Soluble solids

Use for each medium not less than the quantity prescribed in Table 4．06―2 of the product dissolved in a suitable solvent such as the solvent provided with the preparation,water for injection,saline or a 1 g／L_neutral solution of meat or casein peptone and proceed with the test as described above for aqueous solutions using a membrane appropriate to the chosen solvent.

Oils and oily solutions

Use for each medium not less than the quantity of the product prescribed in Table 4．06―2.Oils and oily solutions of sufficiently low viscosity may be filtered without dilution through a dry membrane.Viscous oils may be diluted as necessary with a suitable sterile diluent such as isopropyl myristate shown not to have antimicrobial activity in the conditions of the test.

Allow the oil to penetrate the membrane by its own weight then filter,applying the pressure or suction gradually.Wash the membrane at least three times by filtering through it each time about 100 mL of a suitable sterile solution such as 1 g／L neutral meat or casein peptone containing a suitable emulsifying agent at a concentration shown to be appropriate in the method suitability of the test,for example polysorbate 80 at a concentration of 10 g／L.

Transfer the membrane or membranes to the culture medium or media or vice versa as described above for aqueous solutions,and incubate at the same temperatures and for the same times.

Ointments and creams

Use for each medium not less than the quantities of the product prescribed in Table 4．06―2.Ointments in a fatty base and emulsions of the water-in-oil type may be diluted to 1 per cent in isopropyl myristate as described above,by heating,if necessary,to not more than 40℃.In exceptional cases it may be necessary to heat to not more than 44℃.Filter as rapidly as possible and proceed as described above for oils and oily solutions.

5．3．Direct inoculation of the culture medium

Transfer the quantity of the preparation to be examined prescribed in Table 4．06―2 directly into the culture medium so that the volume of the product is not more than 10 per cent of the volume of the medium,unless otherwise prescribed.

If the product to be examined has antimicrobial activity,carry out the test after neutralising this with a suitable neutralising substance or by dilution in a sufficient quantity of culture medium.When it is necessary to use a large volume of the product it may be preferable to use a concentrated culture medium prepared in such a way that it takes account of the subsequent dilution.Where appropriate the concentrated medium may be added directly to the product in its container.

Oily liquids

Use media to which have been added a suitable emulsifying agent at a concentration shown to be appropriate in the method suitability of the test,for example polysorbate 80 at a concentration of 10 g／L.

Ointments and creams

Prepare by diluting to about 1 in 10 by emulsifying with the chosen emulsifying agent in a suitable sterile diluent such as a 1 g／L neutral solution of meat or casein peptone.Transfer the diluted product to a medium not containing an emulsifying agent.

Incubate the inoculated media for not less than 14 days.Observe the cultures several times during the incubation period.Shake cultures containing oily products gently each day.

However when fluid thioglycollate medium is used for the detection of anaerobic micro-organisms keep shaking or mixing to a minimum in order to maintain anaerobic conditions.

6．Observation and interpretation of results

At intervals during the incubation period and at its conclusion,examine the media for macroscopic evidence of microbial growth.If the material being tested renders the medium turbid so that the presence or absence of microbial growth cannot be readily determined by visual examination,14 days after the beginning of incubation transfer portions(each not less than 1 mL) of the medium to fresh vessels of the same medium and then incubate the original and transfer vessels for not less than 4 days.

If no evidence of microbial growth is found,the product to be examined complies with the test for sterility.If evidence of microbial growth is found the product to be examined does not comply with the test for sterility,unless it can be clearly demonstrated that the test was invalid for causes unrelated to the product to be examined.

The test may be considered invalid only if one or more of the following conditions are fulfilled:

a)　the data of the microbiological monitoring of the sterility testing facility show a fault;

b)　a review of the testing procedure used during the test in question reveals a fault;

c)　microbial growth is found in the negative controls;

d)　after determination of the identity of the micro-organisms isolated from the test,the growth of this species or these species may be ascribed unequivocally to faults with respect to the material and／or the technique used in conducting the sterility test procedure.

