2．装置

可視分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ(HPLC―VIS)

液体クロマトグラフ・質量分析計(LC／MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の2に示すものを用いる。

アセトニトリル　液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。

水　液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。

ギ酸アンモニウム　ギ酸アンモニウム(特級)

クエン酸・リン酸緩衝液(pH3.0)

第1液：クエン酸57.6gを量り、水を加えて溶かして1,000mLとする。

第2液：リン酸三ナトリウム228gを量り、水を加えて溶かして1,000mLとする。

第1液に第2液を加えて混和し、pHを3.0に調整する。

クリスタルバイオレット標準品　本品はクリスタルバイオレット(C₂₅H₃₀ClN₃：407.98)94％以上を含み、融点は215℃である。

メチレンブルー標準品　本品はメチレンブルー(C₁₆H₁₈N₃SCl：319.85)97％以上を含み、融点は169～170℃である。

4．試験溶液の調製

試料5.00gを量り採り、クエン酸・リン酸緩衝液(pH3.0)10mLを加えて5分間細砕する。これにアセトニトリル40mLを加え、振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、毎分2,600回転で5分間遠心分離し、アセトニトリル―水層を分液ロートに採る。残留物にアセトニトリル20mLを加え、上記と同様に操作し、得られたアセトニトリル層を先の分液ロートに合わせる。これにn―ヘキサン80mLを加えて激しく振り混ぜた後、静置し、アセトニトリル層を採る。これに20％塩化ナトリウム溶液50mL及びジクロロメタン50mLを加えて5分間振とうした後、静置し、アセトニトリル―ジクロロメタン層を採る。

これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過し、40℃以下でアセトニトリル―ジクロロメタン層を除去する。この残留物にアセトニトリル2.0mLを加えて溶かし、これを試験溶液とする。

5．検量線の作成

各標準品の10mg／100mLメタノール溶液を調製し、アセトニトリル及び0.01mol／Lギ酸アンモニウム溶液(1：9)混液で希釈して0.0125～0.5mg／Lの標準溶液を数点調製する。それぞれHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

6．定量

試験溶液をHPLCに注入し、5の検量線で各物質の含量を求める。

7．確認試験

LC／MSにより確認する。

8．測定条件

HPLC

検出器：VIS(測定波長636nm)

カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル　内径2.0～6.0mm、長さ100～250mm、粒子径2～5μm

カラム温度：40℃

移動相：アセトニトリル及び0.01mol／Lギ酸アンモニウム溶液の混液(1：9)から(1：0)までの濃度勾配を20分間で行い、(1：0)で10分間保持する。

保持時間の目安：12分(メチレンブルー)

9．定量限界

クリスタルバイオレット　0.005mg／kg

メチレンブルー　0.005mg／kg

10．留意事項

1)　試験法の概要

クリスタルバイオレット及びメチレンブルーを試料からアセトニトリル及びクエン酸・リン酸緩衝液(pH3.0)で抽出し、ジクロロメタンに転溶した後、HPLC―VISで測定し、LC／MSで確認する方法である。

2)　注意点

①　ジクロロメタン転溶の際に溶媒が乳化する場合は、遠心分離等により層を完全に分離すること。

②　HPLC―VIS及びLC／MSにおける標準溶液及び試験溶液の標準的な注入量は、内径3.0mmのカラムにおいて10μLであるが、カラム及び装置により最適な注入量が異なる場合があるので、必要に応じて最適注入量を検討すること。

③　LC／MSにおける測定条件は用いる装置により、最適なイオン化方法、生成するイオンが異なる場合があるので、装置ごとに最適条件を検討すること。

11．参考文献

春日ら、食品衛生学雑誌、32,137(1991)

12．類型

C

セファゾリン、セファピリン、セファレキシン、セファロニウム、セフォペラゾン及びセフロキシム試験法(畜水産物)

1．分析対象化合物

2．装置

液体クロマトグラフ・質量分析計(LC／MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の2に示すものを用いる。

アセトニトリル　液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。

水　液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。

メタノール　液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。

ジビニルベンゼン―N―ビニルピロリドン共重合体ミニカラム(60mg)　内径12～13mmのポリエチレン製のカラム管にジビニルベンゼン―N―ビニルピロリドン共重合体60mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離特性を有するものを用いる。

