アゾシクロチン及びシヘキサチン試験法

１．装置
　炎光光度型検出器（スズ用干渉フィルター，波長610nm）付きガスクロマトグラフ及びガスクロマトグラフ・質量分析計を用いる。

２．試薬・試液
　次に示すもの以外は，第２　添加物の部Ｃ　試薬・試液等の項に示すものを用いる。 なお，「（特級）」と記載したものは，日本工業規格試薬の特級の規格に適合するものであることを示す。
アセトニトリル　アセトニトリル300mlをすり合わせ減圧濃縮器を用いて濃縮し，アセトニトリルを除去する。この残留物をｎ-ヘキサン５mlに溶かし，その５μlを電子捕獲型検出器付きガスクロマトグラフに注入して試験するとき，ガスクロマトグラム上のｎ-ヘキサン以外のピークの高さは，２×10−11ｇのγ-ＢＨＣが示すピークの高さ以下でなければならない。
アセトン　アセトン300mlをすり合わせ減圧濃縮器を用いて濃縮し，アセトンを除去する。この残留物をｎ-ヘキサン５mlに溶かし，その５μlを電子捕獲型検出器付きガスクロマトグラフに注入して試験するとき，ガスクロマトグラム上のｎ-ヘキサン以外のピークの高さは，２×10−11ｇのγ-ＢＨＣが示すピークの高さ以下でなければならない。
３mol／/lエチルマグネシウムブロミド・エーテル溶液　３mol／lエチルマグネシウムブロミド・エーテル溶液
エーテル　エチルエーテル300mlをすり合わせ減圧濃縮器を用いて濃縮し，エチルエーテルを除去する。この残留物をｎ-ヘキサン５mlに溶かし，その５μlを電子捕獲型検出器付きガスクロマトグラフに注入して試験するとき，ガスクロマトグラム上のｎ-ヘキサン以外のピークの高さは，２×10−11ｇのγ-ＢＨＣが示すピークの高さ以下でなければならない。
塩化ナトリウム　塩化ナトリウム（特級）。当該農薬等の成分である物質の分析の妨害物質を含む場合には，ｎ-ヘキサン等の溶媒で洗浄したものを用いる。
カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム　カラムクロマトグラフィー用に製造した合成ケイ酸マグネシウム（粒径150〜250μm）を130℃で12時間以上加熱した後，デシケーター中で放冷する。
ケイソウ土　化学分析用ケイソウ土を用いる。
シヘキサチン標準溶液　シヘキサチン10.0mgに酢酸及び酢酸エチルの混液（１：99）を加えて100mlとし，この10mlを採り，ｎ-ヘキサンを加えて100mlとする。
ドデシル硫酸ナトリウム　純度85％以上の試薬を用いる。
ｎ-ヘキサン　ｎ-ヘキサン300mlをすり合わせ減圧濃縮器を用いて５mlに濃縮し，この５μlを電子捕獲型検出器付きガスクロマトグラフに注入して試験するとき，ガスクロマトグラム上のｎ-ヘキサン以外のピークの高さは，２×10−11ｇのγ-ＢＨＣが示すピークの高さ以下でなければならない。
水　蒸留水を用いる。当該農薬等の成分である物質の分析の妨害物質を含む場合には，ｎ-ヘキサン等の溶媒で洗浄したものを用いる。
無水硫酸ナトリウム　無水硫酸ナトリウム（特級）。当該農薬等の成分である物質の分析の妨害物質を含む場合には，ｎ-ヘキサン等の溶媒で洗浄したものを用いる。