If the test is declared to be invalid it is repeated with the same number of units as in the original test.

If no evidence of microbial growth is found in the repeat test the product examined complies with the test for sterility.If microbial growth is found in the repeat test the product examined does not comply with the test for sterility.

7．Application of the test to parenteral preparations,ophthalmic and other non-injectable preparations required to comply with the test for sterility

When using the technique of membrane filtration,use,whenever possible,the whole contents of the container,but not less than the quantities indicated in Table 4．06―2,diluting where necessary to about 100 mL with a suitable sterile solution,such as 1 g／L neutral meat or casein peptone.

When using the technique of direct inoculation of media,use the quantities shown in Table 4．06―2,unless otherwise justified and authorised.The tests for bacterial and fungal sterility are carried out on the same sample of the product to be examined.When the volume or the quantity in a single container is insufficient to carry out the tests,the contents of two or more containers are used to inoculate the different media.

8．Minimum number of items to be tested

The minimum number of items to be tested in relation to the size of the batch is given in Table 4．06―3.

Table 4．06―3．Minimum number of items to be tested

^＊If the batch size is not known,use the maximum number of items prescribed

^＊＊If the contents of one container are enough to inoculate the two media,this column gives the number of containers needed for both the media together.

6．09　Disintegration Test

Change to read following part under Apparatus:

Disks-The use of disks is permitted only where specified or allowed.Each tube is provided with a cylindrical disk 9.5±0.15 mm thick and 20.7±0.15 mm in diameter.The disk is made of a suitable,transparent plastic material having a specific gravity of between 1.18 and 1.20.Five parallel 2±0.1 mm holes extend between the ends of the cylinder.One of the holes is centered on the cylindrical axis.The other holes are centered 6±0.2 mm from the axis on imaginary lines perpendicular to the axis and parallel to each other.Four identical trapezoidal-shaped planes are cut into the wall of the cylinder,nearly perpendicular to the ends of the cylinder.The trapezoidal shape is symmetrical; its parallel sides coincide with the ends of the cylinder and are parallel to an imaginary line connecting the centers of two adjacent holes 6 mm from the cylindrical axis.The parallel side of the trapezoid on the bottom of the cylinder has a length of 1.6±0.1 mm,and its bottom edges lie at a depth of 1.5―1.8 mm from the cylinder's circumference.The parallel side of the trapezoid on the top of the cylinder has a length of 9.4±0.2 mm,and its center lies at a depth of 2.6±0.1 mm from the cylinder's circumference.All surfaces of the disk are smooth.If the use of disks is specified,add a disk to each tube,and operate the apparatus as directed under Procedure.The disks conform to dimensions found in Fig.6．09―1.The use of automatic detection employing modified disks is permitted where the use of disks is specified or allowed.Such disks must comply with the requirements for density and dimension given in this chapter.

Fig.6．09―1　Disintegration apparatus

6．10　Dissolution Test

Change to read following part under Procedure for Basket or Paddle Methods:

IMMEDIATE-RELEASE DOSAGE FORMS

Procedure―Place the stated volume of the dissolution medium(±1%) in the vessel of the specified apparatus,assemble the apparatus,equilibrate the dissolution medium to 37±0.5℃,and remove the thermometer.Place 1 dosage unit in the apparatus,taking care to exclude air bubbles from the surface of the dosage unit,and immediately operate the apparatus at the specified rate.Within the time interval specified,or at each of the times stated,withdraw a specimen from a zone midway between the surface of the Dissolution Medium and the top of the rotating basket or blade,not less than 10 mm from the vessel wall.[NOTE―Where multiple sampling times are specified,replace the aliquots withdrawn for analysis with equal volumes of fresh Dissolution Medium at 37℃ or,where it can be shown that replacement of the medium is not necessary,correct for the volume change in the calculation.Keep the vessel covered for the duration of the test,and verify the temperature of the mixture under test at suitable times.]Perform the analysis using an indicated assay method.^＊3 Repeat the test with additional dosage units.

