kimura, S., B.B.R.C. 248, 9-12, 1998
(24)Vande Wiele & Dyrenfurth, Pharmacol Review, 1973
(25) Yue TL , Wang X., Louden C.S., Gupta S., Pillarisetti, K., Gu J.L., Hart, T.K., Lysko, P.G., Feuerstein, G.Z., Mol. Pharmacol. 51, 951-962, 1997