○水道における指標菌及びクリプトスポリジウム等の検査方法について
(平成19年3月30日)
(健水発第0330006号)
(各都道府県・市・特別区水道行政担当部(局)長あて厚生労働省健康局水道課長通知)
水道行政の推進につきましては、日頃から格別のご協力を賜り厚くお礼申し上げます。
さて、水道におけるクリプトスポリジウム等の対策については、今般、最新の科学的知見等を踏まえ、「水道施設の技術的基準を定める省令」(平成12年厚生省令第15号。以下、「施設基準省令」という。)を改正するとともに、新たに、「水道におけるクリプトスポリジウム等対策指針」(平成19年3月30日付け健水発第0330005号通知の別添。以下、「指針」という。)が示され、平成19年4月1日より適用することとしたところですが、指針中2．及び3．の(2)において別に定めることとした「水道における指標菌及びクリプトスポリジウム等の検査方法」を別添1～3のとおり示したので、下記事項に御留意の上、貴管下の水道事業者等に対する検査方法の周知方お願いします。
なお、当省においては、引き続き新たな知見の集積を行い、適宜検査方法を見直していくこととしておりますので、貴職の御協力を併せてお願いします。
記
第1 検査方法の概要
1．指標菌の検査方法
(1) 大腸菌の検査方法
現在、水道原水の大腸菌の検査方法として、広く標準的に使用されている方法を基に、「特定酵素基質培地法」を別添1に示した。なお、別添1内4試験操作においては、水道原水におけるクリプトスポリジウム等による汚染のおそれのある施設においては(2)定量試験を用いてもよいこととする。
(2) 嫌気性芽胞菌の検査方法
現在、水道原水の嫌気性芽胞菌の検査方法として、広く標準的に使用されている方法を基に、次の方法を別添2に示した。
・ハンドフォード改良寒天培地法
・M―CP寒天培地法
・DRC(Differential Reinforced Clostridial)培地法
2．クリプトスポリジウム等の検査方法
従来、「水道に関するクリプトスポリジウムのオーシストの検出のための暫定的な試験方法について」(平成10年6月19日付け衛水第49号通知)において、応急対応のための検査方法として定められ、標準的に使用されている方法を基に、「標準的方法」及びその他の方法を別添3に示した。
なお、水道の原水及び給水栓水等についての検査方法、応急対応のための検査方法については、「標準的方法」を用いて行うことを基本とするが、「標準的方法」との比較や添加系における回収実験等を行い、対象水に対する適切性、回収率の信頼性等を確認することができた場合は、その他の方法を用いてもよいこととし、いずれの場合にあっても、試験結果の信頼性が確保できるよう、適切な条件、操作方法を選定すべきであること。
第2 留意事項
1．定期的な原水に係る検査の実施について
水道原水におけるクリプトスポリジウム等による汚染のおそれの程度を把握するため、指針に基づき、できるだけ早期に原水に係る検査の実施体制の整備等につき必要な措置を講じ、定期的に原水のクリプトスポリジウム等及び指標菌の検査を実施すること。
また、平成20年度以降については、原水の指標菌の検査及びクリプトスポリジウム等による汚染のおそれのある施設における原水のクリプトスポリジウム等の検査についても、水道法(昭和32年法律第177号)第20条第1項の規定に基づく水質検査に準じて、水道法施行規則(昭和32年厚生省令第45号)第15条第6項の規定に基づく水質検査計画に位置付けられたいこと。
2．定量的な汚染リスクに関する知見の収集について
クリプトスポリジウム等及び指標菌に関しては、水道原水におけるクリプトスポリジウム等による汚染のおそれの程度に関する定量的な知見が必ずしも十分でないことから、今回示した指標菌及びクリプトスポリジウム等の検査方法により、汚染リスクに関する定量的なデータの集積に努めるべきであること。また、当省においては、これらの知見を踏まえ、今後、定量的な汚染リスクに基づく予防対策等について検討を進めることとしていること。
3．検査方法の見直しについて
当省においては、引き続き新たな知見の集積を行い、通知に示す検査方法と同等以上の方法と認められるものについては、積極的に採用するべく、逐次、検査方法を見直す予定であること。
4．飲料水における検査結果について
飲料水についての検査において、クリプトスポリジウム等の判別が困難な場合には、別途通知により示すこととしているクロスチェック実施要領に基づくクロスチェックにより、検査結果の確認が適切に行なわれるべきものであること。
なお、水道、飲用井戸等(水道法の規制を受けない水道を含む。)から供給される飲料水において、クリプトスポリジウム等の塩素消毒に耐性のある病原生物の検出情報を把握した場合には、「飲料水健康危機管理実施要領について」(平成14年6月28日付け健水発第0628001号通知)に基づき直ちに当職宛に連絡いただくようお願いしているところであるので念のため申し添えます。
また、クリプトスポリジウム等が水道原水中に存在する場合には、紫外線処理を行っても、クリプトスポリジウム等は浄水にも存在することとなるが、紫外線処理が適切に行われている場合には、ヒトに対する感染性はなく、指針に基づく運転管理を確実に実施することにより、浄水の安全性を確保すべきこと。
第3 関係通知の改廃等
平成19年4月1日付けをもって、厚生省生活衛生局水道環境部水道整備課長通知「水道に関するクリプトスポリジウムのオーシストの検出のための暫定的な試験方法について」(平成10年6月19日付け衛水第49号)及び「水道に関するクリプトスポリジウムのオーシストの検出のための暫定的な試験方法の付録の送付について」(平成12年3月30日付け衛水第18号)は廃止する。
別添1 大腸菌の検査方法
特定酵素基質培地法
1 培地及び試薬
(1) 精製水
(2) チオ硫酸ナトリウム
(3) エチルアルコール
(4) MMO―MUG培地
硫酸アンモニウム5g、硫酸マンガン0.5mg、硫酸亜鉛0.5mg、硫酸マグネシウム100mg、塩化ナトリウム10g、塩化カルシウム50mg、ヘペス(N―2―ヒドロキシエチルピペラジン―N'―2―エタンスルホン酸)6.9g、ヘペスナトリウム塩(N―2―ヒドロキシエチルピペラジン―N'―2―エタンスルホン酸ナトリウム)5.3g、亜硫酸ナトリウム40mg、アムホテリシンB 1mg、o―ニトロフェニル―β―D―ガラクトピラノシド500mg、4―メチルウンベリフェリル―β―D―グルクロニド75mg及びソラニウム500mgを無菌的に混合したもの。
