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厚生労働科学研究費補助金（食品安全確保研究事業）
分担研究報告書

ダイオキシンの汚染実態把握及び摂取低減化に関する研究
（４）食品中ダイオキシン類のリスク低減に関する研究
−ダイオキシンによる毒性バイオアッセイ系に対する植物性食品成分の抑制効果−

分担研究者　天倉吉章　国立医薬品食品衛生研究所


研究要旨
　ダイオキシン類毒性バイオアッセイ法（Ahイムノアッセイ）を利用し、2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)によるバイオアッセイ系活性化に対する植物性食品成分の抑制効果について予備的検討を行った。フラボノイド、タンニン、サポニン、テルペン類など、95種の植物性食品成分についてインビトロで評価した。そのうち、フラボン類、フラボノール類、アントラキノン類、piperine、coumestrol、brevifolincarboxylic acid、resveratrolに、TCDDによるアッセイ系活性化に対する抑制効果が認められた。また、curcumin、carnosol、capsaicinも本アッセイ系活性化に対して抑制効果を示した。今回の結果は、あくまでも予備的なスクリーニングデータとしてとらえるべきであるが、いくつかの植物性食品成分にはダイオキシン類の毒性発現を抑える可能性が示唆された。


研究協力者
国立医薬品食品衛生研究所
　堤　智昭
岡山大学薬学部
　吉田隆志

A．研究目的
　一般生活の中で、ダイオキシン類のリスクとして特に問題になるのは、環境レベルでの汚染による影響（慢性毒性）である。ヒトへの暴露の大半は食品を介してであると考えられているが、現在の汚染状況を見るとそれをゼロにすることは不可能である。我々は、ダイオキシンの暴露の大半が食品由来であることから、逆に食品の利点を追求することでダイオキシンのリスク低減化を指向しており、これまでその毒性発現に関与するアリル炭化水素レセプター（AhR）リガンド活性に対する植物性食品抽出物の抑制効果について、ダイオキシン類毒性バイオアッセイ法（Ahイムノアッセイおよびレポータージーンアッセイ）をインビトロ実験モデルとして適用し、検討してきた。さらにAhRと植物性食品成分との相互作用に関する情報を集積する目的で、レポータージーンアッセイを用い検討した。今年度はAhイムノアッセイを利用し、各種植物性食品成分を対象に、TCDDによるダイオキシン毒性バイオアッセイ系活性化に対する抑制効果について予備的検討を行った。

B．研究方法
1．試料
　入手可能な様々なタイプの植物性食品成分95種（フラボノイド類、タンニン類、サポニン類、テルペン類など）を試料とした。AgrimoniinはAgrimonia japonica由来、brevifolincarboxylic acidはPhyllanthus flexuosus由来、gemin A、pedunculagin、tellimagrandin IはGeum japonicum由来、geraniinはGeranium thunbergii由来、procyanidin B2、C1はTheobroma cacao由来、casuarinin、procyanidin B4はCowania mexicana由来のものを用いた。Pentagalloylglucoseはタンニン酸をメタノリシスすることにより得た。Naringin 4'-O-a-glucoseは食品添加物「酵素処理ナリンジン」由来のものを用いた。純度は全て90％以上であることをHPLCで確認した。他の試料は、フナコシ、和光純薬工業、東京化成、シグマ　アルドリッチ、ナカハラ科学から購入した。化合物を図1に示す。

2．試薬、試液及び装置
　ジメチルスルホキシド（DMSO）（生化学用）、2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin（TCDD、98％）は、和光純薬工業社製を用いた。Ahイムノアッセイキットはクボタから購入した。マイクロプレートリーダーはTECAN社製サンライズクラシックを用いた。

3．評価方法
　評価はAhイムノアッセイを実験モデルとして使用した。96穴マイクロプレート1ウェルに対し、活性化サイトソル〔哺乳動物肝細胞抽出物にdioxin response element (DRE)、AhR translocator (Arnt)を加えたもの〕（200 uL）および試料溶液（コントロールはDMSO）（1 uL）を加え、プレートミキサーで20分間振とうした。振とう後、5 nM TCDD（DMSO溶液）（1 uL）を暴露した。ブランクにはDMSO（1 uL）のみを加えた。さらにプレートミキサーで5分間振とう後、30℃で2時間インキュベートした。ウェルを洗浄後、ELISAキットにより検出し、マイクロプレートリーダー（405 nm）により吸光度を求めた。
　AhRのリガンド活性は以下により求めた。

　(%)＝｛1−〔（A−B）−（C−D）〕/（A−B）｝×100
　A: TCDD添加時のコントロールの吸光度
　B: DMSO添加時のコントロールの吸光度
　C: TCDD添加時の試料の吸光度
　D: DMSO添加時の試料の吸光度

