なお、当該英文版に対応する邦文版を参考として添付いたします。

Heparin Sodium

ヘパリンナトリウム

Add the following next to Description:

Identification Dissolve 1mg each of Heparin Sodium and Heparin Sodium Reference Standard for physicochemical test in 1mL of water,and use these solutions as the sample solution and standard solution,respectively.Perform the test with 20μL each of the sample solution and standard solution as directed under Liquid Chromatography <2.01> according to the following conditions:the retention times for the major peak from the sample solution and the standard solution are identical.

Operating conditions-

Detector,column,column temperature,mobile phase A,mobile phase B,flowing of the mobile phase and flow rate:Proceed as directed under the operating conditions in Purity(6).

System suitability-

System performance:Dissolve 1.0mg of Heparin Sodium Reference Standard for physicochemical test in 0.60mL of water.Dissolve 0.10mg of Over-sulfated Chondroitin Sulfate Reference Standard in 0.20mL of water.Dissolve 1.0mg of dermatan sulfate in 2.0mL of water.To 90μL of the solution of Heparin Sodium Reference Standard add 30μL each of the solutions of over-sulfated chondroitin sulfate and dermatan sulfate,and mix.When the procedure is run with 20μL of the mixture under the above operating conditions,dermatan sulfate,heparin and over-sulfated chondroitin sulfate are eluted in this order with the resolution between the peaks of dermatan sulfate and heparin being not less than 1.0 and that between the peaks of heparin and over-sulfated chondroitin sulfate being not less than 1.5.

Change the Purity(5)to read:

Purity (5) Over-sulfated Chondroitin Sulfate-Dissolve 20mg of Heparin Sodium in 0.60mL of a solution of sodium 3-trimethylsilylpropionate-d₄ for nuclear magnetic resonance spectroscopy in heavy water for nuclear magnetic resonance spectroscopy(1 in 10000).Determine the spectrum of this solution as directed under Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy <2.21> (¹H) in accordance with the following conditions,using sodium 3-trimethylsilylpropionate-d₄ for nuclear magnetic resonance spectroscopy as an internal reference compound:it exhibits no signal corresponding to N-acetyl proton of over-sulfated chondroitin sulfate at δ2.15±0.02ppm,or the signal disappears when determining the spectrum of the sample solution as directed under ¹H with ¹³C-decoupling.

Operation conditions-

Spectrometer:(1)FT-NMR,Not less than 400MHz

Temperature:25℃

Spinning:Off

Number of data points:32,768

Spectral range:Signal of DHO±6.0ppm

Flip angle:90°

Delay time:20 seconds

Dummy scan:4

Number of scans:S/N ratio of the signal of N-acetyl proton of heparin is not less than 1000

Window function:Exponential function(Line broadening factor=0.2Hz)

System suitability-

System performance:Dissolve 20mg of Heparin Sodium Reference Standard for physicochemical test in 0.40mL of a solution of sodium 3-trimethylsilylpropionate-d₄ for nuclear magnetic resonance spectroscopy in heavy water for nuclear magnetic resonance spectroscopy(1 in 10000).Dissolve 0.10mg of Over-sulfated Chondroitin Sulfate Reference Standard in 1.0mL of a solution of sodium 3-trimethylsilylpropionate-d₄ for nuclear magnetic resonance spectroscopy in heavy water for nuclear magnetic resonance spectroscopy(1 in 10000).To the solution of Heparin Sodium Reference Standard for physicochemical test add 0.2mL of the solution of Over-sulfated Chondroitin Sulfate Reference Standard.When determining the spectrum of this solution under the above conditions,it exhibits the signal of N-acetyl proton of heparin and the signal of N-acetyl proton of over-sulfated chondroitin sulfate at δ2.04±0.02ppm and δ2.15±0.02ppm,respectively.

Add the following next to Purity(5)

Purity (6) Related substances-Dissolve 2.0mg of Heparin Sodium in 0.1mL of water,and perform the test with exactly 20μL of this solution as directed under Liquid Chromatography <2.01> according to the following conditions:it exhibits no peaks after the heparin peak.

Operating conditions-

Detector:An ultraviolet absorption photometer(wavelength:202nm).

Column:A stainless steel column 2.0mm in inside diameter and 7.5cm in length,packed with diethylaminoethyl group bound to synthetic polymer for liquid chromatography(10μm in particle diameter).

Column temperature:A constant temperature of about 35℃.

Mobile phase A:Dissolve 0.4g of sodium dihydrogenphosphate dihydrate in 1000mL of water and adjust to a pH of 3.0 with diluted phosphoric acid(1 in 10).

Mobile phase B:Dissolve 0.4g of sodium dihydrogenphosphate dihydrate and 106.4g of lithium perchlorate in 1000mL of water and adjust to a pH of 3.0 with diluted phosphoric acid(1 in 10).

Flowing of the mobile phase:Control the gradient by mixing the mobile phases A and B as directed in the following table.

