ついては、上記通知中、2．検査方法の(2)において示すこととしていた食品中の総アフラトキシンの定量について国立医薬品食品衛生研究所における試験法検討の結果、別添のとおりの試験法が報告されたところであるので、御了知されたい。

なお、食品の多様性等にも配慮の上、当該試験法での試験食品の適用性をⅡに示す性能パラメータのうち選択性及び真度を評価した上で実施するものとする。

今般、国立医薬品食品衛生研究所等の検討において、クルミ、大豆及びケツメイシは多機能カラムを用いた試験法で、ハスの実、ハトムギ、乾燥イチジク及び生コーヒー豆はイムノアフィニティカラムを用いた試験法で良好な結果が得られているので、参考にされたい。

また、本試験法以外の方法による場合は、Ⅱに示す方法により当該試験法の妥当性を評価した上で実施するものとする。

「総アフラトキシンの試験法」

Ⅰ　総アフラトキシン試験法

1．装置

蛍光検出器付き高速液体クロマトグラフ(HPLC―FL)

液体クロマトグラフ・質量分析計(LC―MS)又は液体クロマトグラフ・タンデム型質量分析計(LC―MS／MS)

2．試薬、試液等^1)，2)

次に示すもの以外は、食品、添加物等の規格基準(昭和34年厚生省告示第370号)

第2　添加物の部C試薬・試液等の項に掲げるものを用いる。

アフラトキシンB₁標準品　本品はアフラトキシンB₁98％以上を含む。

アフラトキシンB₂標準品　本品はアフラトキシンB₂98％以上を含む。

アフラトキシンG₁標準品　本品はアフラトキシンG₁98％以上を含む。

アフラトキシンG₂標準品　本品はアフラトキシンG₂98％以上を含む。

アセトニトリル　高速液体クロマトグラフ用に製造されたもの。

水　超純水又は高速液体クロマトグラフ用に製造されたもの。

メタノール　高速液体クロマトグラフ用に製造されたもの。

生理的リン酸緩衝液(PBS)　塩化カリウム0.20g、リン酸二水素カリウム0.20g、リン酸水素二ナトリウム(無水)1.16g(又はリン酸水素二ナトリウム12水和物2.92g)、塩化ナトリウム8.0gを900mLの水に溶解し、0.1mol／L塩酸又は水酸化ナトリウム溶液でpH7.4に調整し、1Lに定容する³⁾。

多機能カラム　逆相樹脂、陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂の混合物を充てんしたもの⁴⁾又はこれと同等の分離特性を有するもの。

イムノアフィニティカラム　アフラトキシン特異抗体を結合させた樹脂を充てんしたもの⁵⁾又はこれと同等の分離特性を有するもの。

ろ紙　粒子保持能1～2.5μm⁶⁾又は7～25μm⁷⁾のセルロース繊維のもの。

ガラス繊維ろ紙　粒子保持能1～1.5μmのホウケイ酸ガラス繊維のもの。

3．試験溶液の調製

(1)　多機能カラムを用いた調製

本法は、穀類、豆類及び種実類に適用できる。

①　抽出

粉砕均一化した試料50.0gにアセトニトリル及び水(9：1)混液200mLを加え、ホモジナイズした後⁸⁾、ろ過し⁹⁾、ろ液を抽出溶液とする。

②　精製

抽出溶液約5mLを多機能カラムに静かに注入し、毎分約1mLの流速で流出し、最初の溶出液2.0mL¹⁰⁾を採る。

③　誘導体化

溶出液を45℃以下で窒素気流を用いて濃縮し、溶媒を除去する¹¹⁾。この残留物にトリフルオロ酢酸0.1mLを加え、密栓して激しく撹拌する。暗所で15分間放置した後、アセトニトリル及び水(1：9)混液0.9mLを加えてよく混合したものを試験溶液^12)，13)とする。

(2)　イムノアフィニティカラムを用いた調製

本法は、香辛料(とうがらし、パプリカ等)や加工食品、その他多機能カラムでは精製が不十分な試料に適用できる。

①　抽出

粉砕均一化した試料50.0gに塩化ナトリウム5gと水及びメタノール(1：4)混液200mLを加え、ホモジナイズした後⁸⁾、ろ過する⁹⁾。ろ液10.0mLを量り採り、水を加えて正確に50.0mLとする¹⁴⁾。十分混合した後、ガラス繊維ろ紙を用いてろ過し、ろ液を抽出溶液とする¹⁵⁾。

②　精製

抽出溶液10.0mL¹⁶⁾をイムノアフィニティカラムに注入¹⁷⁾した後、毎秒約1～2滴の流速で流出し、流出液は捨てる。次いで、水約10mLを注入し、流出液を捨てた後¹⁸⁾、アセトニトリル3mLを注入し、溶出液を採る^19)，20)。