　すべて試験は2〜3回ずつ行い、試料無添加で得られた値をコントロール100％とした。化合物濃度−AhR活性の反応曲線より、TCDDによるAhRリガンド活性を70％に抑制する濃度をEC70とし、化合物の活性度を表した。

C．研究結果
　Ahイムノアッセイによる評価の結果を、図2に化合物濃度−AhRリガンド活性を示したグラフ、表1にEC70値として示す。図2に示すように、いくつかの化合物は0.5〜2.5 uMの低濃度で顕著な抑制効果を示した。他の多くの化合物は50 uM付近の高濃度で、TCDDによるAhR活性化に対して約20％の抑制を示した。
　供試した化合物群の中では、フラボノイド類が強い抑制効果を示した。その中では、フラボン、フラボノール類がTCDDによるAhR活性化に対して強い抑制効果を示した。個々を見ると、フラボン類ではchrysin、luteolin、apigenin、baicaleinがEC70値それぞれ、0.7、1.8、1.9、5.1 uMの抑制効果を示した。フラボン配糖体では、アグリコンよりも抑制効果が低かった。フラボノール類では、kaempferol、quercetin、myricetin、morinで、それぞれ2.1、2.7、4.3、5.3 mMのEC70値を示した。その配糖体では、spiraeoside、tiliroside（それぞれECC70値2.1、34.4 uM）は抑制効果を示したが、その他のフラボノール配糖体はEC70レベルの抑制効果を示さなかった。フラバノン類では、hesperetin、naringeninが14.6、27.7 uMのEC70値を示した。その配糖体はECC70レベルの抑制効果を示さなかった。
　イソフラボン類では、ほとんどの化合物が抑制効果を示さず、25〜50 uMの高濃度で10〜20％という弱い抑制効果を示した。GenistinはEC70値が40.8 uM、イソフラボン類の最終代謝物として知られているequolは41.2 uMであった。
　アントラキノン類は、フラボン、フラボノール類と同様、強い抑制効果を示した。Aloe-emodin、emodinでEC70値0.5、0.6 uMと、強い抑制効果を示し、またalizarinは3.2 uMと抑制効果を示した。
　他の化合物、piperin、resveratrol、brevifolincarboxylic acid、coumestrol、shikoninも抑制効果を示した（EC70値：2.7、3.9、3.9、5.6、5.6 uM）。またcapsaicin、carnosol、curcuminもEC70値が28.1、30.7、35.4 uMで、抑制効果を示した。また、加水分解性タンニン類も本アッセイ系において抑制効果を示した。

D．考察
　TCDDによるダイオキシン類毒性バイオアッセイ系活性化（AhRリガンド活性）に対する植物性食品成分の抑制効果について、本評価結果を概略すると、

　(1)　フラボノイド類は、フラボン類、フラボノール類＞＞フラバノン類＞イソフラボン類の順で抑制効果を示した。一方、これらの配糖体は効果を減弱した。
　(2)　フラボノイド類以外では、アントラキノン類、piperine、resveratrol、brevifolincarboxylic acid、coumestrol＞capsaicin、curcumin、carnosolの順で抑制を示した。
　(3)　(1)、(2)に示した化合物とは構造特性が異なる加水分解性タンニン類も抑制効果を示した。