If automated equipment is used for sampling or the apparatus is otherwise modified,verification that the modified apparatus will produce results equivalent to those obtained with the standard apparatus described in this chapter,is necessary.

Dissolution Medium-A specified dissolution medium is used.The volume specified refers to measurements made between 20℃ and 25℃.If the dissolution medium is a buffered solution,adjust the solution so that its pH is within 0.05 unit of the specified pH.[NOTE―Dissolved gases can cause bubbles to form,which may change the results of the test.If dissolved gases influence the dissolution results,remove dissolved gases prior testing.^＊4]

Time―Where a single time specification is given,the test may be concluded in a shorter period if the requirement for minimum amount dissolved is met.Specimens are to be withdrawn only at the stated times,within a tolerance of ±2%.

4．05　微生物限度試験法

微生物限度試験法を次のように改める．

微生物限度試験法には生菌数試験及び特定微生物試験が含まれる．原料又は製品の任意の異なる数箇所(又は部分)から採取したものを混和し，試料として試験を行う．試料を液体培地で希釈する場合は，速やかに試験を行う．また，本試験を行うに当たっては，バイオハザード防止に十分に留意する．

Ⅰ．非無菌製品の微生物学的試験：生菌数試験

本試験法は，三薬局方での調和合意に基づき規定した試験法である．

1　序文

本試験は，好気的条件下で発育可能な中温性の細菌及び真菌を定量的に測定する方法である．

本試験は，原料や製剤が既定の微生物学的品質規格に適合するか否かを判定することを主目的としたものである．採取試料数も含めて指示通りに試験を実施し，結果を判定する．

有効成分として生菌を含む製品には，本試験を適用しない．

局方試験法との同等性が示されている場合は，自動化法を含む別の微生物学的方法を用いてもよい．

2　基本手順

生菌数測定は，被験製品への外部からの微生物汚染を回避するように設計された条件下で行う．汚染を回避するための予防措置は，試験で検出しようとしているいかなる微生物に対しても影響を与えてはならない．

被験製品が抗菌活性を有する場合は，この抗菌活性を可能な限り除去又は中和する．この目的のために不活化剤を用いる場合は，その有効性と微生物に対する毒性がないことを確認する．

試料の調製に界面活性剤を使用する場合は，微生物に対する毒性がないこと，及び用いる不活化剤との間に相互作用がないことを確認する．

3　生菌数測定法

通常はメンブランフィルター法又はカンテン平板法を用いる．最確数(MPN)法は概して精度に欠ける菌数測定法ではあるが，バイオバーデン(汚染菌数)が非常に少ない製品群に対しては最適な方法となることもある．

製品の特性や要求される微生物限度値などに基づいて測定法を選択するが，選択した測定法は，規格に適合していることを判断するのに十分な試料量を試験できるものでなければならない．また，選択した方法の適合性を確認する．

4　培地性能，測定法の適合性及び陰性対照

4．1．一般要件

被験製品存在下における微生物検出能力を確認する．

また，試験結果に影響を及ぼすような試験法の変更や製品の処方変更があった場合には，再度，適合性を確認する．

4．2．試験菌の調製

試験菌は標準化された安定な懸濁液を使用するか，又は次に示す手順で調製する．

なお，試験に用いる微生物は，最初のマスターシードロットからの継代数5回を超えないように，シードロット培養管理手法(シードロットシステム)を用いて管理する．細菌及び真菌の各試験菌について，表4．05―Ⅰ―1に示す条件でそれぞれ個別に培養する．

