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厚生労働科学研究費補助金（食品・化学物質安全総合研究事業）
分担研究報告書

ダイオキシンの汚染実態把握及び摂取低減化に関する研究
（4）食品中ダイオキシン類のリスク低減に関する研究
−植物性食品成分のダイオキシン類毒性バイオアッセイ系への影響−

分担研究者　天倉吉章　国立医薬品食品衛生研究所


研究要旨
　食品中ダイオキシン類のリスク低減化に寄与する情報を得るため、植物性食品成分のダイオキシン類毒性バイオアッセイ系への影響を検討した。評価には、ダイオキシン類の毒性発現に関与するアリル炭化水素レセプター（AhR）を介したメカニズムに基づくバイオアッセイ法、ケイラックスアッセイ（ルシフェラーゼ遺伝子を導入した培養細胞を利用したレポータージーンアッセイ）を利用し、入手出来た95種の植物性食品成分について検討した。その結果、大部分の化合物は作用を示さなかったが、大豆イソフラボンの他、一部のフラボノイド、スチルベン骨格を有するresveratrolなど、いわゆる植物エストロゲンといわれるものの一部に、高濃度でアッセイ系の活性化が認められた。今回のデータはあくまでも予備的なものであるが、現段階でいえることは、一部食品の過度の摂取を避けたバランスのとれた食事が重要で、ダイオキシンのリスク低減化においても大切であるといえる。


研究協力者
国立医薬品食品衛生研究所
　堤　智昭
株式会社日吉
　中村　昌文
岡山大学薬学部
　吉田　隆志

A．研究目的
　アリル炭化水素レセプター（AhR）は、哺乳動物などの細胞、組織内に存在する受容体型転写因子で、ダイオキシンなどの環境汚染物質をリガンドとするためダイオキシンレセプターとも呼ばれ、それらの生体毒性発現へ関与することが指摘されている。近年、そのメカニズムに関する研究が数多く行われ、様々な知見が得られているが、このレセプターに関しては未解明な部分も多く、依然、オーファンレセプターの一つにあげられている。リガンドとなるダイオキシンなどは、近年、人類が生み出した産物であるため、AhRは元来、食物などの外来性天然物による誘導現象の受容体として何らかの役割を果たしていたのかもしれない。しかし、食品成分とAhRとの相互作用に関する詳細な検討はほとんど見られない。一方、一般生活レベルでのダイオキシンのヒトへの摂取は、その大半が通常食する食品を媒体とするため、そのリスクを考察する上での情報として、食品成分のAhRへの影響については検討が必要とされる。さらにその本質を明確にすることで、食品の利点を追求でき、ダイオキシンのリスク低減化を指向した研究が期待される。
　そこで本研究では、植物性食品成分のAhRとの相互作用について、AhRを介した毒性発現メカニズムに基づくダイオキシン類バイオアッセイ法であるケイラックスアッセイ（ルシフェラーゼ遺伝子を導入した培養細胞を利用し、ダイオキシン類とAhRとの結合をルシフェラーゼ活性により検出するレポータージーンアッセイ）を用いて検討を行った。

B．研究方法
1．試料
　入手可能な様々なタイプの植物性食品成分95種（フラボノイド類、タンニン類、サポニン類、テルペン類など）を試料とした。Procyanidin B2、C1はTheobroma cacao由来、procyanidin B4はCowania mexicana由来、brevifolincarboxylic acidはPhyllanthus flexuosus由来、geraniinはGeranium thunbergii由来、agrimoniinはAgrimonia japonica由来、oenothein BはEugenia uniflora由来、gemin A、pedunculagin、tellimagrandin　I はGeum japonicum由来、pentagalloylglucose、rugosin DはLoropetalum chinensis由来、sanguiin H-6はRubus parvifolius由来のものを用いた。Naringin 4'-O-α-glucoseは食品添加物、酵素処理ナリンジン由来のものを用いた（純度はすべて90％以上であることをHPLCで確認した）。他の試料は、フナコシ（株）、和光純薬工業（株）、東京化成（株）、シグマ アルドリッチ、ナカハラ科学（株）から購入した。試料の化学構造を図1に示す。

2．試薬、試液及び装置
　ジメチルスルホキシド（DMSO）（生化学用）、2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin（TCDD、98％）は和光純薬工業社製を用いた。RPMI1640培地、ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、リン酸緩衝生理食塩水、0.25%トリプシン溶液はナカライテスク社製を用いた。牛胎児血清（FBS）はInvitrogen社製を、Lysis試薬、ルシフェラーゼアッセイシステムはPromega社製を用いた。ルミノメーターはAnthos社製Lucy 1 microplate luminometer を使用した。