MMO―MUG培地を試験容器に10分の1量ずつ分取したものを100ml用MMO―MUG培地という。
MMO―MUG培地を試験容器に100分の1量ずつ分取したものを10ml用MMO―MUG培地という。
これらの培地は、黄色く着色したものは使用しない。
これらの培地は、冷暗所に保存する。
(5) IPTG添加ONPG―MUG培地
硫酸アンモニウム2.5g、硫酸マグネシウム100mg、ラウリル硫酸ナトリウム100mg、塩化ナトリウム2.9g、トリプトース5g、トリプトファン1g、o―ニトロフェニル―β―D―ガラクトピラノシド100mg、4―メチルウンベリフェリル―β―D―グルクロニド50mg、イソプロピル―1―チオ―β―D―ガラクトピラノシド100mg及びトリメチルアミン―N―オキシド1gを精製水約900mlに溶かし、pH値が6.1～6.3となるように調整した後、精製水を加えて1Lとし、ろ過除菌したもの。
IPTG添加ONPG―MUG培地の成分を精製水約80mlに溶かし、pH値が6.1～6.3となるように調整した後、精製水を加えて90mlとし、ろ過除菌した後、試験容器に10mlずつ分注したものを100ml用IPTG添加ONPG―MUG培地という。
IPTG添加ONPG―MUG培地の成分を精製水約450mlに溶かし、pH値が6.1～6.3となるように調整した後、精製水を加えて500mlとし、ろ過除菌した後、試験容器に10mlずつ分注したものを10ml用MMO―MUG培地という。
これらの培地は、冷暗所に保存する。
(6) XGal―MUG培地
塩化ナトリウム5g、リン酸一水素カリウム2.7g、リン酸二水素カリウム2g、ラウリル硫酸ナトリウム100mg、ソルビトール1g、トリプトース5g、トリプトファン1g、4―メチルウンベリフェリル―β―D―グルクロニド50mg、5―ブロモ―4―クロロ―3―インドリル―β―D―ガラクトピラノシド80mg及びイソプロピル―1―チオ―β―D―ガラクトピラノシド100mgを無菌的に混合する。
XGal―MUG培地を試験容器に10分の1量ずつ分取したものを100ml用XGal―MUG培地という。
XGal―MUG培地を試験容器に100分の1量ずつ分取したものを10ml用XGal―MUG培地という。
これらの培地は、冷暗所に保存する。
(7) ピルビン酸添加XGal―MUG培地
塩化ナトリウム5g、硝酸カリウム1g、リン酸一水素カリウム4g、リン酸二水素カリウム1g、ラウリル硫酸ナトリウム100mg、ピルビン酸ナトリウム1g、ペプトン5g、4―メチルウンベリフェリル―β―D―グルクロニド100mg、5―ブロモ―4―クロロ―3―インドリル―β―D―ガラクトピラノシド100mg及びイソプロピル―1―チオ―β―D―ガラクトピラノシド100mgを無菌的に混合する。
ピルビン酸添加XGal―MUG培地を試験容器に10分の1量ずつ分取したものを100ml用ピルビン酸添加XGal―MUG培地という。
ピルビン酸添加XGal―MUG培地を試験容器に100分の1量ずつ分取したものを10ml用ピルビン酸添加XGal―MUG培地という。
これらの培地は、冷暗所に保存する。
(8) 1mol／L水酸化ナトリウム溶液
(9) 希釈水(リン酸塩緩衝希釈水)
リン酸二水素カリウム42.5gを精製水500mlで溶かし、1mol／L水酸化ナトリウム溶液でpH値を7.2に調整した後、精製水を加えて1Lとした溶液1mlを精製水1Lで溶かし、高圧蒸気滅菌したもの
2 器具及び装置
(1) 採水瓶
検査方法告示の別表第1の2(1)の例による。
(2) 試験容器
検水(100ml用若しくは10ml用)と培地が密封できるもので、滅菌したもの
(3) MMO―MUG培地用比色液
検査方法告示の別表第2の2(3)の例による。
(4) IPTG添加ONPG―MUG培地用比色液
検査方法告示の別表第2の2(4)の例による。
(5) XGal―MUG培地用比色液
検査方法告示の別表第2の2(5)の例による。
(6) ピルビン酸添加XGal―MUG培地用比色液
検査方法告示の別表第2の2(6)の例による。
(7) 恒温器
検査方法告示の別表第1の2(3)の例による。
(8) 紫外線ランプ
検査方法告示の別表第2の2(8)の例による。
(9) 紫外線防護眼鏡
3 試料の採取及び保存
検査方法告示の別表第1の3の例による。
4 試験操作
(1) 定性試験
検水100mlを上記1のいずれかの100ml用培地入り試験容器1本に加え、直ちに試験容器を密封し、試験容器を振って培地を溶解又は混合させた後、恒温器内に静置して24時間培養する。培養後、紫外線ランプを用いて波長366nmの紫外線を照射し、蛍光の有無を確認する。培地に対応する比色液より蛍光が強い場合は陽性と判定し、蛍光が弱い場合は陰性と判定する。
(2) 定量試験
a) 検水から希釈検水の調製
検水10mlを採り、希釈水90mlに加えてよく振り混ぜる。次に、その10mlを採り、同様な操作を行いながら希釈を繰り返し、10倍ごとの数段階の希釈検水を作る。10倍希釈法の操作を図―1に示す。
なお、希釈検水は、微生物が増殖することや死滅することもあるので、室温に30分間以上放置してはならない。
図―1 10倍希釈法の操作
b) 培養操作
検水10mlを上記1のいずれかの10ml用培地入り試験容器5本に接種する。次いで、各段階の希釈検水について、同様に操作する。接種後、容器を振って培地を溶解あるいは混合させ、恒温器に収め、35～37℃で24時間培養する。なお、接種の際に、5本以上の接種本数となる組み合わせを用いてもよい。培養後、紫外線ランプを用いて波長366nmの紫外線を照射し、蛍光の有無を確認する。培地に対応する比色液より蛍光が強い場合は陽性と判定し、弱い場合は陰性と判定する。
c) 菌数の算出
検水、各段階の希釈検水列の陽性管数を数え、最確数法に従って対応する最確数を求める。
別添2 嫌気性芽胞菌の検査方法
第1 ハンドフォード改良寒天培地法
1 培地及び試薬
(1) 精製水
(2) チオ硫酸ナトリウム
(3) 標準濃度ハンドフォード改良寒天培地
大豆ペプトン4.8g、ペプトン15g、酵母エキス4.8g、クエン酸鉄アンモニウム0.90g、4―メトキシ―6―スルファ―ニルアミドピリミジン0.09g、ピロ亜硫酸ナトリウム0.90g、オレアンドマイシン0.48mg若しくはエリスロマイシン0.06mg、硫酸ポリミキシンB9,000単位、カナマイシン0.048g、粉末寒天18gを精製水1Lに加熱溶解し、滅菌後のpH値が7.5～7.7となるように調整した後、高圧蒸気滅菌したもの