試験菌懸濁液の調製には，pH7.0のペプトン食塩緩衝液又はpH7.2のリン酸緩衝液を用いる．Aspergillus nigerの胞子を懸濁させるために，緩衝液にポリソルベート80を0.05％加えても良い．懸濁液は2時間以内，又は2～8℃に保存する場合は24時間以内に用いる．Aspergillus niger又はBacillus subtilisの栄養型細胞の新鮮懸濁液を調製して希釈する代わりに，胞子懸濁液又は芽胞懸濁液を調製し，接種菌液として使用できる．それぞれの懸濁液は，保証された期間内は2～8℃で保存できる．

表4．05―Ⅰ―1　試験菌の調製と使用法

4．3．陰性対照

試験状態を確認するために，試料液の代わりに使用した希釈液を用いて陰性対照試験を実施する．微生物の発育があってはならない．微生物の発育が認められた場合には，原因調査が必要である．また，陰性対照試験は5．に記載の製品の試験においても実施する．

4．4．培地性能

市販生培地についてはバッチごとに試験する．また，乾燥粉末培地又は各成分より調製した培地については，調製バッチごとに試験する．

表4．05―Ⅰ―1に示す微生物の少数(100CFU以下)をソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地の一部，ソイビーン・カゼイン・ダイジェストカンテン培地及びサブロー・ブドウ糖カンテン培地の平板に接種する．菌株ごとに別個の液体培地の一部又は平板を用い，表4．05―Ⅰ―1に示した条件でそれぞれ培養する．

カンテン培地では，接種菌の出現集落数は標準化された菌液の計測値の1／2から2倍以内でなければならない．新鮮培養菌を用いて試験する場合は，有効性が確認された培地バッチで以前に得られた発育と同等の発育を示さなければならない．

液体培地では，有効性が確認された培地バッチで以前に得られた発育と同等の発育が認められなければならない．

4．5．製品存在下での測定法の適合性

4．5．1．試料の調製

試料の調製法は，被験製品の物理学的特性に依存する．以下に記載したいずれの方法も満足できるものでない場合は，別な方法を確立する．

水溶性製品

被験製品をpH7.0のペプトン食塩緩衝液，pH7.2のリン酸緩衝液又はソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地で溶解又は希釈する(通常は10倍希釈液を調製する)．必要ならば，pH6～8に調整する．さらなる希釈が必要な場合は同じ希釈液で調製する．

水に不溶の非脂質製品

被験製品をpH7.0のペプトン食塩緩衝液，pH7.2のリン酸緩衝液又はソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地に懸濁させる(通常は10倍希釈液を調製する)．分散しやすくするために，例えばポリソルベート80(濃度：1g／L)のような界面活性剤を加えることができる．必要ならば，pH6～8に調整する．さらなる希釈が必要な場合は同じ希釈液で調製する．

脂質製品

被験製品をろ過滅菌したミリスチン酸イソプロピルに溶解するか，又は，必要ならば40℃以下(例外的な場合でも45℃以下)に加温した最少必要量のポリソルベート80又は他の非阻害性の界面活性剤を用いて混合する．必要ならば水浴中で温度を保ちながら注意深く混和する．選定した希釈液をあらかじめ加温して加え，被験製品の10倍希釈液を調製する．乳化に必要な最短の時間で温度を保ちながら注意深く混和する．適切な濃度のポリソルベート80，又は他の非阻害性の界面活性剤を含む同じ希釈液を用いて，更に10倍段階希釈系列を調製してもよい．

エアゾール状の液体又は固体

製品を無菌的にメンブランフィルター装置内又はさらなる試料採取のために滅菌容器内に移す．各被験容器から，全量あるいは定量噴霧の一定量のいずれかを用いる．

経皮吸収パッチ

経皮吸収パッチの保護被覆(“剥離ライナー”)を取り除き，粘着面を上向きにして滅菌ガラス又は滅菌プラスチックトレーの上に置く．パッチ同士が付着するのを防ぐために，滅菌した多孔性物質(例えば滅菌ガーゼ)で粘着面を覆う．ポリソルベート80及び／又はレシチンなどの不活化剤を含む適当量の選定した希釈液にパッチを移し，少なくとも30分間激しく振とうする．