セファゾリンナトリウム標準品　本品はセファゾリンナトリウム97％以上を含む。

セファピリンナトリウム標準品　本品はセファピリンナトリウム90％以上を含む。

セファレキシン標準品　本品はセファレキシン99％以上を含む。

セファロニウム標準品　本品はセファロニウム98％以上を含む。

セフォペラゾンナトリウム標準品　本品はセフォペラゾンナトリウム95％以上を含む。

セフロキシムナトリウム標準品　本品はセフロキシムナトリウム99％以上を含む。

4．試験溶液の調製

1)　抽出

①　筋肉の場合

試料5.00gを量り採り、メタノール及び0.2％メタリン酸溶液(3：7)混液100mLを加えて細砕した後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にメタノール及び0.2％メタリン酸溶液(3：7)混液20mLを加えてかき混ぜた後、上記と同様に操作して、ろ液を合わせ、40℃以下で約30mLに濃縮する。

②　脂肪の場合

試料5.00gを量り採り、n―ヘキサン30mL及び0.2％メタリン酸溶液70mLを加えて細砕した後、毎分3,000回転で5分間遠心分離し、0.2％メタリン酸溶液層を採る。

③　肝臓、腎臓、乳及びその他の食用部分の場合

試料5.00gを量り採り、メタノール及び0.2％メタリン酸溶液(3：7)混液100mLを加えて細砕し、ケイソウ土3gを加えて混和した後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にメタノール及び0.2％メタリン酸溶液(3：7)混液20mLを加えてかき混ぜた後、上記と同様に操作して、ろ液を合わせ、40℃以下で約30mLに濃縮する。

2)　精製

ジビニルベンゼン―N―ビニルピロリドン共重合体ミニカラム(60mg)に、メタノール5mL及び水5mLを順次注入し、流出液は捨てる。このカラムに1)で得られた溶液を注入した後、水5mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムにメタノール5mLを注入し、溶出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り、40℃以下でメタノールを除去する。この残留物に水及びメタノール(7：3)混液1.0mLを加えて溶かし、これを試験溶液とする。

5．検量線の作成

セファロニウム標準品は10mgを水3mLに溶解後、メタノールを加えて100mLとする。その他の各標準品は10mg／100mLメタノール溶液を調製する。これらを水及びメタノール(7：3)混液で希釈して0.05～5mg／Lの標準溶液を数点調製する。それぞれLC／MSに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

6．定量

試験溶液をLC／MSに注入し、5の検量線で各物質の含量を求める。

7．確認試験

LC／MSにより確認する。

8．測定条件

LC／MS

カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル　内径2.0～6.0mm、長さ100～250mm、粒子径2～5μm

カラム温度：40℃

移動相：アセトニトリル及び0.01％ギ酸溶液の混液(1：19)から(1：1)までの濃度勾配を20分間で行う。

主なイオン(m／z)：

セファゾリン　ESI＋において455

セファピリン　ESI＋において424

セファレキシン　ESI＋において348

セファロニウム　ESI＋において459

セフォペラゾン　ESI＋において646又はESI－において644

セフロキシム　ESI－において423

保持時間の目安：10分(セファピリン)

9．定量限界

各分析対象化合物について0.01mg／kg

10．留意事項

1)　試験法の概要

セファゾリン、セファピリン、セファレキシン、セファロニウム、セフォペラゾン及びセフロキシムを試料からメタノール及び0.2％メタリン酸溶液の混液、または、0.2％メタリン酸溶液で抽出し、ジビニルベンゼン―N―ビニルピロリドン共重合体ミニカラムで精製した後、LC／MSで測定及び確認する方法である。

2)　注意点

①　LC／MSにおける標準溶液及び試験溶液の標準的な注入量は、内径3.0mmのカラムにおいて10μLであるが、カラム及び装置により最適な注入量が異なる場合があるので、必要に応じて最適注入量を検討すること。

②　LC／MSにおける測定条件は用いる装置により、最適なイオン化方法、生成するイオンが異なる場合があるので、装置ごとに最適条件を検討すること。

11．参考文献

なし

12．類型

C