この培地は、恒温水槽で約45℃に保温し、三重層法に用いる。
この培地は、使用の都度調製する。
(4) 標準濃度ハンドフォード改良寒天平板培地
標準濃度ハンドフォード改良寒天培地を疎水格子用ペトリ皿又はメンブランフィルター用ペトリ皿に約15mlずつ分注して平板に固めたもの
この培地は、疎水格子フィルター法及びメンブランフィルター法に用いる。
この培地は、使用の都度調製する。
(5) 1.67倍濃度ハンドフォード改良寒天培地
標準濃度ハンドフォード改良寒天培地の各成分を精製水600mlを用いて(1)と同様に調製したもの
この培地は、パウチ法に用いる。
この培地は、使用の都度調製する。
(6) 1mol／L水酸化ナトリウム溶液
(7) 希釈水(リン酸塩緩衝希釈水)
特定酵素基質培地法による大腸菌の検査方法の1(6)の例による。
2 器具及び装置
(1) 採水瓶
検査方法告示の別表第1の2(1)の例による。
(2) 加熱用容器
容量100ml以上のもので、滅菌したもの
(3) 疎水格子フィルター
50mm四方で1mm四方の1600区画にわけられているもので、滅菌したもの
(4) 疎水格子フィルターろ過装置
滅菌したもの
(5) 疎水格子用ペトリ皿
検査方法告示の別表第1の2(2)の例による。
(6) メンブランフィルター
孔径0.2～0.45μm、直径47mmのもので、滅菌したもの
(7) メンブランフィルターろ過装置
滅菌したもの
(8) メンブランフィルター用ペトリ皿
直径約5cm、高さ約1.5cmのものであって、ガラス製又はプラスチック製で滅菌したもの
(9) 嫌気ジャー
内部の酸素を除去し、嫌気状態にすることができるもの
(10) パウチ
滅菌したもの
(11) プラスチックシーラー
(12) 恒温水槽
水温を45℃又は75℃に保持できるもの
(13) 恒温器
温度を44～46℃に保持できるもの
3 試料の採取及び保存
検査方法告示の別表第1の3の例による。
4 試験操作
(1) 検水の加熱処理
検水約100mlを加熱用容器に採り、75℃の恒温水槽に20分間浸して加熱した後、速やかに氷水に浸して冷やす。
(2) 希釈検水の調製
特定酵素基質培地法による大腸菌の定量方法の4(1)の例による。
(3) 培養操作
次のいずれかの培養操作を行う。なお、汚染の著しい検水では希釈検水を用いてもよい。
a) 疎水格子フィルター法
疎水格子フィルターろ過装置にフィルターを装着し、ファンネルに加熱処理した検水又は希釈検水の30ml以上を入れ、吸引ろ過する。検水又は希釈検水のろ過が終了した後、希釈水20～30mlによりファンネル内壁を洗浄し、検水の場合と同様に吸引ろ過する。この洗浄ろ過操作を2～3回繰り返す。ろ過が完了した後、フィルターをろ過装置から外し、フィルターのろ過面を上にして気泡が入らないように標準濃度ハンドフォード改良寒天平板培地に密着させる。これを倒置して嫌気ジャーに入れて恒温器に収め、44～46℃で22～26時間培養する。
培養後、直径0.25mm以上の黒色集落をウェルシュ菌芽胞と判定する。
b) メンブランフィルター法
メンブランフィルターろ過装置にフィルターを装着し、ファンネルに加熱処理した検水又は希釈検水の30ml以上を入れ、吸引ろ過する。検水又は希釈検水のろ過が終了した後、希釈水20～30mlによりファンネル内壁を洗浄し、検水の場合と同様に吸引ろ過する。この洗浄ろ過操作を2～3回繰り返す。ろ過が完了した後、フィルターをろ過装置から外し、フィルターのろ過面を上にして気泡が入らないように標準濃度ハンドフォード改良寒天平板培地に密着させる。これに標準濃度ハンドフォード改良寒天培地約10mlを重層して固化した後、更に標準濃度ハンドフォード改良寒天培地約5mlを重層する。これを嫌気ジャーに入れて恒温器に収め、44～46℃で22～26時間培養する。
培養後、直径1mm以上の黒色集落をウェルシュ菌芽胞と判定する。
c) 三重層法
標準濃度ハンドフォード改良寒天培地5～10mlをペトリ皿2枚以上に注いで固めた平板をあらかじめ用意する。次いで、加熱処理した検水又は希釈検水1mlずつをペトリ皿の中央部に入れ、溶解して約45℃に保温した標準濃度ハンドフォード改良寒天培地約10mlを注いだ後、直ちに蓋をし、速やかに前後左右に揺り動かして検水と培地を十分に混和させ、平板に固めて混釈平板とする。次に、この平板に溶解して保温した標準濃度ハンドフォード改良寒天培地約5mlを注いで直ちに蓋をし、ペトリ皿を静かに揺り動かして混釈平板の表面全体に培地を行きわたらせた後、静置し、平板に固める。培地が固まったことを確認した後、これを嫌気ジャーに入れて恒温器に収め、44～46℃で22～26時間培養する。
培養後、直径1mm以上の黒色集落をウェルシュ菌芽胞と判定する。
d) パウチ法
加熱処理した検水をパウチ2枚以上に10mlずつ入れ、1.67倍濃度ハンドフォード改良寒天培地15mlを加え、直ちに指でよく揉んで検水と培地を十分に混合する。培地に混入した気泡をパウチの首部に集めて排除した後、パウチ首部をプラスチックシーラーで溶着して封じ、平らな面において室温で平板状に固める。これを恒温器に収め、44～46℃で22～26時間培養する。
培養後、直径1mm以上の黒色集落をウェルシュ菌芽胞と判定する。
5 菌数の算出
ウェルシュ菌芽胞と判定された集落をそれぞれの方法の計数方法に従って計数し、菌数を算出する。
第2 M―CP寒天培地法
1 培地及び試薬
(1) 精製水
(2) チオ硫酸ナトリウム
(3) M―CP寒天平板培地
トリプトース3.0g、粉末酵母エキス2.0g、シュクロース0.50g、L―システイン塩酸塩0.10g、硫酸マグネシウム(7水塩)0.01g、ブロモクレゾールパープル0.004g、粉末寒天1.5gを精製水90mlに加熱溶解し、pH値を7.6に調整した後、高圧蒸気滅菌し、滅菌後、速やかに約50℃に冷却した後、D―シクロセリン0.04g、ポリミキシンB硫酸塩0.0025g、インドキシル―β―Dグルコシド溶液8ml、フェノールフタレイン二リン酸塩溶液2ml、塩化第二鉄溶液0.2mlを無菌的に加えて混合し、調製後、直ちに疎水格子用ペトリ皿には約10mlずつ、メンブランフィルター用ペトリ皿には約3mlずつ分注して平板に固めたもの
この培地を保存する場合は、密閉容器に入れて冷蔵庫に収める。
この培地は、調製後96時間以内に使用する。
(4) インドキシル―β―D―グルコシド溶液
インドキシル―β―D―グルコシド0.060gを滅菌精製水8mlで溶かしたもの