4．5．2．接種及び希釈

100CFU以下の接種菌を得るのに十分な量の試験菌懸濁液を4．5．1．で調製した試料液及び対照(試料を含まない)に加える．接種する試験菌懸濁液の量は，試料液量の1％を超えてはならない．

製品からの許容可能な微生物回収結果を得るために，最も低い希釈率の試料液を用いて試験する．抗菌活性又は低溶解度のために，最も低い希釈率の試験法を使えない場合は，更に適切な試験手順を確立する．

試料による発育阻止が避けられない場合には，中和，希釈又はろ過の後に試験菌懸濁液を加えてもよい．

4．5．3．抗菌活性の中和／除去

4．5．2．及び4．5．4．に示した手順に従って試験を行い，試料液から回収された菌数と，対照から回収された菌数とを比較する．

発育が阻害される場合(試料液からの回収菌数が，対照からの回収菌数の1／2未満の場合)は，正しい結果を得るために，生菌数測定の方法を変更する．方法の変更には，例えば(1)希釈液又は培地の増量，(2)特異的又は一般的な中和剤の希釈液への添加，(3)膜ろ過，又は(4)上記の手段の組み合わせが含まれる．中和剤：抗菌剤の活性を中和するため，中和剤を用いることができる(表4．05―Ⅰ―2)．中和剤は，選定した希釈液又は培地に，可能な限り滅菌前に添加する．中和剤を用いた場合は，その有効性と微生物に対する毒性がないことを，製品を含まずに中和剤のみを加えたブランク試験で確認する．

適切な中和法が確立できない場合には，その製品のもつ殺菌活性のために，接種菌が分離できないと見なす．したがって，その製品が接種菌と同種の菌やその近縁種によって汚染されている可能性は低いと考える．しかし，その製品がこれらの微生物の一部を阻害するだけで，試験菌株以外の菌株は阻害しない可能性もあるので，微生物の発育とその許容基準に見合った最も低い濃度で試験を行う．

表4．05―Ⅰ―2　阻害物質に対する一般的な中和剤／中和法

4．5．4．製品存在下での微生物回収

表4．05―Ⅰ―1に記載されている微生物ごとに個別に試験する．添加した微生物のみを対象に測定する．

4．5．4．1．メンブランフィルター法

メンブランフィルターは，孔径0.45μm以下のものを使用する．フィルターの材質は，被験試料の成分によって細菌捕集能力が影響されないように注意して選択する．表4．05―Ⅰ―1の微生物ごとに1枚のメンブランフィルターを用いる．

4．5．1．～4．5．3．の記載どおりに調製した試料の適量(可能であれば製品の1g相当量，又は多数の集落の形成が予測される場合はそれ以下)をメンブランフィルターに移して直ちにろ過し，適量の希釈液でメンブランフィルターを洗浄する．

メンブランフィルターを，総好気性微生物数(total aerobic microbial count;TAMC)測定用としてソイビーン・カゼイン・ダイジェストカンテン培地の表面に，総真菌数(total combined yeasts／moulds count;TYMC)測定用としてサブロー・ブドウ糖カンテン培地の表面に移す．表4．05―Ⅰ―1に示した条件で平板を培養後，集落数を測定する．

4．5．4．2．カンテン平板法

カンテン平板法は，各培地に対して少なくとも2枚の平板を用いて実施し，結果はそれぞれの平板の測定菌数の平均値を用いる．

4．5．4．2．1．カンテン平板混釈法

直径9cmのペトリ皿を使用する場合，4．5．1．～4．5．3．の記載どおりに調製した試料を1mL分注する．これにあらかじめ45℃以下に保温した15～20mLのソイビーン・カゼイン・ダイジェストカンテン培地又はサブロー・ブドウ糖カンテン培地で混和する．より大きなペトリ皿を用いる場合は，それに応じてカンテン培地量を増加する．表4．05―Ⅰ―1に挙げた微生物ごとに少なくとも2枚のペトリ皿を用いる．