３．標準品
シヘキサチン　本品はシヘキサチン99％以上を含む。
　融点　本品の融点は195〜198℃である。

４．試験溶液の調製
ａ　抽出法
(1)　豆類及び種実類の場合
　検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後，その10.0ｇを量り採り，水20mlを加え，２時間放置する。
　これにアセトン及び酢酸の混液（99：１）100mlを加え，３分間細砕した後，ケイソウ土を１cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り，アセトン及び酢酸の混液（99：１）50mlを加え，３分間細砕した後，上記と同様に操作して，ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ，40℃以下で約30mlに濃縮する。
　これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液200mlを入れた500mlの分液漏斗に移す。ｎ-ヘキサン100mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い，洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて５分間激しく振り混ぜた後，静置し，ｎ-ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にｎ-ヘキサン50mlを加え，上記と同様に操作して，ｎ-ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでｎ-ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を２回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ，40℃以下でｎ-ヘキサンを除去する。
　この残留物にｎ-ヘキサン20mlを加え，100mlの分液漏斗に移す。これにｎ-ヘキサン飽和アセトニトリル40mlを加え，振とう機を用いて５分間激しく振り混ぜた後，静置し，アセトニトリル層をすり合わせ減圧濃縮器中に移す。ｎ-ヘキサン層にｎ-ヘキサン飽和アセトニトリル40mlを加え，上記と同様の操作を２回繰り返し，アセトニトリル層をその減圧濃縮器中に合わせ，40℃以下でアセトニトリルを除去する。この残留物にｎ-ヘキサンを加えて溶かし，正確に５mlとする。
(2)　穀類，果実及び野菜の場合
　穀類の場合は，検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後，その10.0ｇを量り採り，水20mlを加え，２時間放置する。
　果実及び野菜の場合は，検体約１kgを精密に量り，必要に応じ適量の水を量って加え，細切均一化した後，検体20.0ｇに相当する量を量り採る。
　これにアセトン及び酢酸の混液（99：１）100mlを加え，３分間細砕した後，ケイソウ土を１cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り，アセトン及び酢酸の混液（99：１）50mlを加え，３分間細砕した後，上記と同様に操作して，ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ，40℃以下で約30mlに濃縮する。
　これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液200mlを入れた500mlの分液漏斗に移す。ｎ-ヘキサン100mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い，洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて５分間激しく振り混ぜた後，静置し，ｎ-ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にｎ-ヘキサン50mlを加え，上記と同様に操作して，ｎ-ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでｎ-ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を２回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ，40℃以下でｎ-ヘキサンを除去する。この残留物にｎ-ヘキサンを加えて溶かし，正確に10mlとする。
(3)　抹茶及びホップの場合
　抹茶の場合は，検体5.00ｇを量り採り，水20mlを加え，２時間放置する。
　ホップの場合は，検体を粉砕した後，その5.00ｇを量り採り，水20mlを加え，２時間放置する。
　これにアセトン及び酢酸の混液(99：１)100mlを加え，３分間細砕した後，ケイソウ土を１cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り，アセトン及び酢酸の混液(99：１)50mlを加え，３分間細砕した後，上記と同様に操作して，ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ，40℃以下で約30mlに濃縮する。
　これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液200mlを入れた500mlの分液漏斗に移す。ｎ-ヘキサン100mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い，洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて５分間激しく振り混ぜた後，静置し，ｎ-ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にｎ-ヘキサン50mlを加え，上記と同様に操作して，ｎ-ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでｎ-ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を２回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ，40℃以下で約５mlに濃縮し，これにｎ-ヘキサンを加えて正確に10mlとする。
(4)　抹茶以外の茶の場合
　検体9.00ｇを100℃の水540mlに浸し，室温で５分間放置した後，ろ過し，冷後ろ液360mlを500mlの分液漏斗に移す。
　これに塩化ナトリウム30ｇ，２％ドデシル硫酸ナトリウム溶液２ml及びｎ-ヘキサン100mlを加え，振とう機を用いて５分間激しく振り混ぜた後，静置し，ｎ-ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にｎ-ヘキサン100mlを加え，上記と同様に操作して，ｎ-ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでｎ-ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を２回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ，40℃以下でｎ-ヘキサンを除去する。この残留物にｎ-ヘキサンを加えて溶かし，正確に６mlとする。
(5)　(1)から(4)までに掲げる食品以外の食品の場合
　(1)，(2)又は(3)の場合に準じて抽出を行う。
ｂ　エチル化
　ａ　抽出法で得られた溶液１ml（穀類，茶及びホップの場合は，２ml）を50mlの共栓付き試験管に採り，３mol／lエチルマグネシウムブロミド・エーテル溶液１ml（穀類，茶及びホップの場合は，２ml）を加え，室温で20分間放置する。
　これに0.5mol／l硫酸10mlを徐々に加え，次いで水10mlを加えて混和する。これにｎ-ヘキサン10mlを加え，１分間激しく振とうする。静置した後，ｎ-ヘキサン層を50mlの三角フラスコに移す。水層にｎ-ヘキサン５mlを加え，上記と同様の操作を２回繰り返し，ｎ-ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでｎ―ヘキサン５mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を２回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ，40℃以下で２mlに濃縮する。
ｃ　精製法
　内径15mm，長さ300mmのクロマトグラフ管に，カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム５ｇをｎ-ヘキサンに懸濁したもの，次いでその上に無水硫酸ナトリウム約５ｇを入れ，カラムの上端に少量のｎ-ヘキサンが残る程度までｎ-ヘキサンを流出させる。このカラムにｂ　エチル化で得られた溶液を注入した後，ｎ-ヘキサン15mlで減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い，洗液をカラムに注入し，溶出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採る。次いでエーテル及びｎ-ヘキサンの混液（１：99）50mlを注入し，溶出液を上記の減圧濃縮器中に採り，40℃以下でエーテル及びｎ-ヘキサンを除去する。この残留物にｎ-ヘキサンを加えて溶かし，正確に２mlとして，これを試験溶液とする。

５．操作法
ａ　定性試験
　次の操作条件で試験を行う。試験結果はシヘキサチン標準溶液について４．試験溶液の調製のｂ　エチル化と同様に操作して得られたものと一致しなければならない。なお，アゾシクロチンはエチル化により，シヘキサチンと同一物質に変化する。
操作条件
カラム　内径0.32〜0.53mm，長さ30ｍのケイ酸ガラス製の細管に，ガスクロマトグラフィー用５％フェニル―メチルシリコンを1.5μmの厚さでコーティングしたものを用いる。
カラム温度　120℃で２分間保持し，その後毎分10℃で昇温する。200℃に到達後，毎分20℃で昇温し，300℃に到達後５分間保持する。
試験溶液注入口温度　280℃
検出器　300℃で操作する。
ガス流量　キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。シヘキサチンが13〜15分で流出する流速に調整する。空気及び水素の流量を至適条件に調整する。
ｂ　定量試験
　ａ　定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。
ｃ　確認試験
　ａ　定性試験と同様の操作条件でガスクロマトグラフィー・質量分析を行う。試験結果は標準品について４．試験溶液の調製のｂ　エチル化と同様に操作して得られたものと一致しなければならない。また，必要に応じ，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。
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