この溶液は、使用の都度調製する。
(5) フェノールフタレイン二リン酸塩溶液
フェノールフタレイン二リン酸塩0.50gを精製水100mlで溶かした後、高圧蒸気滅菌したもの
(6) 塩化第二鉄溶液
塩化第二鉄(6水塩)4.5gを精製水100mlで溶かした後、ろ過除菌したもの
(7) アンモニア水(25％～30％)
(8) 1mol／L水酸化ナトリウム溶液
(9) 希釈水(リン酸塩緩衝希釈水)
特定酵素基質培地法による大腸菌の検査方法の1(6)の例による。
2 器具及び装置
(1) 採水瓶
検査方法告示の別表第1の2(1)の例による。
(2) 加熱用容器
第1の2(2)の例による。
(3) 疎水格子フィルター
第1の2(3)の例による。
(4) 疎水格子フィルターろ過装置
第1の2(4)の例による。
(5) 疎水格子用ペトリ皿
検査方法告示の別表第1の2(2)の例による。
(6) メンブランフィルター
第1の2(6)の例による。
(7) メンブランフィルターろ過装置
第1の2(7)の例による。
(8) メンブランフィルター用ペトリ皿
第1の2(8)の例による。
(9) 嫌気ジャー
(10) 恒温水槽
水温を44.8～45.2℃に保持できるもの
(11) 恒温器
第1の2(13)の例による。
3 試料の採取及び保存
検査方法告示の別表第1の3の例による。
4 試験操作
(1) 検水の加熱処理
第1の4(1)の例による。
(2) 希釈検水の調製
特定酵素基質培地法による大腸菌の定量方法の4(1)の例による。
(3) 培養操作
疎水格子フィルターろ過装置又はメンブランフィルターろ過装置にフィルターを装着し、ファンネルに加熱処理した検水又は希釈検水の30ml以上を入れ、吸引ろ過する。
検水又は希釈検水のろ過が終了した後、希釈水20～30mlによりファンネル内壁を洗浄し、検水の場合と同様に吸引ろ過する。この洗浄ろ過操作を2～3回繰り返す。ろ過が完了した後、フィルターをろ過装置から外し、メンブランフィルター又は疎水格子フィルターのろ過面を上にして、気泡が入らないようにM―CP寒天平板培地に密着させる。これを倒置して嫌気ジャーに入れ、恒温水槽に沈め、44.8～45.2℃で18～24時間培養する。
培養後、直径1mm以上の不透明な青～黄色集落をマークした後、フィルター上の集落をアンモニア蒸気に20～30秒接触させ、直ちに集落の色調を観察する。このとき、マークしたもののうち、アンモニア蒸気の接触によりピンク色～赤色(紫色は除く)に変色したものをウェルシュ菌芽胞と判定する。
5 菌数の算出
ウェルシュ菌芽胞と判定された集落を計数方法に従って計数し、菌数を算出する。
第3 DRC(Differential Reinforced Clostridial)培地法
1 培地及び試薬
(1) 精製水
(2) チオ硫酸ナトリウム
(3) 標準濃度DRC基礎培地
少量の精製水を用いて溶性デンプン1.0gをスラリー状とし、沸騰した精製水180mlを加え、かき混ぜて溶かし、このデンプン溶液をペプトン10g、粉末酵母エキス1.5g、肉エキス10g、酢酸ナトリウム(3水塩)5.0gを溶解した混合液に加え、全量を1Lとし、加熱溶解後、ブドウ糖1.0gとL―システイン0.50gを加えて溶かし、滅菌後のpH値が7.1～7.2になるように調整した後、ねじ口瓶100mlに100mlずつ分注し、高圧蒸気滅菌したもの
この培地を保存する場合は、滅菌後、冷蔵庫に収める。
(4) 2倍濃度DRC基礎培地
標準濃度DRC基礎培地の各成分の2倍量を精製水1Lを用いて(1)と同様に調製した後、ねじ口瓶25mlには1mlずつ又は10mlずつ、ねじ口瓶100mlには50mlずつ分注し、高圧蒸気滅菌したもの
この培地を保存する場合は、滅菌後、冷蔵庫に収める。
(5) 1ml用DRC培地(2倍濃度)
亜硫酸ナトリウム・クエン酸第二鉄混合液0.04mlを2倍濃度DRC基礎培地1mlに無菌的に加えて混合したもの
この培地は、使用の都度混合調製する。
(6) 10ml用DRC培地(2倍濃度)
亜硫酸ナトリウム・クエン酸第二鉄混合液0.4mlを2倍濃度DRC基礎培地10mlに無菌的に加えて混合したもの
この培地は、使用の都度混合調製する。
(7) 50ml用DRC培地(2倍濃度)
亜硫酸ナトリウム・クエン酸第二鉄混合液2mlを2倍濃度DRC基礎培地50mlに無菌的に加えて混合したもの
この培地は、使用の都度混合調製する。
(8) 標準濃度DRC培地
亜硫酸ナトリウム・クエン酸第二鉄混合液2mlを標準濃度DRC基礎培地100mlに無菌的に加えて混合したもの
この培地は、使用の都度混合調製する。
(9) リトマス牛乳培地
生牛乳では15分間煮沸、氷室に一夜静置した後、上に浮いたクリームを捨てたもの、脱脂粉乳では20gを温精製水180mlで溶かしたものに、リトマス溶液を青紫色を呈するように加え、液層の高さが4cm程度になるように試験管に分注し、間欠滅菌したもの
(10) 亜硫酸ナトリウム溶液
亜硫酸ナトリウム4.0gを精製水100mlに溶かし、ろ過除菌後、ねじ口瓶100mlに入れたもの
この溶液は、冷蔵庫で保存し、2週間以内に使用する。
(11) クエン酸第二鉄溶液
クエン酸第二鉄7.0gを精製水100mlに溶かし、ろ過除菌後、ねじ口瓶100mlに入れたもの
この溶液は、冷蔵庫で保存し、2週間以内に使用する。
(12) 亜硫酸ナトリウム・クエン酸第二鉄混合液
亜硫酸ナトリウム溶液とクエン酸第二鉄溶液を等量ずつ、無菌的に混合したもの
この溶液は、使用の都度調製する。
(13) リトマス溶液
リトマス1gを精製水10mlに溶かしたもの
(14) 1mol／L水酸化ナトリウム溶液
(15) 希釈水(リン酸塩緩衝希釈水)
特定酵素基質培地法による大腸菌の検査方法の1(6)の例による。
2 器具及び装置
(1) 採水瓶
検査方法告示の別表第1の2(1)の例による。
(2) ねじ口瓶：容量25ml及び100mlのもの。
(3) 加熱用容器
第1の2(2)の例による。
(4) 白金線又は白金耳
(5) 恒温器
温度を35～37℃に保持できるもの
3 試料の採取及び保存
検査方法告示の別表第1の3の例による。
4 試験操作
(1) 定性試験
a) 推定試験
(a) 検水の加熱処理
第1の4(1)の例による。
(b) 培養操作
加熱処理した検水50mlを50ml用DRC培地1本に接種する。次いで、標準濃度DRC培地をねじ口瓶の首上端まで満たす。これを恒温器に収め、35～37℃で45～51時間培養する。
培養後、培地が黒変したものを推定試験陽性とする。
