図1．トレイのレイアウト

↓プレートにシールし、37℃恒温漕に重しをして沈めて2時間以上置く。

3)　PBS―Tでプレートを3回洗浄する。

4)　表6．に示したようにプローブの調製を行い、98℃、5分間加熱処理、直ちにon iceする。

表6．プローブの調製(1検体当たり)

^注8サケDNA：DNA量10mg／mlのものをT₁₀E₁で100μg／mlに希釈したもの

5)　表7．に示したようにハイブリダイゼーション液を調整し、4)のプローブ・サケ精子DNA混合液と合わせる。

表7．ハイブリダイゼーション液(1検体当たり)^注9)

^注9：ハイブリダイゼーション液は使用前に冷やしておく。

6)　5)の混合液を各ウエルに100μlずつ入れる。

7)　シールのプレート側を内側にして巻き込むように剥がす(マイクロプレート内のDNAを撒き散らさないように包み込む)。45℃に温めておいたPBS―Tで3回洗浄する。プレート洗浄時にはプレートをペーパータオル等で包み、その後叩き水分を完全に除くと同時にDNAを周りに撒き散らさないように細心の注意を払う。使用したペーパータオル、洗浄液等は1,000ppm濃度の次亜塩素酸ソーダに漬ける。

ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ(1％BSA＋PBS－Tで適宜希釈したものを全てのウェルに100μl入れる。ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼを入れた容器は使用後廃棄するか高圧滅菌し、酵素を不活化する。

↓室温1時間置く(軽く振とうするとよい)。

8)　プレートをPBS―Tで5回洗浄する。

9)　全てのウエルに発色液^注10)を100μl入れる。

^注10)：TMB 1mg、DMSO 1ml、phosphate-citrate buffer 9ml(0.2M リン酸水素二ナトリウム25.7ml、0.1Mクエン酸24.3ml、DDW 50ml、pH5.0)を作製し、30％過酸化水素水2μlを使用直前に入れる。

↓室温15分間(プレートは遮光しておく)。

10)　停止液(4N　硫酸)を50μl入れる。

11)　450nmで吸光度を測定する。

12)　判定：コントロールに比べOD値が2倍以上、かつ0.2以上の差が認められた時に陽性とする。

B．ドット・ハイブリダイゼーションイン法

この方法はメンブレンにDNAを吸着させて行う方法である。他のウイルスでは一般的にこの方法で行われている。

1．必要な器具と試薬

1)　器具

恒温水槽、ハイブリダイゼーションインキュベーター、トランスイルミネーター、ヒートシーラ、ポジティブチャージナイロンメンブレン：Nylon menbranes,positively charged　ベーリンガー　Cat.No.1209272、ハイブリダイゼーションバッグ：ニッポンジーン，Cat.No.533―19171、タッパー：井内Code.No.45―068―022)

2)　試薬

塩化ナトリウム(NaCl)、濃塩酸、DDW、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、マレイン酸、塩化マグネシウム(MgCl₂)、

20×SSC:NaCl　100gを900mlの蒸留水に溶解(68℃)し、濃塩酸でpH7.2に調整後、DDWで，1000mlとする。

10％　SDS:SDS　100gを900mlのDDWに溶解(68℃)し、濃塩酸でpH7.2に調整後、蒸留水を加え全量を1000mlとする。

N―Lauroylsarcosine:SIGMA,Cat.No.L―5777

ホルムアミド：Wako,Cat.No.068―00426

Blocking reagent：ベーリンガーCat.No.1096176

NBT／BCIP：ベーリンガーCat.No.1681451

Buffer1：0.1Mマレイン酸；0.15MNaCl(pH7.5，20℃)pHの調整はpH6.5くらいまで固形NaOH(8.5g)で、それ以降は1N NaOHを加えて調整する。

洗浄Buffer:Buffer 1に0.3％となるようにTween 20を加える。

ブロッキング溶液：Buffer 1でBlocking reagentを1％とする。

検出溶液：100mM　Tris―HCl；100mM NaCl(pH9.5，20℃)10mlに2.5M MgCl₂を200μl加える(最終濃度50mM MgCl₂)。

Streptavidin Alkaline Phosphatase:Promega,Cat.No.V5591

ビオチン標識プローブ：プローブにビオチンを標識したもの。

2．操作法

1)　アガロースゲル電気泳動でHAV陽性バンドが認められた部分からDNAを抽出後、100℃で5分間熱変成し、その1μlをナイロンメンブレンにスポットし風乾する(II．A．2ゲルからDNA抽出を参照)。

2)　トランスイルミネーター上でスポットした面を下にして3分間UV照射する。それをハイブリダイゼーションする。

3)　溶液量は、約20cm2のメンブレンで計算してあるので、メンブレンの面積によって以後適宜調整する。

4)　ハイブリダイセーション液(表8)5mlにビオチン標識プローブを50μl(200ng／ml)加えプローブ溶液を調整し、沸騰水中で5分間(98℃、5分間)、加熱しプローブ溶液を調整する。

適量のプローブ溶液(2～5ml)をメンブレンの入っているバックに加え、バッグ中から気泡を追い出した後ヒートシーラでシールする。

5)　42℃の恒温水槽中で6時間～一夜ハイブリダイゼーションする。

表8．ハイブリダイゼーション溶液

6)　バッグからメンブレンを取り出し、タッパーに移し0.1％SDSを含む2×SSC(表8参照)20mlで5分間、室温で2回洗浄する。その後、0.1％SDSを含む0.1×SSC(表9参照)20mlで15分間、42℃で2回洗浄する。