③　誘導体化

溶出液を45℃以下で窒素気流を用いて濃縮し、溶媒を除去する¹¹⁾。この残留物にトリフルオロ酢酸0.1mLを加え、密栓して激しく撹拌する。暗所で15分間放置した後、アセトニトリル及び水(1：9)混液0.9mLを加えよく混合したものを試験溶液^12)，13)とする。

4．検量線の作成

各アフラトキシン標準品の0.5～10μg／L溶液(アセトニトリル)を数点調製し、それぞれ1.0mLを採り、45℃以下で窒素気流を用いて溶媒を除去する。残留物にトリフルオロ酢酸0.1mLを加え、密栓して激しく撹拌し、暗所で15分間放置した後、アセトニトリル及び水(1：9)混液0.9mLを加えてよく混合する。それぞれ20μLをHPLCに注入し²¹⁾、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

5．定量

試験溶液20μLをHPLCに注入し²¹⁾、4で得られた検量線により小数第2位まで各アフラトキシンの分析値を求める。それぞれの値について小数第2位を四捨五入し、得られた値を合算し、さらに小数第1位を四捨五入して総アフラトキシンの定量値とする。

6．確認試験

3(1)②で得られた多機能カラムからの溶出液2.0mL又は3(2)②で得られたイムノアフィニティカラムからの溶出液全量を採り、45℃以下で窒素気流を用いて溶媒を除去した後、移動相1.0mLに溶解し、LC―MS又はLC―MS／MSに注入して確認する²²⁾。

7．測定条件例

検出器：FL(励起波長365nm、蛍光波長450nm)

カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル　内径4.6mm、長さ150mm又は250mm、粒径3～5μm

カラム温度：40℃

移動相：アセトニトリル、水及びメタノール(1：6：3)混液²³⁾

流速：1.0mL／min

8．定量限界

アフラトキシンB₁　1.0μg／kg　アフラトキシンB₂　1.0μg／kg

アフラトキシンG₁　1.0μg／kg　アフラトキシンG₂　1.0μg／kg

――――――――――

＜注解＞

1)　アフラトキシンは強い発がん性を有する物質であるため、取扱いに注意すること。なお、試験に用いた器具、前処理用カラム、検体等は、廃棄又は洗浄する前に、0.5―1.0％(v／v)濃度の次亜塩素酸ナトリウムに2時間以上浸漬すること。

2)　正確に濃度調製された市販標準溶液(各アフラトキシン濃度が同じもの)が使用可能である。また、各アフラトキシン結晶品からの標準溶液の調製方法として、AOAC掲載の方法　(Mary W.Trucksess：Official Methods of Analysis of AOAC International(18^thEdition)Chapter 49,p.3-5,2005)が有用である。調製方法の例を以下に示す。

正確に1.0mgの秤量が保証されたもの又は正確に1.0mgを秤量したアフラトキシンB₁、B₂、G₁又はG₂にアセトニトリル50mLを加え、激しく撹拌し、標準原液(各20mg／L)とする。標準原液は密栓し、アルミニウム箔で覆い冷蔵庫中に保存する。

各アフラトキシン標準原液0.5mLずつを採り、正確にアセトニトリルで200mLとし、混合標準原液(各50μg／L)を調製する。その混合標準原液1.0mLを採り、アセトニトリルで20.0mLとし、混合標準溶液(各2.5μg／L)を調製する。

3)　市販の錠剤が使用可能である。

4)　市販のカラムが使用可能である。コンディショニングを行わずそのまま用いる。使用するカラムによって溶出パターンが異なるので、標準溶液を用いて事前に溶出量を確認すること。

5)　市販のカラムが使用可能である。なお、使用前にカラム中のゲルに亀裂や気泡が生じていないことを確認し、亀裂や気泡が生じている場合には、カラム上部から注射器等で圧力を加えて除去すること。

6)　多機能カラムを用いた調製を行う場合に使用する。

7)　イムノアフィニティカラムを用いた調製を行う場合に使用する。

8)　5分間ホモジナイズ又は30分間振とうしてもよい。

9)　遠心分離して、その上澄液を用いてもよい。

10)　多機能カラム精製では、夾雑物はカラムに保持されて遅れて溶出し、アフラトキシンはカラムに保持されず常に一定の濃度で溶出することから、初期溶出液2mL程度が最も精製度が高い。カラムからの最初の溶出液を2.2mL程度採り、これを抽出溶液として、その2.0mL(試料0.5g相当)を量り採る。

11)　溶出液から溶媒を除去する際にアフラトキシンが容器に吸着することがある。この場合、シラン処理した容器(使用前に20～30％アセトニトリル水等で洗浄し、乾燥させたもの)を用いることが望ましい。