表4．05―Ⅰ―1に示した条件で平板培地を培養する．培地ごとに菌数の算術平均をとり，集落数を算出する．

4．5．4．2．2．カンテン平板表面塗抹法

直径9cmのペトリ皿を使用する場合は，15～20mLのソイビーン・カゼイン・ダイジェストカンテン培地又はサブロー・ブドウ糖カンテン培地を約45℃で加えて固化させ，例えば，層流式キャビネット又は恒温器の中で平板培地の表面を乾燥させる．より大きなペトリ皿を用いる場合は，それに応じてカンテン培地量を増加する．表4．05―Ⅰ―1に挙げた微生物ごとに少なくとも2枚のペトリ皿を用いる．4．5．1．～4．5．3．の記載どおりに試料を調製し，その0.1mL以上を正確に測定して培地表面全体に広げる．4．5．4．2．1．の規定どおりに培養し，測定する．

4．5．4．3．最確数(MPN)法

MPN法の精度及び正確さは，メンブランフィルター法又はカンテン平板法よりも劣っている．特にかびの測定に対しては信頼性が低い．これらの理由のために，MPN法は他に利用できる方法がない状況下でのTAMCの測定に用いられる．本法を適用する場合は，以下のように行う．

4．5．1．～4．5．3．の記載どおりに，製品の少なくとも3連続の10倍段階希釈系列を調製する．各希釈段階からそれぞれ1g又は1mLずつをとり，ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地が9～10mL入っている3本の試験管にそれぞれ接種する．必要ならば，ポリソルベート80のような界面活性剤，又は抗菌剤の不活化剤を培地に添加することができる．したがって，3段階の希釈系列を調製した場合には，9本の試験管に接種することになる．

全ての試験管を30～35℃で3日間を超えない期間培養する．被験製品の性質によって結果の判定が困難あるいは不確かな場合は，同じ培地又はソイビーン・カゼイン・ダイジェストカンテン培地に移植後，同じ温度で1～2日間培養し，これらの結果を用いる．表4．05―Ⅰ―3から被験製品1g又は1mL当たりの微生物の最確数を求める．

4．6．結果及び判定

メンブランフィルター法又はカンテン平板法の適合性を確認するとき，いずれの試験菌の平均計測値も，4．5．2．で定義した製品が存在しない対照の計測値の1／2～2倍以内でなければならない．MPN法の適合性を確認するとき，試験菌の計測値は，対照から得られる結果の95％信頼限界の範囲内でなければならない．

記述したいずれの方法においても，試験菌のうち1菌種でも上記の基準に満たない場合には，基準に最も近くなる方法と試験条件で製品を試験する．

5．製品の試験

5．1．試験量

別に規定するもののほか，上記の注意を払って採取した被験製品の10g又は10mLを用いる．エアゾール形式の液体又は固体は，10容器を抜き取る．経皮吸収パッチは，10パッチを抜き取る．

次のような条件で処方される原薬は，試験量を減らすことができる：投与単位(例えば錠剤，カプセル剤，注射剤)当たりの原薬量が1mg以下，又は1gあるいは1mL(投与単位では表示されていない製剤)当たりの原薬量が1mg未満．これらの場合，被験試料の採取量は，製品の10投与単位又は10gあるいは10mLに存在する量よりも少なくないようにする．

原薬として使用される物質では，試料の量に限りがあるか又はロットサイズが極度に小さい(すなわち，1000mL又は1000g未満)場合には，より小さな量が規定されているか又は正当な理由がない限り，試験量をロットの1％とする．