b) 確定試験
推定試験で黒変が認められたねじ口瓶から白金耳を用いて1白金耳量を採り、リトマス牛乳培地に移植する。これを恒温器に収め、35～37℃で45～51時間培養する。
培養後、培地が凝固し、“顕著な塊”がガスによって試験管の上部にまで盛り上がる状況を呈したものを確定試験陽性とし、ウェルシュ菌芽胞と判定する。
(2) 定量試験
a) 推定試験
(a) 検水の加熱処理
第1の4(1)の例による。
(b) 希釈検水の調製
特定酵素基質培地法による大腸菌の定量方法の4(1)の例による。
(c) 培養操作
加熱処理した検水は、10ml用DRC培地5本に10mlずつ、1ml用DRC培地5本に1mlずつ接種する。次いで、各段階の希釈検水は、それぞれ1ml用DRC培地5本に1mlずつ接種する。次いで、標準濃度DRC培地を瓶の首上端まで満たす。
これを恒温器に収め、35～37℃で45～51時間培養する。
培養後、培地が黒変したものを推定試験陽性とする。
b) 確定試験
推定試験で黒変が認められたねじ口瓶から白金耳を用いて1白金耳量を採り、リトマス牛乳培地に移植する。これを恒温器に収め、35～37℃で45～51時間培養する。
培養後、培地が凝固し、“顕著な塊”がガスによって試験管の上部にまで盛り上がる状況を呈したものを確定試験陽性とし、ウェルシュ菌芽胞と判定する。
5 菌数の算出
各希釈段階の陽性管数を数え、最確数法に従って対応する最確数を求める。
別添3 水道に関するクリプトスポリジウム等の検出のための試験方法
概要
本試験方法は水中に存在するクリプトスポリジウムのオーシスト及びジアルジアのシスト(以下「オーシスト等」という)を精製・濃縮し、クリプトスポリジウム及びジアルジア(以下「クリプトスポリジウム等」という)を検出するためのものである。このうち蛍光抗体染色―顕微鏡検査法はオーシスト等の捕捉・濃縮、選択的な分離・精製、蛍光抗体染色、顕微鏡観察の諸工程からなり、顕微鏡下で蛍光を発する粒子の寸法、外部・内部形態に基づいてオーシスト等を検出・計数する方法である。一方、遺伝子検出法は特異的な遺伝子増幅を行い、増幅の有無によりクリプトスポリジウム等を検出する方法である。
留意事項
一般に、水道原水、沈殿水等には多種多様の無機物、有機物、微生物等が存在している。水道水中にもその一部や浄水用薬品の反応生成物等が混入している。試料によっては、それらの物質がオーシスト等の検出を妨害することがある。特に、一部の藻類は大きさ、形態等がオーシスト等に酷似しており、それらが蛍光抗体試薬と交叉反応などにより偽陽性を示し、オーシスト等との判別が困難となることが知られている。
本試験方法の作成に当たっては、使用可能と考えられる複数の方法について併せて採用することとし、
2 試料水からの懸濁粒子の捕捉・濃縮については、
2．1 メンブレンフィルター吸引ろ過―アセトン溶解法
2．2 メンブレンフィルター加圧ろ過―アセトン溶解法
2．3 親水性PTFEメンブレンフィルター法
2．4 粉体ろ過法
2．5 ポリカーボネートメンブレンフィルター法
2．6 カートリッジフィルター法
2．7 遠心沈殿法
3 オーシスト等の選択的な分離・精製については、
3．1 密度勾配遠沈法(浮遊法)
3．2 免疫磁性体粒子法(免疫磁気ビーズ法)
4 オーシスト等の検出については、
4．1 蛍光抗体染色―顕微鏡検査法
4．1．1 直接蛍光抗体染色法
4．1．2 間接蛍光抗体染色法
4．1．3 顕微鏡観察
4．2 遺伝子検出法
を並列的に記載した。また、以下の項目を付記した。
付録1 精度管理のためのオーシスト等の添加実験
付録2 顕微鏡の取扱い
付録3 顕微鏡観察における蛍光フィルター選択と観察上の注意
付録4 遺伝子検出法におけるオーシスト等の定量
［参考］ 検査室におけるクリプトスポリジウム等の感染防止方法
このうち、知見が集積されている「標準的方法」(2．1、2．2又は2．3と、3．1及び4．1を組み合わせた方法)については、すべての試験操作等を確定的に記述した。しかしながら、検出の原理を損なわず、かつ回収率を損なわないことが確実であるか、あるいは一層の改善が得られることが明らかな場合は、必要に応じて適宜、部分的な変更や改良を加えても差し支えない。
一方、標準的方法以外の方法については基本操作と留意事項を記述した。必要に応じて、標準的方法との比較や添加系における回収実験等を行い、対象水に対する適切性、回収率等を確認することが適当である。
なお、検査機器等の整備に当たっては、試験の目的、対象水の水質等に応じて選択した方法に必要な試薬、器具、器材を用意すればよく、試験方法に記載されているすべての試薬、器具、器材等を用意する必要はない。
1 試料の採取
クリプトスポリジウム等は感染力が強いため、水道では低濃度でも問題になる。このため、原水、水道水ともに大量の水を採取して試験しなければならない。また、ガラス壁に付着しやすい性質があるといわれていることから、採取容器は大型のポリエチレン又はポリプロピレン製容器を用いる。
試料水の量は原水で概ね10L、水道水で20Lを標準とし、その全量を用いて検査する。応急対応のための検査にあっては、水道水40L(消毒のみで給水する水道等であって原水を対象とする場合も原水40L)を採水場所毎に3試料採取し、その全量を濃縮して、各濃縮物の半量を検査し、残りの半量を保存しなければならない。
1) 器具
試料容器：容量10Lまたは20Lのポリエチレン又はポリプロピレン製で、スクリューキャップ付きのもの。あらかじめ採水量に相当する目盛りを付しておくとよい。
2) 操作
試料水の適量を試料容器に採取し、密栓して24時間以内に試験室に搬入し、速やかに濃縮処理を行う。
備考 予め界面活性剤を加えることで、試料の試料容器への付着を防止することによる回収率の向上が期待できる。ただし、試料水からの懸濁粒子の捕捉・濃縮の際に吸引ろ過法を用いる場合を除く。
2 懸濁粒子の捕捉・濃縮
試料水中の懸濁粒子を捕捉して濃縮する方法には、アセトン溶解性のメンブレンフィルターを用いた吸引ろ過法あるいは加圧ろ過法、親水性PTFEメンブレンフィルター法、粉体ろ過法、アセトン非溶解性のポリカーボネートメンブレンフィルター法(吸引ろ過法又は加圧ろ過法)、カートリッジフィルター法、遠心沈殿法がある。このうち、粉体ろ過法、ポリカーボネートメンブレンフィルター法、カートリッジフィルター法、遠心沈殿法についてはいずれも知見の集積が少なく、適用できる水質や操作条件等の詳細が必ずしも十分には明らかになっていないので、基本操作及び留意事項を記載するに留めた。これらの未確定な方法を採用する場合は、予備的検討を行い、適正な条件を設定する必要がある。