Flow rate:0.2mL per minute.

Time span of measurement:About 2 times as long as the retention time of heparin,beginning after the solvent peak.

System suitability-

Test for required detectability:Dissolve 10mg of Heparin Sodium Reference Standard for physicochemical test in 0.40mL of water,and use this solution as the Heparin Sodium standard stock solution.Separately,dissolve 0.10mg of Over-sulfated Chondroitin Sulfate Reference Standard in 0.20mL of water,and use this solution as the over-sulfated chondroitin sulfate standard solution.To 60μL of the Heparin Sodium standard stock solution add 3μL of the over-sulfated chondroitin sulfate standard solution and 12μL of water,and mix.When the procedure is run with 20μL of the mixture under the above operating conditions,it exhibits a peak for over-sulfated chondroitin sulfate.

System performance:To 120μL of the Heparin Sodium standard stock solution add 30μL of the over-sulfated chondroitin sulfate standard solution,mix and use this solution as the solution for system suitability test.When the procedure is run with 20μL of the solution for system suitability test under the above operating conditions,heparin and over-sulfated chondroitin sulfate are eluted in this order with the resolution between these peaks being not less than 1.5.

System repeatability:When the test is repeated 6times with 20μL of the solution for system suitability test under the above operating conditions,the relative standard deviation of the peak area of over-sulfated chondroitin sulfate is not more than 2.0％.

Purity (7) Galactosamine-Dissolve 2.4mg of Heparin Sodium in 1.0mL of water and hydrochloric acid(7:5),and use this solution as the Heparin Sodium stock solution.Dissolve 8.0mg of D-glucosamine hydrochloride in water and hydrochloric acid(7:5)to make exactly 10mL.Dissolve 8.0mg of D-galactosamine hydrochloride in water and hydrochloric acid(7:5)to make exactly 10mL.To 99 volumes of the solution of D-glucosamine add 1 volume of the solution of D-galactosamine,and use this solution as the standard stock solution.Transfer 500μL each of the Heparin Sodium stock solution and the standard stock solution to a glass-stoppered test tube,stopper tightly,and heat at 100℃ for 6hours.After cooling to room temperature,evaporate 100μL each of the reaction solutions to dryness.Add 50μL of methanol to each of the residues and evaporate to dryness at room temperature.Dissolve each of the residues in 10μL of water,add 40μL of aminobenzoate derivatization TS,and heat at 80℃ for 1 hour.After cooling to room temperature,evaporate the reaction solutions to dryness.Add 200μL each of water and ethyl acetate to each of the residues,shake vigorously,and then centrifuge.After remove the upper layers,add 200μL of ethyl acetate to each of the lower layers,shake vigorously,and then centrifuge.These lower layers are used as the sample solution and standard solution.Perform the test with 5μL each of the sample solution and standard solution as directed under Liquid Chromatography <2.01> according to the following conditions:the peak area ratio of galactosamine to glucosamine of the sample solution is not larger than that of the standard solution.

Operating conditions-

Detector: A fluorescence photometer (excitation wavelength: 305nm; emission wavelength:360nm).

Column:A stainless steel column 4.6mm in inside diameter and 15cm in length,packed with octadecylsilanized silica gel for liquid chromatography(3μm in particle diameter).

Column temperature:A constant temperature of about 45℃.

Mobile phase:To 100mL of water and trifluoroacetic acid(1000:1)add 100mL of acetonitrile.Add 140mL of the solution to 860mL of water and trifluoroacetic acid(1000:1).

Flow rate:1.0mL per minute.

Time span of measurement:About 50minutes after injected.

System suitability-

Test for required detectability:Dissolve 8.0mg of D-mannosamine hydrochloride in 10mL of water and hydrochloric acid(7:5),and use this solution as the mannosamine standard solution.Transfer 500μL of the standard stock solution and the mannosamine standard solution(100:1)to a glass-stoppered test tube,stopper tightly,and heat at 100℃ for 6hours.After cooling this solution to room temperature,evaporate 100μL of the reaction solution to dryness.Add 50μL of methanol to the residue and evaporate to dryness at room temperature.Dissolve the residue in 10μL of water,add 40μL of the ethyl aminobenzoate derivatization TS,and heat at 80℃ for 1 hour.After cooling this solution to room temperature,evaporate the reaction solution to dryness.Add 200μL each of water and ethyl acetate to the residue,shake vigorously,and then centrifuge.After remove the upper layer,add 200μL of ethyl acetate to the lower layer,shake vigorously,and then centrifuge.The lower layer is used as the solution for system suitability test.When the procedure is run with 5μL of the solution for system suitability test under the above operating conditions,the ratio of the peak area of galactosamine to that of glucosamine is 0.7―2.0％.

System performance:When the procedure is run with 5μL of the solution for system suitability test under the above operating conditions,glucosamine,mannosamine and galactosamine are eluted in this order with the resolution each between the peaks of glucosamine and mannosamine and between the peaks of mannosamine and galactosamine being not less than 1.5.