　図3にTCDDによるバイオアッセイ系活性化に対して抑制効果を示した化合物の分子モデルを示す。このように、TCDDと同様の分子サイズ、平面構造を有していることがわかり、それゆえにこれらはアンタゴニスト様に作用していることが示唆される。したがって、抑制因子としていくつかの要因が考えられるが、その一つとしてこの分子サイズと平面性が挙げられる。
　一方、加水分解性タンニン類は、その分子サイズが大きいことから、アンタゴニスト様に作用することは考えにくい。ビフェニル部分を分子内に有するため、部分的アンタゴニストとしての作用も考えられるが、本ビフェニル構造はアトロプ異性を有し、平面ではないため考えにくい。これらはタンパク質などと複合体を形成するという特有の性質をもつため、バイオアッセイ系のいずれかを阻害した可能性があるが、さらなる検討を必要とする。
　昨年度のレポータージーンアッセイを用いたAhRと植物性食品成分との相互作用についての検討で、いくつかの化合物において高濃度でAhR活性化作用を示すことについて報告した。活性の認められたすべての化合物はいわゆる植物エストロゲンとして知られているもので、構造的にTCDDと類似している結果を示した。Chrysinのようなフラボン類は、高濃度でバイオアッセイ系活性化（AhRリガンド活性化）を示した。一方で、今回の検討において、TCDDによるバイオアッセイ系活性化に対する強い抑制効果を示した。このことは、大部分のフラボン、フラボノール類などはAhRに対して、アンタゴニストあるいはアゴニストの両方で作用する性質を有することを示唆する。
　フラボノイドの摂取量や吸収量に関する報告は極めて少ないが、例えば、フラボン、フラボノイドの一日摂取量は3〜80 mgと報告がある。またquercetin 64 mgを摂取すると、3時間後、650 nMが血漿濃度として認められた報告がある。別の研究では、10人のボランティアにquercetin 87 mgを投与すると、3時間後、129〜843 nMの血中濃度であった報告がある。これらを考慮し、実際の体内への吸収量を考察すると、通常の摂取においてフラボノイド類は、AhRに対してアンタゴニスト様に作用していることが示唆される。
　さらに前回の検討から、イソフラボンも高濃度でAhR活性を示した。本研究においては、genistein、equalはEC70レベルの抑制効果を示したが、大部分のイソフラボン類はEC70レベル以下の弱い抑制効果を示した。きなこ60gの摂取により、数uMのgenistin、equalが血中に現れることが報告されていることを考えると、通常の摂取においては、アゴニスト様に作用しないことが推測できる。
　いくつかのアントラキノン類も、高濃度で弱いAhR活性化を示した。本研究では、大部分のアントラキノン類はTCDDによるAhRリガンド活性に対して強い抑制効果を示した。
　一方、coumestrol、piperine、carnosol、capsaicin等はそれ自体、AhR活性を示さず、抑制効果のみを示した。
　このように、今回検討を行った植物性食品成分は、インビトロアッセイ系において、アゴニストとアンタゴニストの両作用を示すことが示され、それらは通常の摂取ではアンタゴニスト様に作用している可能性が推測された。それゆえに、ダイオキシンの毒性低減化においてもバランスの取れた食生活が重要であることが支持された。今回の結果は、あくまでも予備的な検討であるが、いくつかの食品成分は、ダイオキシンのリスク低減のために作用している可能性が示された。

E．結論
　TCDDによるダイオキシン類毒性バイオアッセイ系活性化に対する植物性食品成分の抑制効果について、Ahイムノアッセイを実験モデルとして用い検討した結果、フラボン類、フラボノール類、アントラキノン類、piperine、coumestrol、brevifolincarboxylic acid、resveratrolにTCDDによるアッセイ系活性に対する顕著な抑制効果が認められた。また、curcumin、carnosol、capsaicinも本アッセイ系活性化に対する抑制効果を示した。今回の結果は、あくまでも予備的なスクリーニングデータとしてとらえるべきであるが、いくつかの植物性食品成分にはダイオキシン類の毒性発現を抑える可能性が示唆された。

F．参考文献
・Fries, G.F.: A review of the significance of animal food products as potential pathways of human exposures to dioxins, J. Anim. Sci., 73, 1639-1650 (1990).
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・Liem, A.K., Furst, P., Rappe, C.: Exposure of populations to dioxins and related compounds, Food Addit. Contam., 17, 241-260 (2000).
・Amakura, Y., Tsutsumi, T., Nakamura, M., Kitagawa, H., Fujino, J., Sasaki, K., Yoshida, T., Toyoda, M.: Preliminary screening of the inhibitory effect of food extracts on activation of the aryl hydrocarbon receptor induced by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, Biol. Pharm. Bull., 25, 272-274 (2002).
・Amakura, Y., Tsutsumi, T., Nakamura, M., Kitagawa, H., Fujino, J., Sasaki, K., Toyoda, M., Yoshida, T., Maitani, T.: Activation of the aryl hydrocarbon receptor by some vegetable constituents determined using in vitro reporter gene assay, Biol. Pharm. Bull., ,26, 532-539 (2003).
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・Kobayashi, Y., Lundquist, A., Uechi, T., Ashieda, K., Sasaki, K., Hughes, B., Kaise, T.: Dioxin screening in environmental samples using the Ah-Immunoassay, Organohalogen Comp., 58, 337-340 (2002).
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・Hollman, P.C., vd Gaag, M., Mengelers, M.J., van Trijp, J.M., de Vries, J.H., Katan, M.B.: Absorption and disposition kinetics of the dietary antioxidant quercetin in man, Free Radical Biol. Med., 21, 703-707 (1996).
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・Watanabe, S., Yamaguchi, M., Sobue, T., Takahashi, T., Miura, T., Arai, Y., Mazur, W., Wahala, K., Adlercreutz, H.: Pharmacokinetics of soybean isoflavones in plasma, urine and feces of men after ingestion of 60 g baked soybean powder (kinako), J. Nutr., 128, 1710-1715 (1998).