3．評価方法
　評価はケイラックスアッセイにより行った。試料溶液（コントロールはDMSO）は終濃度0.01〜100,000 nMの範囲で8段階にDMSOで希釈して調製した（TCDDは終濃度0.0015〜0.39 nMの範囲で9段階に希釈）。試料4 µLを試験管に入れ、RPMI1640培地（＋8％FBS＋１％ペニシリン/ストレプトマイシン）400 µLを加えて攪拌後、そのうち200 µLを一晩前培養した96穴マイクロプレート中のマウス肝ガン細胞H1L6.1（約1.5×105 cell/well）に1ウェルずつ暴露し、CO2インキュベーター（37℃，5％CO2濃度）で20〜24時間培養した。培養後、培地を取り除き、ウェルを洗浄後、顕微鏡下、細胞の生存を確認した。Lysis 試薬300 µLで細胞壁を溶解後、プレートミキサーで10分間振とうした。振とう後、10分間放置し、基質としてルシフェリン50 µLを加え、ルミノメーターにより発光量（RLU）を測定した。試料濃度−ルシフェラーゼ活性の反応曲線より、TCDDの最高値を100としたときの25％活性値（EC25値: 1.3×10-2 nM）を誘導する濃度をECTCDD25とし、試料の活性度を表した。またTCDDのEC25値を1.0として換算した値を誘導等価係数（IEF）とし、その度合いを評価した。試験はすべて3回ずつ行い、その平均値で示した。

C．研究結果
　ケイラックスアッセイの結果、一部の成分において103〜105 nMレベルの高濃度でルシフェラーゼ活性を認めたが、ほとんどの化合物は105 nMレベルにおいても活性を示さなかった。図2にケイラックスアッセイによる用量反応曲線、表1にECTCDD25値及びIEF値で示した各試料のダイオキシン類バイオアッセイ系活性能を示す。活性を認めたほとんどはフラボノイド類であった。最も活性が高かったものは、daidzein、glycitein、genistein（それぞれ、ECTCDD25値：3.0×103、4.2×103、2.4×103 nM、IEF値：4.3×10-6、3.1×10-6、5.4×10-6）といったイソフラボン類で、これらの配糖体化（daidzin、glycitin、genistin）は活性が弱くなる傾向が認められた（それぞれ、ECTCDD25値：1.2×104、2.0×104、4.2×103 nM、IEF値：1.1×10-6、6.5×10-7、3.1×10-6）。フラバン、フラボン類においては、naringenin、hesperetinがイソフラボンよりは弱い活性を認め（それぞれ、ECTCDD25値：5.3×104、3.8×104、IEF値：2.5×10-7、3.4×10-7）、これらも配糖体化により活性が低減した。フラボン、フラボノール類では全体的に高濃度で若干の活性を示したが、baicalein、baicalin（それぞれ、ECTCDD25値：2.8×103、3.2×103、IEF値：4.6×10-6、4.1×10-6）以外はECTCDD25レベル以下であった。フラボノイド類以外では、スチルベン骨格を有するresveratrol（ECTCDD25値：7.3×103、IEF値：1.8×10-6）、アントラキノン構造を有するalizarin（ECTCDD25値：3.1×103、IEF値：4.2×10-6）にイソフラボン類に匹敵するアッセイ系活性化能が認められた。

D．考察
　結果から、植物性食品成分の構造とダイオキシン類バイオアッセイ系活性化能の相関を概略すると、
　(1)フラボノイド類：イソフラボン類＞＞フラボノール類 (B環に水酸基のないもの)＞フラバノン類（3-ol以外）＞その他のフラボノール、フラボン類、フラバノン類の順で活性能を示した。
　(2)その他：トランススチルベン骨格を有するresveratrolに活性が認められた。アントラキノン構造を有するalizarinに活性が認められたが、その一部がアシル化された化合物では活性が認められなかった。
　(3)水酸基の影響：AhRリガンドとして疎水性、平面性のものが多く知られている。今回も水酸基の多いタンニン類など、親水性の高いものは活性が認められず、平面構造に近いものでも活性は乏しかった。しかしイソフラボン類では水酸基の影響は少なく、活性は水酸基とその構造特性の両方に依存するところが大きいことが考えられる。供試した化合物の構造的相違からみると、フラバン構造のものでは，C環3位の水酸基が活性に影響を及ぼすことが示唆された。
　(4)分子サイズ、構造平面性の影響：図3に活性化化合物の最小化エネルギー構造を示す。　(a)がTCDDの分子モデルであるが、活性を示した化合物の安定構造はすべて平面構造で、TCDDに近い分子サイズを有しており、それらの非平面化及び配糖体化による分子の増大化は活性を低減させた。
　活性の認められたすべての化合物はいわゆる植物エストロゲンとして知られているものである。しかし植物エストロゲンに分類されるcoumestrol、β-sitosterolなど、活性を示さないものもあり、このことはエストロゲン作用のメカニズムの多様性を示唆した。また大豆イソフラボン類は食品の第三次機能成分として知られており、今回の結果からAhRはbeneficial regulatorとして何らかの作用をしている可能性も示唆されたが、これについては今後さらなる検討を必要とする。
　大豆イソフラボンなどの一部食品成分に、非現実的な高濃度でアッセイ系の活性化（ダイオキシン様作用）が認められた。しかしその一方で、それらは低濃度で、ダイオキシンによるバイオアッセイ系の活性化に対して弱い抑制効果も示されており、AhR自体が毒性発現のみでなく、食品を介して毒性を制御している可能性も示唆された。今後、これら食品成分をプローブとしたさらなる機能解明が必要とされる。これまでの結果は、あくまでも予備的で途上なものであるが、現段階でいえることは一部食品の過度の摂取は控えるべきで、バランスのとれた食事がダイオキシンのリスク低減化においても大切であることが考察された。