System repeatability:When the test is repeated 6times with 5μL of the solution for system suitability test under the above operating conditions,the relative standard deviation of the ratio of the peak area of galactosamine to that of glucosamine is not more than 4.0％.

Heparin Calcium

ヘパリンカルシウム

Change the Identification(2)to Identification(3)and add the following next to Identification(1)

Identification (2) Dissolve 1mg each of Heparin Calcium and Heparin Sodium Reference Standard for physicochemical test in 1mL of water,and use these solutions as the sample solution and standard solution,respectively.Perform the test with 20μL each of the sample solution and standard solution as directed under Liquid Chromatography <2.01> according to the following conditions:the retention times for the major peak from the sample solution and the standard solution are identical.

Operating conditions-

Detector,column,column temperature,mobile phase A,mobile phase B,flowing of the mobile phase and flow rate:Proceed as directed under the operating conditions in Purity(9).

System suitability-

System performance:Dissolve 1.0mg of Heparin Sodium Reference Standard for physicochemical test in 0.60mL of water.Dissolve 0.10mg of Over-sulfated Chondroitin Sulfate Reference Standard in 0.20mL of water.Dissolve 1.0mg of dermatan sulfate in 2.0mL of water.To 90μL of the solution of Heparin Sodium Reference Standard add 30μL each of the solutions of Over-sulfated Chondroitin Sulfate Reference Standard and dermatan sulfate,and mix.When the procedure is run with 20μL of the mixture under the above operating conditions,dermatan sulfate,heparin and over-sulfated chondroitin sulfate are eluted in this order with the resolution between the peaks of dermatan sulfate and heparin being not less than 1.0 and that between the peaks of heparin and over-sulfated chondroitin sulfate being not less than 1.5.

Change the Purity(8)to read:

Purity (8) Over-sulfated Chondroitin Sulfate-Dissolve 20mg of Heparin Calcium in 0.60mL of a solution of sodium 3-trimethylsilylpropionate-d₄ for nuclear magnetic resonance spectroscopy in heavy water for nuclear magnetic resonance spectroscopy(1 in 10000).Determine the spectrum of this solution as directed under Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy <2.21> (¹H) in accordance with the following conditions,using sodium 3-trimethylsilylpropionate-d₄ for nuclear magnetic resonance spectroscopy as an internal reference compound:it exhibits no signal corresponding to N-acetyl proton of over-sulfated chondroitin sulfate at δ2.18±0.05ppm,or the signal disappears when determining the spectrum of the sample solution as directed under ¹H with ¹³C-decoupling.

Operating conditions-

Spectrometer:(1)FT-NMR,Not less than 400MHz

Temperature:25℃

Spinning:Off

Number of data points:32,768

Spectral range:Signal of DHO±6.0ppm

Flip angle:90°

Delay time:20 seconds

Dummy scan:4

Number of scans:S/N ratio of the signal of N-acetyl proton of heparin is not less than 1000

Window function:Exponential function(Line broadening factor=0.2Hz)

System suitability-

System performance:Dissolve 20mg of Heparin Calcium in 0.40mL of a solution of sodium 3-trimethylsilylpropionate-d₄ for nuclear magnetic resonance spectroscopy in heavy water for nuclear magnetic resonance spectroscopy(1 in 10000).Dissolve 0.10mg of Over-sulfated Chondroitin Sulfate Reference Standard in 1.0mL of a solution of sodium 3-trimethylsilylpropionate-d₄ for nuclear magnetic resonance spectroscopy in heavy water for nuclear magnetic resonance spectroscopy(1 in 10000).To the solution of heparin calcium add 0.20mL of the solution of Over-sulfated Chondroitin Sulfate Reference Standard.When determining the spectrum of this solution under the above conditions,it exhibits the signal of N-acetyl proton of heparin and the signal of N-acetyl proton of over-sulfated chondroitin sulfate at δ2.04±0.02ppm and δ2.18±0.05ppm,respectively.

Add the following next to Purity(8)

Purity (9) Related substances-Dissolve 2.0mg of Heparin Calcium in 0.1mL of water,and perform the test with exactly 20μL of this solution as directed under Liquid Chromatography <2.01> according to the following conditions:it exhibits no peaks after the heparin peak.

Operation conditions-

Detector:An ultraviolet absorption photometer(wavelength:202nm).

Column:A stainless steel column 2.0mm in inside diameter and 7.5cm in length,packed with diethylaminoethyl group bound to synthetic polymer for liquid chromatography(10μm in particle diameter).

Column temperature:A constant temperature of about 35℃.

Mobile phase A:Dissolve 0.4g of sodium dihydrogenphosphate dihydrate in 1000mL of water and adjust to a pH of 3.0 with diluted phosphoric acid(1 in 10).

Mobile phase B:Dissolve 0.4g of sodium dihydrogenphosphate dihydrate and 106.4g of lithium perchlorate in 1000mL of water and adjust to a pH of 3.0 with diluted phosphoric acid(1 in 10).