使用したプローブ溶液は、数回使用できるので、捨てずに取っておく。使用前には、沸騰水中で5～10分間熱変成する。0.1％SDSを含む0.1×SSCは、あらかじめハイブリダイゼーション温度と同じ温度に温めておく。

表9．洗浄液の組成

7)　メンブレンを20mlのBuffer 1に10％　Tween 20を600μl加えたBufferで1分間洗浄する。

8)　ブロッキング溶液20mlで30分間、室温でインキュベートする。

9)　ブロッキング溶液200mlでStreptavidin Alkaline Phosphataseを5,000倍希釈した溶液20mlにメンブレンを浸漬し、30分間室温でインキュベートする。

10)　洗浄Buffer 25mlで15分間室温2回洗浄する。

11)　検出溶液20mlで2分間、平衡化のためインキュベートする。

12)　検出溶液5mlにNBT／BCIP　stock溶液100μlを加え、発色基質溶液を調整する。加えるstock溶液は50μlでも行える。

13)　検出溶液で平衡化したメンブレンをハイブリダイゼーションバッグに移し、発色基質溶液を3～5ml加え、気泡を追い出した後ヒートシーラでシールする。発色するまで静置する。発色中は、振とうしたり攪拌したりしない。

14)　発色が確認できたら、メンブレンをTE Buffer 30～50mlで5分間洗浄して、反応を停止させる。

3．判定

スポットが紫色に染色されたものを陽性とする。判定は必ずゲルの陰性コントロールと比較して行う。

Ⅲ．リアルタイムPCR法

リアルタイムPCRはRT―PCR法の1st PCRよりも検出感度が良く、PCRにおける増幅産物に蛍光プローブが高い特異性で反応することから、DNAの増殖と定量そしてハイブリダイゼーションが同時に行われ、電気泳動、確認試験も行う必要がなく、短時間で結果が得られるという利点がある。一方、機器、試薬が高価であるという欠点も有する。

ここでは、ABI PRISM 7000(Applied Biosystems)を使った方法を示す。

1．必要な器具と試薬

1)　器具

ABI PRISM7000、マイクロピペット、Micro Amp Optical 96―Well Reaction Plate(ABI Cat.No.N801―0560)、Micro Amp Optical Cap,8caps/strip(ABI Cat.No.4323032)、Micro Amp Base(ABI Cat.No.N801―0531)〔操作方法はMicro Amp Optical Capを使用した場合を記すが、Optical Adhesive Covers(ABI Cat.No.4311971)、Optical Cover Compression pads(ABI Cat.No.4312639)、Adhesive Seal Applicators(ABI Cat.No.4333183)を用いても良い〕

2)　試薬

Taq Man Universal PCR Master Mix(ABI Cat.No.4304437)、Taq Man　プローブ、プライマー、Distilled water｛(Deiorized,Sterile,autoclaved,DNase free、RNasefree)　和光純薬工業　Cat　No.318―90105、(以下「Distilled water」)｝

2．反応プレートの準備

(1)　ふん便および食品からのRNA抽出、cDNAの合成は前項ⅠのA型肝炎ウイルスのRT―PCR法と全く同一の方法で行う。

表10．に示した反応液を調整する。反応液量は食品の時には50μlが望ましい。ふん便材料の時には反応液量35μlあるいは25μl行ってもよい。

表10．反応液の調整

^注11)：プライマー、プローブの配列は図2参照^文献6)

(2)　プレート(Micro Amp Optical 96―Well Reaction Plate)のウェルに45.0μlずつ反応液を入れる。コントロールDNAは3ウェル以上、サンプル、陰性コントロール(NTC:No Template Control)は2ウェル使用する。

(3)　cDNA　5μlを2ウェルずつに加え、蓋(Micro Amp Optical Cap,8caps/strip)を軽く閉める。

(4)　コントロールDNA(10⁷コピー／5μl)を10⁷から10⁰コピーまで10倍階段希釈し、5μlを3ウェルずつに加え、蓋を軽く閉める。

(5)　NTCとしてDDW5μlを2ウェルずつに加え、蓋を軽く閉める。

(6)　プレートをMicro Amp Baseにセットし、蓋をしっかり閉める。

(7)　ウェルの壁についている反応液を遠心して落とす。(遠心機が無い場合はプレートを軽く叩いたり、振り下ろしたりする。

(8)　反応条件を以下のように設定する。

50℃2分、95℃10分を1回、次いで95℃15秒、56℃1分を45回、25℃で保存。

(9)　ランを開始する。

(10)　ランが終了したら、データ解析をする。

(11)　Amplification Plot画面を表示させ、BaselineおよびThreshold Lineを設定する。

(12)　Standard Curveを表示させ、R²が0.990～1であればよい(1に近いほどよい)。

(13)　Report画面を表示させ、下の画面のウェルをハイライト選択し、解析データを表示させる。(コピー数はPlate画面でも確認できる。)

2つのウェルにおいて、実測値10コピー以上で陽性とする。

Ⅳ．参考文献

1．Robertson.H.et al:J Gen Virol.73：1365―1377

2．戸塚敦子：肝炎ウイルス検査法マニュアル、A型肝炎ウイルスRNAのRT―PCR法による検出法

3．藤本嗣人：兵庫県健康環境科学研究センター年報　2：107(2003)

4．Inouye S.et al:J Clin Microbiol　28：1469(1990)

5．西尾治：日本臨床60：1175(2002)

6．西尾治、秋山美穂、加藤由美子：リアルタイムPCR法によるA型肝炎ウイルスの検出について、第76回日本感染症学会抄録P251(2002)

(国立医薬品食品衛生研究所・食品衛生管理部第四室　野田衛)