2．1 メンブレンフィルター吸引ろ過―アセトン溶解法
本法は、孔径1μm付近のアセトン溶解性メンブレンフィルターを用いて吸引ろ過したのち、メンブレンフィルターをアセトンにより完全溶解して除去し、残った沈渣を濃縮物として回収する方法である。高濁度試料水の場合は多量のメンブレンフィルターを要するなどの難点がある。
1) 試薬
(1) 精製水：イオン交換水又は蒸留水等の精製水で、クリプトスポリジウム等による汚染のないもの。
(2) 10倍濃度PBS(10倍濃度リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4)：精製水約800mLに塩化ナトリウム80g、塩化カリウム2g、リン酸二水素カリウム2g、リン酸一水素ナトリウム12水和物29gを溶解し、1N塩酸または1N水酸化ナトリウムを用いてpH7.4に調整したのち、精製水を加えて1Lとする。
(3) PBS(リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4)：精製水900mLに10倍濃度PBS100mLを加えて混合する。pH値を確認し、必要に応じて0.1N塩酸又は0.1N水酸化ナトリウムを用いてpH7.4に調整する。
(4) 界面活性剤加PBS(界面活性剤添加リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4)：PBS1LにPolyoxyethylene(20)sorbitan monooleate(Tween80又はそれと同等のもの)1mLを加え、混和する。
(5) アセトン：試薬特級
(6) エタノール：試薬特級
2) 器具及び器材
(1) 吸引ポンプ
(2) 吸引瓶又はマニホールド(フィルターホルダーセット用)
(3) フィルターホルダーセット(ベース、ファネル、固定金具)
(4) トラップ用吸引瓶(ろ過水用及びアセトン廃液用)
(5) メンブレンフィルター：孔径1μm付近で、アセトンに完全溶解するセルロース混合エステルタイプの材質のもの。
(6) フィルター用ピンセット
(7) 連結用チューブ
(8) 遠沈管：容量15mL又は50mLのポリプロピレン製でスクリューキャップ付きのもの。目盛付きのものが使用しやすい。
(9) 遠心沈殿機：遠心荷重1,050×g(半径15cmスイング型ローターで2,500rpmに相当)が保証でき、15mL及び50mL遠沈管用多本掛バスケット付きで、ブレーキの解除ができるもの。
(10) アスピレーター
(11) パスツールピペット又は駒込ピペット
3) 操作
(1) ろ過装置の組立：吸引ろ過装置にメンブレンフィルターをセットし、［フィルターホルダーをセットした吸引瓶又はマニホールド］―［トラップ用吸引瓶］―［吸引ポンプ］の順にチューブ等で連結する。
(2) ろ過：試料水をファネルに注ぎ、吸引ポンプを用いて吸引ろ過する注1、2)。試料水を全てろ過し終わったのち、試料容器に界面活性剤加PBS200～300mLを加え、強く振とうして内部を洗浄し、洗液を同様にろ過する。さらに試料容器に精製水200～300mLを加えて内部を再度すすぎ、すすぎ液を同様にろ過する。
注1) 試料容器内の全量をろ過する。
注2) ろ過速度が遅くなり始めた時点で試料水の供給を停止してメンブレンフィルターを交換する。ろ過済みのメンブレンフィルターは乾燥させないように注意して保管する。
(3) 回収
i) メンブレンフィルターの溶解・除去：ろ過に用いたメンブレンフィルターを遠沈管に入れる注1)。十分量注2)のアセトンを速やかに加え、スクリューキャップを強く閉め注3)、直ちに強く攪拌してメンブレンフィルターを溶解した後注4)、1,050×gで10分間遠心する。上清(アセトン層)を吸引除去注5、6)した後、沈渣をよくほぐし、再び十分量注2)のアセトンを加えて強く攪拌して沈渣を完全に分散させる。これを1,050×gで10分間遠心し上清を吸引除去する注7)。
ii) アセトン除去と水和：遠沈管内の沈渣に遠沈管容量の約1／10量注8)のエタノールを加えて十分攪拌したのち、エタノールと等量のPBSを加えて再び充分攪拌する。繰り返し攪拌しながらPBSを徐々に加えて遠沈管を満たした後、1,050×gで10分間遠心する。上清を捨て、沈渣を丁寧にほぐした後、PBS約10mL注9)を加えてよく攪拌し、1,050×gで10分間遠心して、上清を捨てる。
得られた沈渣の量が少なく顕微鏡観察に支障がない場合はそのまま4オーシスト等の検出に移る。沈渣が多い場合は3オーシスト等の分離精製を行った後、4オーシスト等の検出に移る。
注1) 一度に処理するメンブレンフィルターの枚数は、15mL遠沈管の場合47mm径メンブレンフィルター5枚、50mL遠沈管の場合142mm径メンブレンフィルター2枚程度を上限とし、極力少なくすることが望ましい。
注2) 加えるアセトン量は、15mL遠沈管の場合12mL、50mL遠沈管の場合45mL程度とする。
注3) アセトンの揮発防止のため、遠沈管のスクリューキャップをしっかりと閉める。
注4) アセトンを加えたまま放置するとメンブレンフィルターが溶解しなくなり、フィルター残渣が生じる。
注5) アスピレーターの使用が可能であるが、アセトン廃液は所定の廃棄物処理を行う。
注6) 試料にフィルター成分が残ると、次の水和処理で析出して沈渣が固化し、回収率が低下する等の問題が生じるおそれがある(フィルター成分の残存は、多くのフィルターを少ないアセトンで溶解した場合に特に見られる)。そのため、遠心沈殿後のアセトン上清を精製水に滴下し、フィルター成分の析出がないことを確認するとよい。
注7) 沈渣にフィルター残渣が認められるようであれば、アセトンによる遠心洗浄を繰り返す。
注8) 沈渣量が多い場合は、沈渣の量に応じてエタノールを適宜増量する。
注9) 沈渣量が多い場合は、沈渣の量に応じてPBSを適宜増量する。
2．2 メンブレンフィルター加圧ろ過―アセトン溶解法
本法は、2．1メンブレンフィルター吸引ろ過―アセトン溶解法と同様、孔径1μm付近のアセトン溶解性メンブレンフィルターを用いるが、ろ過を加圧方式で行う点が異なる。吸引ろ過法に比べて比較的多量の試料水をろ過できる利点がある。
1) 試薬
2．1 1)に同じ。
2) 器具及び器材
(1) 加圧装置：ペリスタポンプ
(2) 加圧ろ過用フィルターホルダーセット