Flowing of the mobile phase:Control the gradient by mixing the mobile phases A and B as directed in the following table.

Flow rate:0.2mL per minute.

Time span of measurement:About 2 times as long as the retention time of heparin,beginning after the solvent peak.

System suitability-

Test for required detectability:Dissolve 10mg of Heparin Sodium Reference Standard for physicochemical test in 0.40mL of water,and use this solution as the Heparin Sodium standard stock solution.Separately,dissolve 0.10mg of Over-sulfated Chondroitin Sulfate Reference Standard in 0.20mL of water,and use this solution as the over-sulfated chondroitin sulfate standard solution.To 60μL of the Heparin Sodium standard stock solution add 3μL of the over-sulfated chondroitin sulfate standard solution and 12μL of water,and mix.When the procedure is run with 20μL of the mixture under the above operating conditions,it exhibits an over-sulfated chondroitin sulfate peak.

System performance:To 120μL of the Heparin Sodium standard stock solution add 30μL of the over-sulfated chondroitin sulfate standard solution,mix and use this solution as the solution for system suitability test.When the procedure is run with 20μL of the solution for system suitability test under the above operating conditions,heparin and over-sulfated chondroitin sulfate are eluted in this order with the resolution between these peaks being not less than 1.5.

System repeatability:When the test is repeated 6 times with 20μL of the solution for system suitability test under the above operating conditions,the relative standard deviation of the peak area of over-sulfated chondroitin sulfate is not more than 2.0％.

9．01 Reference Standards

Change the following to read:

Over-sulfated Chondroitin Sulfate Reference Standard:Identification,Purity

Add the following:

Heparin Sodium Reference Standard for physicochemical test:Identification,Purity

9．41 Reagents,Test Solutions

Add the following:

Aminobenzoate derivatization TS Dissolve 280mg of ethyl aminobenzoate in 600μL of methanol by heating at about 50℃,and add 170μL of acetic acid and 145μL of borane-pyridine complex.

Lithium perchlorate LiClO₄ White,crystals or crystalline powder.

Content:not less than 98％.Assay-Accurately weigh about 0.2g of lithium perchlorate,dissolve in 30mL of water.Transfer the solution to a chromatographic column,prepared by pouring about 25mL of strongly acidicion-exchange resin (H type) for column chromatography into a chromatographic tube about 11mm in inside diameter and about 300mm in height(after adding 200mL of 1mol/L hydrochloride TS and flowing at a flow rate of 3―4 mL per minute,wash the chromatographic column with water until the color of the rinse water changes to yellowish red when adding methyl orange TS to the eluate),and flow at a flow rate of 3―4mL per minute.Then,wash the column with about 30mL of water at a flow rate of 3―4mL per minute 5times.Combine the rinse water and the eluate,and titrate <2.50> with 0.1mol/L sodium hydroxide VS (indicator:3 drops of bromothymol blue TS).Perform a blank determination,and make any necessary correction.

Each mL of 0.1mol/L sodium hydroxide VS=10.64mg LiClO₄

D-Galactosamine hydrochloride C₆H₁₃NO₅・HCl White,powder.Melting point:about 180℃ (decomposition).

Optical rotation <2.49> 画像1 (1KB)
:＋90―＋97゜(1g,water,100mL,100mm).

D-Glucosamine hydrochloride C₆H₁₃NO₅・HCl White,crystals or crystalline powder.

Content:not less than 98％.Assay-Accurately weigh about 0.4g of D-Glucosamine hydrochloride,dissolve in 50mL of water,add 5mL of diluted nitric acid (1 in 3) and titrate <2.50> with 0.1mol/L silver nitrate VS (potentiometric titration).

Each mL of 0.1mol/L silver nitrate VS=21.56mg C₆H₁₃NO₅・HCl

Calcium acetate monohydrate (CH₃COO)₂Ca・H₂O［K8364,Special class］

Dermatan sulfate Dermatan sulfate is mucopolysaccharide purified from the skin and small intestines of pigs by alkaline extraction,followed by digestion with protease and fractionation by alcohol.When cellulose acetate membrane electrophoresis of dermatan sulfate is performed and the membrane is stained in a toluidine blue O solution(1 in 200),a single band appears.

Operation conditions of cellulose acetate membrane electrophoresis-

Cellulose acetate membrane:6cm in width and 10cm in length

Mobile phase:Dissolve 52.85g of calcium acetate monohydrate in water to make 1000mL.

Run time:3 hours(1.0mA/cm)

Borane-pyridine complex C₅H₈BN

Content:not less than 80％.Assay-Accurately weigh about 30mg of borane-pyridine complex,dissolve in 40mL of 0.05mol/L iodine solution,add 10mL of diluted sulfuric acid (1 in 6),and titrate <2.50> with 0.1mol/L sodium thiosulfate VS (indicator:starch TS).Perform a blank determination,and make any necessary correction.

