クリスタルバイオレット、ブリリアントグリーン及びメチレンブルー試験法（畜水産物）
１． 分析対象化合物
| 農薬等の成分である物質 | 分析対象化合物 |
| クリスタルバイオレット | クリスタルバイオレット |
| ブリリアントグリーン | ブリリアントグリーン |
| メチレンブルー | メチレンブルー |
２． 装置
可視分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ（HPLC-VIS）
液体クロマトグラフ・質量分析計（LC/MS）
３．試薬、試液
次に示すもの以外は、総則の３に示すものを用いる。
アセトニトリル 液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。
水 液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。
ギ酸アンモニウム ギ酸アンモニウム（特級）
クエン酸・リン酸緩衝液（pＨ3.0） 第１液：クエン酸57.6ｇを量り、水を加えて溶かして1,000 mLとする。 第２液：リン酸三ナトリウム228ｇを量り、水を加えて溶かして1,000 mLとする。 第１液に第２液を加えて混和し、pＨを3.0に調整する。
クリスタルバイオレット標準品 本品はクリスタルバイオレット（C25H30ClN3: 407.98）94％以上を含み、融点は215℃である。
ブリリアントグリーン標準品 本品はブリリアントグリーン（C27H34N2O4S: 482.64）95％以上を含み、融点は180℃である。
メチレンブルー標準品 本品はメチレンブルー（C16H18N3SCl: 319.85）97％以上を含み、融点は169〜170℃である。
４．試験溶液の調製
試料5.00ｇを量り採り、クエン酸・リン酸緩衝液（pＨ3.0）10 mLを加えて５分間細砕する。これにアセトニトリル40 mLを加え、振とう機を用いて５分間激しく振り混ぜた後、毎分2,600回転で５分間遠心分離し、アセトニトリル−水層を分液ロートに採る。残留物にアセトニトリル20 mLを加え、上記と同様に操作し、得られたアセトニトリル層を先の分液ロートに合わせる。これにｎ-ヘキサン80 mLを加えて激しく振り混ぜた後、静置し、アセトニトリル層を採る。これに20％塩化ナトリウム溶液50 mL及びジクロロメタン50 mLを加えて５分間振とうした後、静置し、アセトニトリル−ジクロロメタン層を採る。
これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過し、40℃以下でアセトニトリル−ジクロロメタン層を除去する。この残留物にアセトニトリル2.0 mLを加えて溶かし、これを試験溶液とする。
５．検量線の作成
各標準品の10 mg/100 mLメタノール溶液を調製し、アセトニトリル及び0.01 mol/Lギ酸アンモニウム溶液（１：９）混液で希釈して0.0125〜0.5mg/Lの標準溶液を数点調製する。それぞれHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。
６．定量
試験溶液をHPLCに注入し、５の検量線で各物質の含量を求める。
７．確認試験
LC/MSにより確認する。
８．測定条件
HPLC
検出器：VIS（測定波長：クリスタルバイオレット 590 nm、ブリリアントグリーン 625 nm、メチレンブルー 665 nm）
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル 内径 2.0〜6.0 mm、長さ 100〜250 mm、粒子径２〜５μm
カラム温度：40℃
移動相：アセトニトリル及び0.01 mol/Lギ酸アンモニウム溶液の混液（１：９）から（１：０）までの濃度勾配を20分間で行い、（１：０）で10分間保持する。
保持時間の目安：12分（メチレンブルー）
９．定量限界
クリスタルバイオレット 0.005 mg/kg
ブリリアントグリーン 0.005 mg/kg
メチレンブルー 0.005 mg/kg
10．留意事項
１）試験法の概要
クリスタルバイオレット、ブリリアントグリーン及びメチレンブルーを試料からアセトニトリル及びクエン酸・リン酸緩衝液（pＨ3.0）で抽出し、ジクロロメタンに転溶した後、HPLC-VISで測定し、LC/MSで確認する方法である。
２）注意点
(1) ジクロロメタン転溶の際に溶媒が乳化する場合は、遠心分離等により層を完全に分離すること。
(2) HPLC-VIS及びLC/MSにおける標準溶液及び試験溶液の標準的な注入量は、内径3.0 mmのカラムにおいて10μLであるが、カラム及び装置により最適な注入量が異なる場合があるので、必要に応じて最適注入量を検討すること。
(3) LC/MSにおける測定条件は用いる装置により、最適なイオン化方法、生成するイオンが異なる場合があるので、装置ごとに最適条件を検討すること。
11．参考文献
春日ら、食品衛生学雑誌、32, 137（1991）
12．類型
Ｃ