このほかに、2．1 2)の(4)～(11)。
3) 操作
(1) ろ過装置の組立：フィルターホルダーにメンブレンフィルターをセットし、［試料水の入った試料容器］―［加圧装置］―［フィルターホルダー］―［ろ液受け］の順にチューブ等で連結する。
(2) ろ過：メンブレンフィルターに瞬間的に大きな負荷がかからないよう徐々に加圧し、フィルターホルダーの安全弁を開けてチューブ内に溜まった空気を排出する。試料水があふれ出る直前に安全弁を閉じてろ過を開始し、試料容器内の試料水の全量をろ過する注1)。試料水を全てろ過し終わった後、試料容器に界面活性剤加PBS200～300mLを加え、強く振とうして内部を洗浄し、洗液を同様にろ過する。さらに試料容器に精製水200～300mLを加えて内部を再度すすぎ、すすぎ液を同様にろ過する。
(3) 回収：ろ過に用いたすべてのメンブレンフィルターを集め、2．1 3)(3)回収に従って濃縮物を回収する。得られた沈渣の量が少なく顕微鏡観察に支障がない場合はそのまま4オーシスト等の検出に移る。沈渣が多い場合は3オーシスト等の分離・精製を行った後、4オーシスト等の検出に移る。
注1) ろ過速度が遅くなり始めた時点で試料水の供給を停止してメンブレンフィルターを交換する。ろ過済みのメンブレンフィルターは乾燥させないように注意して保管する。
2．3 親水性PTFEメンブレンフィルター法
本法は、孔径5μm以下の親水性PTFEメンブレンフィルターを用いてろ過した後、メンブレンフィルターを50mLの遠沈管に挿入し攪拌子とともに試験管ミキサーを用いて強く攪拌して、メンブレンフィルター上の捕捉物を洗い出す方法である。
1) 試薬
(1) 精製水：2．1 1)(1)に同じ。
(2) 100倍濃度PET(100倍濃度ピロリン酸ナトリウム希釈液)：精製水約800mLにピロリン酸ナトリウム10水塩20g、エチレンジアミン四酢酸3ナトリウム30g、Polyoxyethylene(20)sorbitan monooleate (Tween80またはそれと同等のもの)10mLを溶解し、1N塩酸または1N水酸化ナトリウムを用いてpH7.4に精製したのち、精製水を加えて1Lとする。
(3) 界面活性剤添加ピロリン酸ナトリウム希釈液(PET)：精製水990mLに100倍濃度PET10mLを加えて混合する。
2) 器具および器材
(1) 親水性PTFEメンブレンフィルター：孔径5μm以下、直径142mm、または90mm
(2) フィルターホルダーセット(加圧ろ過の場合)
(3) ペリスタポンプ(加圧ろ過の場合)
(4) 吸引ポンプ(吸引ろ過の場合)
(5) 吸引瓶またはマニホールド(吸引ろ過の場合)
(6) 吸引ろ過用フィルターホルダーセット(吸引ろ過の場合)
(7) 送液チューブ(加圧ろ過の場合)：内径8mmのシリコン製
(8) ホースバンド
(9) フィルター用ピンセット(先端部が鋭利でないもので先が曲がったもの)
(10) 遠沈管：2．1 2)(8)の容量50mLで、目盛り付きのもの。
(11) 試験管ミキサー：出力50W以上
(12) 遠心沈殿機：2．1 2)(9)に同じ。
(13) 攪拌子：長さ35mm、幅16mm、フットボール型
3) ろ過操作
(1) 加圧ろ過の場合
i) PETを試料水1Lに10mLの割合で加え、よく混和する。
ii) フィルターホルダーのサポートスクリーン上に親水性PTFEメンブレンフィルターを重ね、PETで全体を湿らせる。
iii) フィルターホルダーをセットしてチューブポンプと接続し、徐々に試料水を送る。
iv) 上部プレートのエアーベントを開け、ホルダー内の空気を抜きその後閉める。
v) ポンプのろ過速度を上げて毎分2L程度に設定する。
vi) 試料水をすべてろ過し終わったのち、試料容器にPETを200～300mLを加え、強く振とうして内部を洗浄し、洗液を同様にろ過する。
vii) さらに試料容器に精製水200～300mLを加えて内部を再度すすぎ、すすぎ液を同様にろ過する。
viii) ろ過終了後、ポンプの電源を切り、フィルターホルダーの排水側をアスピレーターに接続して、ホルダー内の水をすべて吸引する。
ix) ピンセットを用いてメンブレンフィルターを下図のように折りたたみ、50mL遠沈管(遠沈管1)に入れる。
x) ろ過に数枚のメンブレンフィルターが必要な場合は、ろ過速度の低下、送液チューブの膨張などをみてメンブレンフィルターを交換する(50mL遠沈管には142mmメンブレンフィルターを同時に3枚まで入れることができる)。
xi) 回収操作に進む。
メンブレンフィルターの折りたたみ方
(2) 吸引ろ過の場合
i) フィルターホルダーにメンブレンフィルターをセットし、PETで全体を湿らせる。
ii) 試料水をすべてろ過し終わったのち、試料容器にPETを200～300mLを加え、強く振とうして内部を洗浄し、洗液を同様にろ過する。
iii) さらに試料容器に精製水200～300mLを加えて内部を再度すすぎ、すすぎ液を同様にろ過する。
iv) ろ過終了後、取り外したメンブレンフィルターを(1)と同様に折りたたみ、50mL遠沈管(遠沈管1)に入れる。
v) ろ過に数枚のメンブレンフィルターが必要な場合は、ろ過速度の低下などをみてメンブレンフィルターを交換する(50mL遠沈管には142mmメンブレンフィルターを同時に3枚まで入れることができる)。
vi) 回収操作に進む。
4) 回収操作
(1) 遠沈管1にPET15mLと攪拌子をいれ、回転速度を最大に設定した試験管ミキサーで2分間攪拌する。(時々遠沈管を上下に振り、中のメンブレンフィルターがよく展開するようにする)。
(2) メンブレンフィルターを1枚ずつピンセットで遠沈管1の内面に当てて水分を絞り、メンブレンフィルターと攪拌子を取り出す。
(3) 懸濁液を新しい50mL遠沈管(遠沈管2)に移し、遠沈管1に攪拌子とメンブレンフィルターを戻し、洗い出し液10mLを加え、試験管ミキサーを用いて1分間攪拌し、同様の操作でメンブレンフィルターを取り出し懸濁液を遠沈管2に統合する。
(4) この操作を合計で3回繰り返し、最後に遠沈管1を洗い出し液5mLでリンスし、遠沈管2に統合する(得られる懸濁液の総量は50mLになる)。
遠沈管2を1,050×gで10分間遠心濃縮し、上清を吸引除去する。
2．4 粉体ろ過法