Each mL of 0.1mol/L sodium thiosulfate VS=1.549mg C₅H₈BN

D-Mannosamine hydrochloride C₆H₁₃NO₅・HCl White,powder.Melting point:about 168℃ (decomposition).

Optical rotation <2.49> 画像2 (1KB)
:－4.2―－3.2゜(0.4g,water,20mL,100mm).

ヘパリンナトリウム

第十五改正日本薬局方医薬品各条ヘパリンナトリウムの条に、次の項を加える。

確認試験　本品及び理化学試験用ヘパリンナトリウム標準品1mgずつを水1mLに溶かし，試料溶液及び標準溶液とする．試料溶液及び標準溶液20μLずつをとり，次の条件で液体クロマトグラフィー〈2.01〉により試験を行うとき，試料溶液及び標準溶液から得た主ピークの保持時間は等しい．

試験条件

検出器，カラム，カラム温度，移動相A，移動相B，移動相の送液及び流量は純度試験(6)の試験条件を準用する．

システム適合性

システムの性能：理化学試験用ヘパリンナトリウム標準品1.0mgを水0.60mLに溶かした液90μL，過硫酸化コンドロイチン硫酸標準品0.10mgを水0.20mLに溶かした液30μL及びデルマタン硫酸エステル1.0mgを水2.0mLに溶かした液30μLを混和する．この液20μLにつき，上記の条件で操作するとき，デルマタン硫酸エステル，ヘパリン，過硫酸化コンドロイチン硫酸の順に溶出し，デルマタン硫酸エステルとヘパリンの分離度は1.0以上，ヘパリンと過硫酸化コンドロイチン硫酸の分離度は1.5以上である．

第十五改正日本薬局方医薬品各条ヘパリンナトリウムの条純度試験の項(5)を次のように改める。

純度試験(5)　過硫酸化コンドロイチン硫酸　本品20mgを核磁気共鳴スペクトル測定用3―トリメチルシリルプロピオン酸ナトリウム―d₄の核磁気共鳴スペクトル測定用重水溶液(1→10000)0.60mLに溶かす．この液につき，3―トリメチルシリルプロピオン酸ナトリウム―d₄を内部基準物質として核磁気共鳴スペクトル測定法〈2.21〉により，プロトン共鳴周波数400MHz以上の装置(1)を用いて¹Hを測定するとき，δ2.15±0.02ppmに過硫酸化コンドロイチン硫酸のN―アセチル基に由来するシグナルを認めないか，シグナルを認める場合には¹³Cをデカップリングして測定するとき，そのシグナルは消失する．

試験条件

温度：25℃

スピニング：オフ

データポイント数：32,768

スペクトル範囲：DHOのシグナルを中心に±6.0ppm

パルス角：90゜

繰り返しパルス待ち時間：20秒

ダミースキャン：4回

積算回数：ヘパリンのN―アセチル基のプロトンのシグナルのS／N比が1000以上得られる回数

ウインドウ関数：指数関数(Line　broadening　factor＝0.2Hz)

システム適合性

システムの性能：理化学試験用ヘパリンナトリウム標準品20mgを核磁気共鳴スペクトル測定用3―トリメチルシリルプロピオン酸ナトリウム―d₄の核磁気共鳴スペクトル測定用重水溶液(1→10000)0.40mLに溶かした液に，過硫酸化コンドロイチン硫酸標準品0.10mgを核磁気共鳴スペクトル測定用3―トリメチルシリルプロピオン酸ナトリウム―d₄の核磁気共鳴スペクトル測定用重水溶液(1→10000)1.0mLに溶かした液0.20mLを加える．この液につき，上記の条件で操作するとき，δ2.04±0.02ppmにヘパリンのN―アセチル基に由来するシグナル，及びδ2.15±0.02ppmに過硫酸化コンドロイチン硫酸のN―アセチル基に由来するシグナルを認める．

第十五改正日本薬局方医薬品各条ヘパリンナトリウムの条純度試験の項(5)の次に次の二目を加える．

純度試験(6)　類縁物質　本品2.0mgを水0.1mLに溶かした液20μLを正確にとり，次の条件で液体クロマトグラフィー〈2.01〉により試験を行うとき，ヘパリンのピーク以降にピークを認めない．

試験条件

検出器：紫外吸光光度計(測定波長：202nm)

