マラカイトグリーン試験法
マラカイトグリーン及びロイコマラカイトグリーンを分析対象とする。
| １ | ．装置
液体クロマトグラフ・質量分析計を用いる。
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| ２ | ．試薬・試液
次に示すもの以外は，第２ 添加物の部Ｃ 試薬・試液等の項に示すものを用いる。
なお，「（特級）」と記載したものは，日本工業規格試薬の特級の規格に適合するものであることを示す。
| ア | セトニトリル 液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。 |
ギ酸アンモニウム ギ酸アンモニウム（特級）
| 強 | 酸性陽イオン交換体ミニカラム（500mg） 内径８〜９mmのポリエチレン製カラム管に，ベンゼンスルホニルプロピルシリル化シリカゲル500mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離特性を有するものを用いる。 |
| ク | エン酸・リン酸緩衝液（pＨ3.0） 第１液：クエン酸63.0ｇを量り，水を加えて溶かして1,000mlとする。
第２液：リン酸二ナトリウム215ｇを量り，水を加えて溶かして1,000mlとする。
第１液に第２液を加えて混和し，pＨを3.0に調整する。 |
ジクロロメタン ジクロロメタン（特級）
水 液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。
| 無 | 水硫酸ナトリウム 無水硫酸ナトリウム(特級)。当該農薬等の成分である物質の分析の妨害物質を含む場合には，酢酸エチル等で洗浄したものを用いる。 |
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| ３ | ．標準品
シュウ酸マラカイトグリーン 本品はシュウ酸マラカイトグリーン99％以上を含む。
分解点 本品の分解点は164℃である。
ロイコマラカイトグリーン 本品はロイコマラカイトグリーン99％以上を含む。
融点 本品の融点は103℃である。
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| ４ | ．試験溶液の調製
| ａ | 抽出法
検体を細切均一化した後，その5.00ｇを量り採り，クエン酸・リン酸緩衝液（pＨ3.0）10mlを加えて細砕する。これにアセトニトリル15mlを加え，振とう機を用いて５分間激しく振り混ぜた後，毎分3,000回転で５分間遠心分離し，アセトニトリル−水層を採る。残留物にアセトニトリル15mlを加え，上記と同様に振り混ぜ，遠心分離した後，アセトニトリル層を先のアセトニトリル−水層に合わせる。
これにｎ−ヘキサン５mlを加え，振とう機を用いて５分間激しく振り混ぜた後，静置し，アセトニトリル−水層を採る。これにｎ−ヘキサン５mlを加え，上記と同様に振り混ぜた後，静置し，アセトニトリル−水層を採る。
これに20％塩化ナトリウム溶液50ml及びジクロロメタン10mlを加え，振とう機を用いて５分間激しく振り混ぜた後，静置し，アセトニトリル−ジクロロメタン層を採る。
これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，ろ過する。
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| ｂ | 精製法
強酸性陽イオン交換体ミニカラム（500mg）に、アセトニトリル５mlを注入し，流出液は捨てる。このカラムにａ 抽出法で得られた溶液を注入した後，アセトニトリル５mlを注入し，流出液は捨てる。このカラムにアセトニトリル及びアンモニア水の混液（９：１）10mlを注入し，溶出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40℃以下でアセトニトリル及びアンモニア水を除去する。この残留物にアセトニトリル1.0mlを加えて溶かし，これを試験溶液とする。 |
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| ５ | ．操作法
| ａ | 定性試験
次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。
操作条件
カラム充てん剤 オクタデシルシリル化シリカゲル（粒径２〜５μm）を用いる。
カラム管 内径2.0〜6.0mm，長さ100〜250mmのステンレス管を用いる。
カラム温度 40℃
| 移 | 動相 アセトニトリル及び0.01mol/lギ酸アンモニウムの混液（１：９）から（１：０）までの濃度勾配を20分間で行い，（１：０）で10分間保持する。マラカイトグリーンが約10分で流出する流速に調整する。 |
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| ｂ | 定量試験
ａ 定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。 |
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