12)　アフラトキシンB₁及びアフラトキシンG₁の蛍光強度を増加させるために、それぞれ水酸化体にする。なお、アフラトキシンB₂及びアフラトキシンG₂は誘導体化されない。

トリフルオロ酢酸による誘導体化法のほかに、フォトケミカルリアクターによる誘導体化法(PR法，Joshua,H.et al.:J.chromatogr A.,654,247-254,1993)や電気化学的誘導体化法(KC法，Kok,W.T.et al.:J.Chromatogr.,367,231-236,1986,Papadopoulou-Bouraoui,A.et al.:J.AOAC Int.,85,411-416,2002)も応用可能である。PR法はポストカラムで紫外線照射により生成するアフラトキシンB₁及びアフラトキシンG₁の水酸化体を、KC法はポストカラムで電気化学的に生ずる臭素により生成するアフラトキシンB₁及びアフラトキシンG₁の臭素誘導体を測定する簡便な手法である。いずれもポストカラム反応であるため、高速液体クロマトグラフィーにおけるアフラトキシンの溶出順序がトリフルオロ酢酸によりプレカラムで誘導体化した場合と異なり、G₂、G₁、B₂、B₁の順となる。PR法及びKC法の場合、トリフルオロ酢酸による反応を行わないため、イムノアフィニティカラムからの溶出液全量又は多機能カラムからの溶出液2.0mLを採り、45℃以下で窒素気流を用いて溶媒を除去し、残留物をアセトニトリル及び水混液(1：9)1mLで溶解したものを試験溶液とする。溶解に用いるアセトニトリル及び水混液の比率は変更可能であるが、各アフラトキシンのピーク形状及び分離に留意し、HPLCへの注入量を変更する必要がある。アセトニトリル及び水混液の比率が1：9の場合には100μL以下、1：1の場合には30μL以下とする。なお、多機能カラムからの溶出液を直接HPLCに注入することもできるが、アセトニトリル及び水混液の比率が9：1であるため、注入量は10μL以下とする。また、HPLC注入用の容器として、ガラス製品を用いるとシラン処理を行った容器においてもアフラトキシンが吸着することがあるため、ポリプロピレン製等の樹脂製の容器を用いるとよい。PR法及びKC法の測定条件の例を以下に示す。

＜PR法＞

検出器：FL(励起波長365nm、測定波長450nm)

カラム：オクタデシルシリル化シリカゲルカラム(内径4.6mm、長さ150又は250mm、粒径3～5μm)

カラム温度：40℃

移動相：水及びメタノール(3：2)混液

流速：0.7mL／min

PR反応システム：245nm低圧水銀灯(15W)照射システム

反応コイル：内径0.25mm、長さ15～20m

注入量：10～100μL

＜KC法＞

検出器：FL(励起波長365nm、測定波長450nm)

カラム：オクタデシルシリル化シリカゲルカラム(内径4.6mm、長さ150又は250mm、粒径3～5μm)

カラム温度：40℃

移動相：水及びメタノール(3：2)混液(1Lにつき臭化カリウム119mg及び4mol／L硝酸350μLを加える)

流速：1.0mL／min

KC反応システム：100μA電流

注入量：10～100μL

13)　必要に応じて、遠心処理等で不溶物を除去後、HPLC用試験溶液とする。

14)　白コショウ等の香辛料において、水希釈時に発生する沈殿物にアフラトキシンが吸着し、回収率が低下することがある。この場合、ろ過後ポリソルベート20を含む水又はPBSで希釈する方法が有効である。なお、1機関の結果であるが、白コショウについては8％(w／v)ポリソルベート20を含む水で希釈する方法が適用できることが確認されている。

ナツメグ等の香辛料、カカオ豆やその加工品、綿実、生ゴマ等において、水及びメタノール混液を用いた抽出では、アフラトキシンの回収率が70％を下回る場合がある。この場合、塩化ナトリウムを加えずにアセトニトリル、水(9：1)で抽出し、ろ過後ポリソルベート20を含む水又はPBSで希釈する方法が有効である。上清が2層に分離する食品においては、アセトニトリル、水及びメタノール(6：4：1)混液を用いての抽出が有効であることが報告されている(Itoh,A.et al.:Mycotoxins,58,7-13,2008)。希釈は、使用するイムノアフィニティカラムの耐溶媒性を考慮して行う。これらの方法を行う前にはそれぞれの機関で、かならずⅡ．妥当性評価の方法に準じて、その妥当性を確認すること。また、希釈倍率を変更した場合には、試料量として0.5g相当の抽出溶液をイムノアフィニティカラムに注入する必要がある。