カラム：内径2.0mm，長さ7.5cmのステンレス管に10μmの液体クロマトグラフィー用ジエチルアミノエチル基を結合した合成高分子を充てんする．

カラム温度：35℃付近の一定温度

移動相A：リン酸二水素ナトリウム二水和物0.4gを水1000mLに溶かし，薄めたリン酸(1→10)を加えてpH3.0に調整する．

移動相B：リン酸二水素ナトリウム二水和物0.4g及び過塩素酸リチウム106.4gを水1000mLに溶かし，薄めたリン酸(1→10)を加えてpH3.0に調整する．

移動相の送液：移動相A及び移動相Bの混合比を次のように変えて濃度勾配制御する．

流量：毎分0.2mL

測定範囲：溶媒のピークの後からヘパリンの保持時間の2倍の範囲

システム適合性

検出の確認：理化学試験用ヘパリンナトリウム標準品10mgを水0.40mLに溶かしてヘパリンナトリウム標準原液とする．別に過硫酸化コンドロイチン硫酸標準品0.10mgを水0.20mLに溶かし，過硫酸化コンドロイチン硫酸標準溶液とする．ヘパリンナトリウム標準原液60μL，過硫酸化コンドロイチン硫酸標準溶液3μL及び水12μLを混和した液20μLにつき，上記の条件で操作するとき，過硫酸化コンドロイチン硫酸のピークを認める．

システムの性能：ヘパリンナトリウム標準原液120μLに過硫酸化コンドロイチン硫酸標準溶液30μLを混和し，システム適合性試験用溶液とする．この液20μLにつき，上記の条件で操作するとき，ヘパリン，過硫酸化コンドロイチン硫酸の順に溶出し，その分離度は1.5以上である．

システムの再現性：システム適合性試験用溶液20μLにつき，上記の条件で試験を6回繰り返すとき，過硫酸化コンドロイチン硫酸のピーク面積の相対標準偏差は2.0％以下である．

純度試験(7)　ガラクトサミン　本品2.4mgを水／塩酸混液(7：5)1.0mLに溶かし，試料原液とする．D―グルコサミン塩酸塩8.0mgを水／塩酸混液(7：5)に溶かして正確に10mLとした液99容量に，D―ガラクトサミン塩酸塩8.0mgを水／塩酸混液(7：5)に溶かして正確に10mLとした液1容量を加え，標準原液とする．試料原液及び標準原液500μLずつを共栓試験管にとり，それぞれを密栓して100℃で6時間加熱する．これらの液を室温まで冷やし，100μLずつをとり，減圧乾固する．それぞれの残留物にメタノール50μLずつを加え，室温で減圧乾固する．それぞれの残留物を水10μLずつに溶かし，アミノ安息香酸誘導体化試液40μLずつを加え，80℃で1時間加熱する．これらの液を室温まで冷やし，減圧乾固する．それぞれの残留物に，水及び酢酸エチル200μLずつを加え，激しく振り混ぜ，遠心分離する．上層を除去し，それぞれの下層に酢酸エチル200μLずつを加え，激しく振り混ぜ，遠心分離する．下層をそれぞれ試料溶液及び標準溶液とする．試料溶液及び標準溶液5μLずつにつき，次の条件で液体クロマトグラフィー〈2.01〉により試験を行うとき，試料溶液のグルコサミンのピーク面積に対するガラクトサミンのピーク面積の比は，標準溶液のグルコサミンのピーク面積に対するガラクトサミンのピーク面積の比より大きくない．

試験条件

検出器：蛍光光度計(励起波長：305nm，蛍光波長：360nm)

カラム：内径4.6mm，長さ15cmのステンレス管に3μmの液体クロマトグラフィー用オクタデシルシリル化シリカゲルを充てんする．

カラム温度：45℃付近の一定温度

移動相：水／トリフルオロ酢酸混液(1000：1)100mLにアセトニトリル100mLを加える．この液140mLを水／トリフルオロ酢酸混液(1000：1)860mLに加える．

流量：毎分1.0mL

面積測定範囲：注入後50分間

システム適合性

検出の確認：D―マンノサミン塩酸塩8.0mgを水／塩酸混液(7：5)10mLに溶かし，マンノサミン標準溶液とする．標準原液／マンノサミン標準溶液混液(100：1)500μLを共栓試験管にとり，密栓して100℃で6時間加熱する．この液を室温まで冷やし，100μLをとり，減圧乾固する．残留物にメタノール50μLを加え，室温で減圧乾固する．残留物を水10μLに溶かし，アミノ安息香酸誘導体化試液40μLを加え，80℃で1時間加熱する．この液を室温まで冷やし，減圧乾固する．残留物に，水及び酢酸エチル200μLずつを加え，激しく振り混ぜ，遠心分離する．上層を除去し，下層に酢酸エチル200μLを加え，激しく振り混ぜ，遠心分離し，下層をシステム適合性試験用溶液とする．この液5μLにつき，上記の条件で試験するとき，グルコサミンのピーク面積に対するガラクトサミンのピーク面積の比は，0.7～2.0％である．

システムの性能：システム適合性試験用溶液5μLにつき，上記の条件で試験するとき，グルコサミン，マンノサミン及びガラクトサミンの順に溶出し，グルコサミンとマンノサミン及びマンノサミンとガラクトサミンの分離度はそれぞれ1.5以上である．

システムの再現性：システム適合性試験用溶液5μLにつき，上記の条件で試験を6回繰り返すとき，グルコサミンのピーク面積に対するガラクトサミンのピーク面積の比の相対標準偏差は4.0％以下である．