E．結論
　今回、大豆イソフラボンなどに高濃度で、ダイオキシン類毒性バイオアッセイ系の活性化が認められた。一方、低濃度では逆に弱い抑制作用が示されており、この結果はあくまでも予備的なものであるが、現段階でいえることは一部食品の過度の摂取を控えたバランスのとれた食生活が重要で、ダイオキシンのリスク軽減化も期待できる。
　今後、これまでのデータを基に、ダイオキシンによる毒性バイオアッセイ系活性化に対する植物性食品成分の影響、及びその活性化抑制作用が示されているほうれんそう、こまつななどに含まれる活性化抑制因子を明らかにし、ダイオキシンの毒性低減化を指向した食品の役割について予備的検証を行う。

F．参考文献
・Akiyama, T., Yamada, M., Yamada, T., Maitani, T., Naringin glycosides alpha-glucosylated on ring B found in the natural food additive, enzymatically modified naringin, Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2246-2249 (2000).
・Denison, M., Brouwer, A., Clark, G., U.S. Patent 5,854,010 (1998).
・Hatano, T., Miyatake, H., Natsume, M., Osakabe, N., Takizawa, T., Ito, H., Yoshida, T., Proanthocyanidin glycosides and related polyphenols from cacao liquor and their antioxidant effects, Phytochemistry, 59, 749-758 (2002).
・Informational Brochure of Dioxins (2001), Office of Dioxins Control, Administration Division, Environmental Management Bureau, Ministry of the Environment, Japan.
・Landers, J.P., Bunce, N.J., The Ah receptor and the mechanism of dioxin toxicity, Biochem. J., 276, 273-287 (1991).
・Miura, J., Yamashita, K., Nakamura, K., Morita, M., Takagi, T.N., Nakano, K., Ema, M., Sogawa, K., Yasuda, M., Katsuki, M., Fujii-Kuriyama, Y., Loss of teratogenic response to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo- p-dioxin (TCDD) in mice lacking the Ah (dioxin) receptor, Genes to Cells, 2, 645-654 (1997).
・Okuda, T., Yoshida, T., Hatano, T., Hydrolyzable tannins and related polyphenols, Prog. Chem. Org. Nat. Prod., 66, 1-102 (1995).
・Pohjanvirta, R., Tuomisto, J., Short-term toxicity of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in laboratory 　animals: effects, mechanisms, and animal models, 　Pharmacol. Rev., 46, 483-549 (1994).
・Poland, A., Knutson, J.C., 2,3,7,8-tetrachloro　dibenzo-p-dioxin and related halogenated aromatic 　hydrocarbons: examination of the mechanism of 　toxicity, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 22, 517-554 (1982).
・Safe, S.H., Comparative toxicology and mechanism of action of polychlorinated dibenzo- p-dioxins and dibenzofurans, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 26, 371-399 (1986).
・Whitlock, J.P.Jr., Genetic and molecular aspects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin action, Annu. 　Rev. Pharmacol. Toxicol., 30, 251-277 (1990).

G．研究発表
1．論文発表
1) Amakura, Y., Tsutsumi, T., Nakamura, M., Kitagawa H., Fujino, J., Sasaki, K., Toyoda, M., Yoshida, T., Maitani, T., Activation of the aryl hydrocarbon receptor by some vegetable constituents determined using in vitro reporter gene assay, Biol. Pharm. Bull., 26, 532-539 (2003).