ロットを構成しているものの総数が200未満(例えば臨床試験で使われる試料)のような製品では，試験量は2単位に，又は数量が100未満の場合は1単位に減らすことができる．

バルク原料又は製剤の収納容器から，無作為に試料を選び出す．必要量の試料を得るために，十分な数の容器の内容物を混合する．

5．2．製品の試験

5．2．1．メンブランフィルター法

フィルターを培地に移すことができるように設計されているろ過装置を用いる．4．に記載されたとおりに適合性が示された方法で試料を調製し，適量を2枚のメンブランフィルターの各々に移して直ちにろ過する．適合性が確認された方法に従って，各フィルターを洗浄する．

1枚のメンブランフィルターは，TAMCの測定のためにソイビーン・カゼイン・ダイジェストカンテン培地の表面に，他の1枚のメンブランフィルターは，TYMCの測定のためにサブロー・ブドウ糖カンテン培地の表面に移す．ソイビーン・カゼイン・ダイジェストカンテン培地を30～35℃で3～5日間，サブロー・ブドウ糖カンテン培地を20～25℃で5～7日間培養する．製品1g又は1mL当たりの集落数を算出する．

経皮吸収パッチを試験するときは，4．5．1．に記載されている調製液の10％量ずつを2枚の滅菌メンブランフィルターで別々にろ過する．1枚のメンブランフィルターはTAMCの計測のためにソイビーン・カゼイン・ダイジェストカンテン培地に移し，他のメンブランフィルターはTYMCの計測のためにサブロー・ブドウ糖カンテン培地に移す．

5．2．2．カンテン平板法

5．2．2．1．カンテン平板混釈法

4．に記載されたとおりに適合性が示された方法で試料を調製する．それぞれの培地に対し，希釈段階ごとに少なくとも2枚のペトリ皿を用意する．ソイビーン・カゼイン・ダイジェストカンテン培地は30～35℃で3～5日間培養し，サブロー・ブドウ糖カンテン培地は20～25℃で5～7日間培養する．集落数がTAMCでは250未満，TYMCでは50未満で，かつ最も多い集落数を示す希釈度のカンテン培地を選び出す．培地ごとに菌数の算術平均をとり，製品1g又は1mL当たりの集落数を算出する．

5．2．2．2．カンテン平板表面塗抹法

4．に記載されたとおりに適合性が示された方法で試料を調製する．それぞれの培地に対し，希釈段階ごとに少なくとも2枚のペトリ皿を用意する．培養及び集落数の算出は，カンテン平板混釈法に記載されているとおりに行う．

5．2．3．最確数法

4．に記載されたとおりに適合性が示された方法で試料を調製し，希釈する．全ての試験管を30～35℃で3～5日間培養する．必要ならば，適合性が示された方法で移植培養する．希釈段階ごとに，微生物の増殖が認められる試験管数を記録する．表4．05―Ⅰ―3から被験製品1g又は1mL当たりの微生物の最確数を求める．

5．3．結果の判定

ソイビーン・カゼイン・ダイジェストカンテン培地を使用して測定される集落数を，総好気性微生物数(TAMC)とする．この培地上に真菌の集落が検出されても，TAMCとして測定する．サブロー・ブドウ糖カンテン培地を使用して測定される集落数を，総真菌数(TYMC)とする．この培地上に細菌の集落が検出されても，TYMCとして測定する．細菌の発育のためにTYMCが許容基準を超えることが予測される場合には，抗生物質を含むサブロー・ブドウ糖カンテン培地を使用しても良い．MPN法で計測を行う場合は，算出値はTAMCとする．

微生物学的品質の許容基準が規定されているときは，以下のように判定する．

－10¹CFU：最大許容数＝20，

－10²CFU：最大許容数＝200，

－10³CFU：最大許容数＝2000，以下同様．

推奨される溶液及び培地は，「特定微生物試験」に記載されている．

表4．05―Ⅰ―3　微生物の最確数