ヘパリンカルシウム

第十五改正日本薬局方医薬品各条ヘパリンカルシウムの条確認試験の項中(2)を(3)とし、(1)の次に次のように加える。

確認試験(2)　本品及び理化学試験用ヘパリンナトリウム標準品1mgずつを水1mLに溶かし，試料溶液及び標準溶液とする．試料溶液及び標準溶液20μLずつをとり，次の条件で液体クロマトグラフィー〈2.01〉により試験を行うとき，試料溶液及び標準溶液から得た主ピークの保持時間は等しい．

試験条件

検出器，カラム，カラム温度，移動相A，移動相B，移動相の送液及び流量は純度試験(6)の試験条件を準用する．

システム適合性

システムの性能：理化学試験用ヘパリンナトリウム標準品1.0mgを水0.60mLに溶かした液90μL，過硫酸化コンドロイチン硫酸標準品0.10mgを水0.20mLに溶かした液30μL及びデルマタン硫酸エステル1.0mgを水2.0mLに溶かした液30μLを混和する．この液20μLにつき，上記の条件で操作するとき，デルマタン硫酸エステル，ヘパリン，過硫酸化コンドロイチン硫酸の順に溶出し，デルマタン硫酸エステルとヘパリンの分離度は1.0以上，ヘパリンと過硫酸化コンドロイチン硫酸の分離度は1.5以上である．

第十五改正日本薬局方医薬品各条ヘパリンカルシウムの条純度試験の項中(8)を、次のように改める。

純度試験(8)　過硫酸化コンドロイチン硫酸　本品20mgを核磁気共鳴スペクトル測定用3―トリメチルシリルプロピオン酸ナトリウム―d₄の核磁気共鳴スペクトル測定用重水溶液(1→10000)0.60mLに溶かす．この液につき，3―トリメチルシリルプロピオン酸ナトリウム―d₄を内部基準物質として核磁気共鳴スペクトル測定法〈2.21〉により，プロトン共鳴周波数400MHz以上の装置(1)を用いて¹Hを測定するとき，δ2.18±0.05ppmに過硫酸化コンドロイチン硫酸のN―アセチル基に由来するシグナルを認めないか，シグナルを認める場合には₁₃Cをデカップリングして測定するとき，そのシグナルは消失する．

試験条件

温度：25℃

スピニング：オフ

データポイント数：32,768

スペクトル範囲：DHOのシグナルを中心に±6.0ppm

パルス角：90゜

繰り返しパルス待ち時間：20秒

ダミースキャン：4回

積算回数：ヘパリンのN―アセチル基のプロトンのシグナルのS／N比が1000以上得られる回数

ウインドウ関数：指数関数(Line　broadening　factor＝0.2Hz)

システム適合性

システムの性能：本品20mgを核磁気共鳴スペクトル測定用3―トリメチルシリルプロピオン酸ナトリウム―d₄の核磁気共鳴スペクトル測定用重水溶液(1→10000)0.40mLに溶かした液に，過硫酸化コンドロイチン硫酸標準品0.10mgを核磁気共鳴スペクトル測定用3―トリメチルシリルプロピオン酸ナトリウム―d₄の核磁気共鳴スペクトル測定用重水溶液(1→10000)1.0mLに溶かした液0.20mLを加える．この液につき，上記の条件で操作するとき，δ2.04±0.02ppmにヘパリンのN―アセチル基に由来するシグナル，及びδ2.18±0.05ppmに過硫酸化コンドロイチン硫酸のN―アセチル基に由来するシグナルを認める．

第十五改正日本薬局方医薬品各条ヘパリンカルシウムの条純度試験に、次の項を加える。

純度試験(9)　類縁物質　本品2.0mgを水0.1mLに溶かした液20μLを正確にとり，次の条件で液体クロマトグラフィー〈2.01〉により試験を行うとき，ヘパリンのピーク以降にピークを認めない．

試験条件

検出器：紫外吸光光度計(測定波長：202nm)

カラム：内径2.0mm，長さ7.5cmのステンレス管に10μmの液体クロマトグラフィー用ジエチルアミノエチル基を結合した合成高分子を充てんする．

カラム温度：35℃付近の一定温度

移動相A：リン酸二水素ナトリウム二水和物0.4gを水1000mLに溶かし，薄めたリン酸(1→10)を加えてpH3.0に調整する．

移動相B：リン酸二水素ナトリウム二水和物0.4g及び過塩素酸リチウム106.4gを水1000mLに溶かし，薄めたリン酸(1→10)を加えてpH3.0に調整する．

移動相の送液：移動相A及び移動相Bの混合比を次のように変えて濃度勾配制御する．

流量：毎分0.2mL

測定範囲：溶媒のピークの後からヘパリンの保持時間の2倍の範囲

システム適合性

検出の確認：理化学試験用ヘパリンナトリウム標準品10mgを水0.40mLに溶かしてヘパリンナトリウム標準原液とする．別に過硫酸化コンドロイチン硫酸標準品0.10mgを水0.20mLに溶かし，過硫酸化コンドロイチン硫酸標準溶液とする．ヘパリンナトリウム標準原液60μL，過硫酸化コンドロイチン硫酸標準溶液3μL及び水12μLを混和した液20μLにつき，上記の条件で操作するとき，過硫酸化コンドロイチン硫酸のピークを認める．