15)　ろ液を水で希釈すると沈殿が生じることがある。これを直接イムノアフィニティカラムに注入するとカラムが詰まることがあるため、ガラス繊維ろ紙を用いてろ過する。

16)　抽出溶液10.0mLは試料0.5gに相当する。

17)　イムノアフィニティカラムの下部にストップコックを取り付け、これをバキュームマニホールド等に連結し、カラム内の溶液を全部流出させた後、カラム内にPBSを満たし全量を流出させ、カラムのコンディショニングを行う。その後、カラム内にPBSを満たし、カラム容量の約半分の量のPBSを流出させた後、ストップコックを閉め、リザーバー又は注射筒をコネクターを用いてカラムと連結する。

18)　洗浄する時にはストップコックで流速を調節する必要はない。また洗浄する際には、リザーバーをカラムから取り外した後、カラム内をピペット等を用いて水で満たし、その全量を排出させる操作を3回ほど繰り返すことが有効である。

19)　アセトニトリル1mLをカラムに注入し、自然落下で溶出させた後5分間放置する。さらにアセトニトリル1mLをカラムに注入し溶出する。この操作をもう一度繰り返した後、注射器にリザーバーコネクターを取り付けたものを用意し、これをカラム上部に連結し、空気を押し出すことによりカラム中ゲル内のアセトニトリルを溶出する。

20)　試料によっては、抽出溶液をイムノアフィニティカラムに注入後、水による洗浄でカラム内ゲルの着色が取り除けず、その後の定量に影響を与えることがある。この場合、0.01％(w／v)ポリソルベート20を含むPBS及び水それぞれ10mL以上で順次洗浄した後、アセトニトリルで溶出することが有効である。

21)　検出器の性能により、注入量を変更してもよい。

22)　LC―MS又はLC―MS／MSの測定条件の例を以下に示す。

カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル(内径2.1mm、長さ150mm、粒径3～5μm)

カラム温度：40℃

移動相：10mmol／L酢酸アンモニウム及びメタノール(3：2)混液

流速：0.2mL／min

注入量：5～10μL

イオン化モード：ESI(＋)

検出イオン(m／z)：

＜LC―MS＞

アフラトキシンB₁　313

アフラトキシンB₂　315

アフラトキシンG₁　329

アフラトキシンG₂　331

＜LC―MS／MS＞

アフラトキシンB₁　プリカーサーイオン313、プロダクトイオン241、213

アフラトキシンB₂　プリカーサーイオン315、プロダクトイオン259、287

アフラトキシンG₁　プリカーサーイオン329、プロダクトイオン243、200

アフラトキシンG₂　プリカーサーイオン331、プロダクトイオン245、189

保持時間の目安：

アフラトキシンB₁　11.0分

アフラトキシンB₂　8.7分

アフラトキシンG₁　6.9分

アフラトキシンG₂　5.5分

これら条件を用いて、LC―MS又はLC―MS／MSにより各アフラトキシンを定量することもできる。定量に際しては、内標準物質の添加又はブランク試料溶液を用いた検量線の作成等、定量性を十分確保して行う。また、HPLC注入用の容器として、ガラス製品を用いるとシラン処理を行った容器においてもアフラトキシンが吸着することがあるため、ポリプロピレン製等の樹脂製の容器を用いるとよい。

23)　各アフラトキシンのピークの形状又は分離が一定とならない場合には、移動相に最終濃度として10mmol／Lとなるように酢酸アンモニウム緩衝液(pH5.0)を加えるとよい。

Ⅱ　妥当性評価の方法

食品毎に、アフラトキシン(B₁、B₂、G₁及びG₂)を含まない試料(ブランク試料)に各アフラトキシン(B₁、B₂、G₁及びG₂)を添加した試料(添加試料)を、試験法に従って試験し、その結果から以下の性能パラメータを求め、それぞれ表に示す目標値等に適合していることを確認する。添加濃度は、原則として各アフラトキシンにつき2.5μg／kgとする。

なお、各パラメータの定義及び評価の手順は、「食品中に残留する農薬等に関する試験法の妥当性評価ガイドライン」(平成19年11月15日付け食安発第1115001号別添)に準じるものとする。

1．選択性

ブランク試料を試験法に従って試験し、定量を妨害するピークがないことを確認する。

妨害ピークを認める場合は、妨害ピークの面積(又は高さ)が、各アフラトキシン濃度1.25μg／Lに相当するピークの面積(又は高さ)と比較し1／10未満であることを確認する。

2．真度(回収率)

同一濃度の添加試料5個以上を試験法に従って試験し、得られた定量値の平均値の添加濃度に対する比率を求め、真度を評価する。

3．精度

添加試料の試験を繰り返し、得られた定量値の標準偏差及び相対標準偏差を求め、併行精度及び複数の実施者又は実施日による室内精度を評価する。

＜表　真度及び精度の目標値＞

＊自由度4以上とする。