2．学会発表
1) 天倉 吉章，堤　智昭，中村 昌文，北川 宏子，藤野 潤子，佐々木久 美子，豊田 正武，吉田 隆志，米谷 民雄：植物性食品成分のアリル炭化水素レセプター活性化に関する検討，フォーラム2002：衛生薬学・環境トキシコロジー（2002. 10）．


図1．試料の化学構造

図1．試料の化学構造


図1試料の化学構造（続き）

図1試料の化学構造（続き）


図2．ケイラックスアッセイによる用量反応曲線（一部）

図2．ケイラックスアッセイによる用量反応曲線（一部）


図3．バイオアッセイ系活性化化合物の分子モデル

図3．バイオアッセイ系活性化化合物の分子モデル
（MM2計算により求めた最小化エネルギー構造）
(a) TCDD, (b) Daidzein, (c) Resveratrol, (d) Alizarin, (e) Baicalein


表１．各試料のダイオキシン類バイオアッセイ系活性化能
　 ECTCDD25a)
(nM)		 IEFb) 　 ECTCDD25
(nM)		 IEF
2,3,7,8-TCDD 1.3×10-2 1.0 　Vanillin nc nc
Isoflavones 　Eugenol nc nc
　Daidzein 3.0×103 4.3×10-6 　Chlorogenic acid nc nc
　Glycitein 4.2×103 3.1×10-6 　Ellagic acid nc nc
　Genistein 2.4×103 5.4×10-6 　Brevifolincarboxylic acid nc nc
　Daidzin 1.2×104 1.1×10-6 　Curcumin nc nc
　Glycitin 2.0×104 6.5×10-7 　Rosmarinic acid nc nc
　Genistin 4.2×103 3.1×10-6 　Resveratrol 7.3×103 1.8×10-6
　6”-Acetyldaidzin 3.2×104 4.1×10-7 Anthoraquinones and nap oquinones
　6”-Malonyldaidzin 4.8×104 2.7×10-7 　Emodin nc nc
　6”-Malonylgenistin 9.8×104 1.3×10-7 　Aloe-emodin nc nc
　6”-Malonylglycitin nc c) nc 　Alizarin 3.1×103 4.2×10-6
　Equol nc nc 　Sennoside A nc nc
Flavanones 　Shikonin nc nc
　Naringenin 5.3×104 2.5×10-7 Condensed tannins
　Hesperetin 3.8×104 3.4×10-7 　(+)-Catechin nc nc
　Naringin nc nc 　(-)-Epicatechin nc nc
　Hesperidin nc nc 　(-)-Epigallocatechin nc nc
　(+)-Taxifolin nc nc 　(-)-Epicatechin gallate nc nc
　(+)-Fustin nc nc 　(-)-Epigallocatechin gallate nc nc
　Naringin 4’-O-glucoside nc nc 　Procyanidin B1 nc nc
Flavones 　Procyanidin B2 nc nc
　Apigenin nc nc 　Procyanidin B4 nc nc
　Luteolin nc nc 　Procyanidin C1 nc nc
　Baicalein 2.8×103 4.6×10-6 　Theaflavin nc nc
　Apigetrin nc nc 　Theaflavin3-O-gallate nc nc
　Vitexin nc nc 　Theaflavin 3,3'-di-O-gallate nc nc
　Baicalin 3.2×103 4.1×10-6 Hydrolyzable tannins
　Chrysin 1.4×104 9.3×10-7 　Pentagalloylglucose nc nc
Flavonols 　Pedunculagin nc nc
　Quercetin nc nc 　Tellimagrandin I nc nc
　Kaempferol nc nc 　Geraniin nc nc
　Myricetin nc nc 　Agrimoniin nc nc
　Morin nc nc 　Gemin A nc nc
　Quercitrin nc nc 　Rugosin D nc nc
　Rutin nc nc 　Sanguiin H-6 nc nc
　Isoquercitrin nc nc 　Oenothein B nc nc
　Tiliroside nc nc Others
　Spiraeoside nc nc 　Coumestrol nc nc
Chalcones 　Carnosol nc nc
　Butein nc nc 　Glycyrrhetinic acid nc nc
　Phloretin nc nc 　Glycyrrhizic acid nc nc
　Phloridzin nc nc 　Ginsenoside Rb1
 nc
 nc
Phenolcarboxylic acid and related compounds 　Coumarin
 nc
 nc
　p-Hydroxybenzoic acid nc nc 　Caffeine nc nc
　Caffeic acid nc nc 　Theophylline nc nc
　trans-Ferulic acid nc nc 　Capsaicin nc nc
　trans-Cinnamic acid nc nc 　Piperine nc nc
　p-Coumaric acid nc nc 　β-Sitosterol nc nc
　Gallic acid nc nc 　Ginkgolide A nc nc
　Methyl gallate nc nc 　Lycopene nc nc
　Phloroglucinolcarboxylic acid nc nc 　Limonin nc nc
　Protocatechuic acid nc nc 　β-Carotene nc nc
各試料3回測定．
a) TCDDの最高値を100とした時の25％ルシフェラーゼ活性度と等しい各試料の濃度．
b) TCDDのEC25値に対する各試料のECTCDD25値（1.3×10-2/ ECTCDD25）．
c) Not calculated; ECTCDD25 レベルのルシフェラーゼ活性が認められなかった．

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