システムの性能：ヘパリンナトリウム標準原液120μLに過硫酸化コンドロイチン硫酸標準溶液30μLを混和し，システム適合性試験用溶液とする．この液20μLにつき，上記の条件で操作するとき，ヘパリン，過硫酸化コンドロイチン硫酸の順に溶出し，その分離度は1.5以上である．

システムの再現性：システム適合性試験用溶液20μLにつき，上記の条件で試験を6回繰り返すとき，過硫酸化コンドロイチン硫酸のピーク面積の相対標準偏差は2.0％以下である．

9．01標準品

第十五改正日本薬局方医薬品一般試験法9．01標準品の条(1)の項過硫酸化コンドロイチン硫酸標準品を、次のように改める。

過硫酸化コンドロイチン硫酸標準品　確認試験，純度試験

第十五改正日本薬局方医薬品一般試験法9．01標準品の条(1)の項に、次の目を加える。

理化学試験用ヘパリンナトリウム標準品　確認試験，純度試験

9．41試薬・試液

第十五改正日本薬局方一般試験法の部　9．41　試薬・試液の条に、次の項を加える。

アミノ安息香酸誘導体化試液　アミノ安息香酸エチル280mgにメタノール600μLを加え，約50℃に加温して溶かし，酢酸170μL及びボラン―ピリジン錯体145μLを加える．

過塩素酸リチウム　LiClO₄　白色の結晶又は結晶性の粉末である．

含量98％以上．定量法　本品約0.2gを精密に量り，水30mLに溶かし，カラム(カラムクロマトグラフィー用強酸性イオン交換樹脂(H型)約25mLを内径約11mm，高さ30cmのクロマトグラフィー管に注入し，1mol／L塩酸試液200mLを加え1分間に3～4mLの流量で流出させた後，水を流し，流出液にメチルオレンジ試液を加えたときに色が黄みの赤になるまで繰り返し洗浄して調製したもの)に入れ，1分間に3～4mLの流量で流出する．次に水約30mLずつ1分間3～4mLの速度で5回洗う．洗液を流出液に合わせ，0.1mol／L水酸化ナトリウム液で滴定する(指示薬：ブロモチモールブルー試液3滴)．同様な方法で空試験を行い，補正する．

0.1mol／L水酸化ナトリウム液　1mL＝10.64mg　LiClO₄

D―ガラクトサミン塩酸塩　C₆H₁₃NO₅・HCl　白色の粉末である．融点：約180℃(分解)．

旋光度〈2.49〉　画像3 (2KB)
：＋90～＋97°(1g，水，100mL，100mm)．

D―グルコサミン塩酸塩　C₆H₁₃NO₅・HCl　白色の結晶又は結晶性の粉末である．

含量98％以上．定量法　本品約0.4gを精密に量り，水50mLに溶かし，薄めた硝酸(1→3)5mLを加え，0.1moL／L硝酸銀液で滴定する(電位差滴定法)．

0.1moL／L硝酸銀　1mL＝21.56mg　C₆H₁₃NO₅・HCl

酢酸カルシウム一水和物(CH₃COO)₂Ca・H₂O　［K8364，特級］

デルマタン硫酸エステル　ブタ皮又はブタ小腸をアルカリ抽出後，プロテアーゼ消化し，アルコール分画法により精製したムコ多糖．セルロースアセテート膜電気泳動を行い，トルイジンブルー0溶液(1→200)に浸して染色するとき，単一バンドである．

膜電気泳動条件

セルロースアセテート膜：幅6cm×長さ10cm

移動相：酢酸カルシウム―水和物52.85gを水に溶かし，1000mLとする．

泳動時間：3時間(1.0mA／cm)

ボラン―ピリジン錯体　C₅H₈BN　含量80％以上．　定量法　本品30mgを精密に量り，0.05mol／Lヨウ素溶液40mLに溶かし，薄めた硫酸(1→6)10mLを加え，0.1moL／Lチオ硫酸ナトリウム液で滴定する(指示薬：デンプン試液)．同様の方法で空試験を行い補正する．

0.1moL／Lチオ硫酸ナトリウム液1mL＝1.549mg　C₅H₈BN

D―マンノサミン塩酸塩　C₆H₁₃NO₅・HCl　白色の粉末である．融点：約168℃(分解)．

旋光度〈2.49〉　画像4 (2KB)
：－4.2～－3.2゜(0.4g，水，20mL，100mm)．