G．研究発表
1．論文発表
1) Amakura, Y., Tsutsumi, T., Sasaki, K., Yoshida, T., Maitani, T.: Screening of the inhibitory effect of vegetable constituents on the AhR-mediated activity induced by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, Biol. Pharm. Bull., 26, 1754-1760 (2003).

2) Amakura, Y., Tsutsumi, T., Nakamura, M., Sasaki, K., Yoshida, T., Maitani, T.: Interaction of some plant food extracts with aryl hydrocarbon receptor determined by in vitro reporter gene assay, Natural Medicines, 58, 31-33 (2004).

2．学会発表
1)天倉吉章，堤　智昭，佐々木久美子，吉田隆志，米谷民雄：ダイオキシンのAhR結合活性に対する植物性食品成分の抑制効果，日本薬学会第123年会（2003. 3）．


図1．試料の化学構造

図1．試料の化学構造


図1．試料の化学構造（続き）

図1．試料の化学構造（続き）


図2．用量反応曲線

図2．用量反応曲線


図３．ダイオキシンによる毒性バイオアッセイ系活性化抑制化合物の分子モデル

図３．ダイオキシンによる毒性バイオアッセイ系活性化抑制化合物の分子モデル
（MM2計算により求めた最小化エネルギー構造）
(a) TCDD; (b) apigenin; (c) resveratrol; (d) emodin; (e) brevifolincarboxylic acid; (f) piperine


表１．ダイオキシンによる毒性バイオアッセイ系活性化に対する各試料の抑制能

　 EC70a)
(uM)		　 EC70
(uM)
Flavones 　Phloroglucinolcarboxylic acid nc
　Apigenin 1.9 　Protocatechuic acid nc
　Luteolin 1.8 　Vanillin nc
　Baicalein 5.1 　Eugenol nc
　Chrysin 0.7 　Chlorogenic acid nc
　Apigetrin 5.2 　Ellagic acid nc
　Vitexin ncb) 　Brevifolincarboxylic acid 3.9
　Baicalin 36.1 　Curcumin 35.4
Flavonols 　Rosmarinic acid nc
　Quercetin 2.7 　Resveratrol 3.9
　Kaempferol 2.1 Anthraquinones and naphtoquinones
　Myricetin 4.3 　Emodin 0.6
　Morin 5.3 　Aloe-emodin 0.5
　Quercitrin nc 　Alizarin 3.2
　Rutin nc 　Sennoside A nc
　Isoquercitrin nc 　Shikonin 5.6
　Tiliroside 34.4 Condensed tannins
　Spiraeoside 2.1 　(+)-Catechin nc
Flavanones 　(-)-Epicatechin nc
　Naringenin 27.7 　(-)-Epigallocatechin nc
　Hesperetin 14.6 　(-)-Epicatechin gallate nc
　Naringin nc 　(-)-Epigallocatechin gallate nc
　Hesperidin nc 　Procyanidin B1 nc
　(+)-Taxifolin nc 　Procyanidin B2 nc
　(+)-Fustin nc 　Procyanidin B4 nc
　Naringin 4’-O-glucoside nc 　Procyanidin C1 nc
Isoflavones 　Theaflavin nc
　Daidzein nc Hydrolyzable tannins
　Glycitein nc 　Pentagalloylglucose 29.6
　Genistein 40.8 　Pedunculagin 42.0
　Daidzin nc 　Tellimagrandin I 12.4
　Glycitin nc 　Geraniin 27.3
　Genistin nc 　Casuarinin 29.3
　6”-Acetyldaidzin nc 　Agrimoniin 6.4
　6”-Malonyldaidzin nc 　Gemin A 31.5
　6”-Malonylgenistin nc Others
　6”-Malonylglycitin nc 　Coumestrol 5.6
　Equol 41.2 　Carnosol 30.7
Chalcones 　Glycyrrhetinic acid nc
　Butein nc 　Glycyrrhizic acid nc
　Phloretin nc 　Ginsenoside Rb1 nc
　Phloridzin nc 　Caffeine nc
Phenolcarboxylic acids and related compounds 　Theophylline nc
　p-Hydroxybenzoic acid nc 　Capsaicin 28.1
　Caffeic acid nc 　Piperine 2.7
　trans-Ferulic acid nc 　β-Sitosterol nc
　trans-Cinnamic acid nc 　Ginkgolide A nc
　p-Coumaric acid nc 　Lycopene nc
　Gallic acid nc 　Limonin nc
　Methyl gallate nc 　β-Carotene nc

各試料2または3回測定．
a)試料無添加時のTCDDによるAhRリガンド活性を100％とした時、70％に活性を抑制する各試料の濃度．
b)Not calculated; EC70レベルの抑制効果が認められなかった．

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