本法は、メンブレンフィルター(支持体)上に直径30μm前後の粉体(酸溶解性のハイドロキシアパタイト粒子)を積層させたケーキろ過層を用いて試料をろ過した後、フィルター部分から分離させたろ過層の粉体を塩酸で溶解し、遠心分離操作により濃縮物を回収する方法である。アセトンを使用しないで済む利点がある一方、次の操作に移行する前に粉体成分のカルシウムと溶解に使用する塩酸を除去し、回収液のpHを中性域に調整する必要がある。したがって、本法の採用に当たっては、予め溶解処理後の遠心洗浄・回収条件を十分検討し、適正な操作条件を設定する必要がある。
粉体ろ過法の基本操作及び留意事項は次の通りである。
均質なろ過層が形成できなければ正確な濃縮が期待できないので、先に精製水をろ過してろ過層に異常がないことや、ろ過条件(圧力や流速など)が正常値の範囲にあることを確認し、試料水のろ過を始める。ろ過層が乱れないよう、連続的にろ過する。試料容器内の試料水が無くなったら界面活性剤加PBSにより容器内部を洗浄し、洗浄液をろ過する。容器の洗浄中は、一時的に界面活性剤加PBSや精製水をろ過し、ろ過の中断を避ける。ろ過層がろ過物により閉塞しないよう、適宜ろ過を停止して粉体ろ過層を交換する。
ろ過濃縮物は、粉体を塩酸で溶解してから、遠心濃縮と洗浄等で取り出す。
なお、本法を採用する場合は以下の点に十分留意する必要がある。
(1) 操作法等については、ろ過層並びにろ過補助装置の用法や使用上の注意に従う。
(2) 懸濁粒子が多い試料では閉塞して複数回のろ過を必要とする。予め目的試料で濁度とろ過回数の関係を確認し、濁度に応じたろ過回数の目安をたてておくと、濃縮法を選択するうえでの判断材料になる。
(3) 免疫磁性体粒子法による精製を行う場合、濃縮物は塩酸を除いて中性にしておかなければ、抗原抗体反応が阻害され、オーシスト等の回収が不能となることに留意する。
(4) ろ過層が乱れると十分な捕捉・濃縮機能を発揮できなくなるため、乱れの原因となるろ過の中断といった圧力変化等が起きないよう留意する。
(5) ろ過が完了した後、直ちに溶解・除去を行わない場合は、ろ過層(メンブレンフィルター含む)を遠沈管等に入れ乾燥させないよう密栓して冷蔵保存する。
(6) その他、試料の操作ロスを極力少なくするため、試料への界面活性剤の添加が有効である。
2．5 ポリカーボネートメンブレンフィルター法
本法は、アセトン溶解性フィルターの代わりにアセトン非溶解性のポリカーボネートメンブレンフィルターを用いる方法である。試料水の水質によってはアセトン溶解性のメンブレンフィルターに比べてろ過に時間を要する場合があるが、メンブレンフィルターからの粒子の剥離が容易であり、アセトンを使用せずに濃縮物を回収できる利点がある。
本法の採用に当たっては、予めメンブレンフィルターからの剥離・回収条件を十分検討し、適正な操作条件を設定する必要がある。
ポリカーボネートメンブレンフィルター法の基本操作及び留意事項は次の通りである。
ポリカーボネートメンブレンフィルター(孔径2μm以下)を用いて、2．1メンブレンフィルター吸引ろ過―アセトン溶解法又は2．2メンブレンフィルター加圧ろ過―アセトン溶解法に準じて吸引ろ過又は加圧ろ過する。ろ過したメンブレンフィルターから、超音波処理、セパレーターによる掻き取り、界面活性剤加PBS中での手もみ等により捕捉物を剥離させ、剥離物の全量を回収する。これを遠沈管に集め、1,050×gで10分間遠心する。上清を捨て、沈渣を丁寧にほぐした後、PBS約10mLを加えてよく攪拌し、再度1,050×gで10分間遠心して、上清を捨てる。
得られた沈渣が少なく顕微鏡観察に支障のない場合はそのまま4オーシスト等の検出に移る。沈渣量が多い場合は、必要に応じて3オーシスト等の分離・精製を行った後、4オーシスト等の検出に移る。
備考 超音波処理を行う場合、処理しすぎるとオーシスト等が破壊されることがある。また、超音波処理の過程でエアロゾルが飛散する可能性があるので、注意して操作する。
2．6 カートリッジフィルター法
本法は、孔径1μm程度以下のフィルターを可搬型ハウジングに高密度に収納したカートリッジフィルターを用いる方法である。吸引ろ過又は加圧ろ過のいずれの方法にも使用できる。濁質の少ない水では多量の試料水が濃縮できるほか、濁質の多い試料水の濃縮にも適用可能と考えられるが、現在入手可能なフィルターでは良好な回収率が得られるかどうか確認されていない。したがって、本法の採用に当たっては、予めフィルターからの剥離・回収条件を十分検討し、適正な操作条件を設定する必要がある。
カートリッジフィルター法の基本操作及び留意事項は次の通りである。
カートリッジフィルターに対応した所定の方法で試料水をろ過した後、ハウジング内に誘出液を入れ、振とう等によって濃縮物をフィルターから剥離した後、その全量を回収する。必要に応じてこの操作を繰り返し、回収液の全量を1,050×gで10分間遠心する。上清を捨て、沈渣を丁寧にほぐした後、PBSを加えてよく攪拌する。これを再び1,050×gで10分間遠心して、上清を捨てる。
得られた沈渣の量が少なく顕微鏡観察に支障がない場合はそのまま4オーシスト等の検出に移る。沈渣が多い場合は3オーシスト等の分離・精製を行った後、4オーシスト等の検出に移る。
2．7 遠心沈殿法
本法は、試料水中の懸濁粒子を遠心沈殿により濃縮する方法である。遠心沈殿法により懸濁物質を回収する場合、遠心荷重(g値)と遠心時間が重要であり、本法の採用に当たっては、オーシスト等添加系等での回収実験を行って適正な操作条件を設定する必要がある。また、遠心機を停止させる際にブレーキを使用すると遠沈管内に渦流が発生して沈渣が再浮上し、回収率に影響することがあるので、遠心沈殿機はブレーキ機能を解除して自然停止できるものを使用する。
遠心沈殿法の基本操作及び留意事項は次の通りである。
遠心機の使用方法に合わせて、オーシスト等の沈殿が保証される条件で遠心する。上清を捨て、沈渣をすべて遠沈管に集め、十分分散したのち、PBSを加えて再度よく攪拌する。これを1,050×gで10分間遠心し、上清を捨てる。
得られた沈渣の量が少なく顕微鏡観察に支障がない場合はそのまま4オーシスト等の検出に移る。沈渣が多い場合は3オーシスト等の分離・精製を行った後、4オーシスト等の検出に移る。
3 オーシスト等の分離・精製
懸濁粒子の捕捉・濃縮によって得られた濃縮物中に多量の夾雑物が含まれていて、そのままでは顕微鏡観察によるオーシスト等の確認が困難な場合に、オーシスト等を選択的に分離して精製する方法である。密度勾配遠沈法(浮遊法)と免疫磁性体粒子法(免疫磁気ビーズ法)の二通りの方法がある。
3．1 密度勾配遠沈法(浮遊法)
本法は、濃縮物を比重1.10～1.20の高比重液の上に載せて遠心し、オーシスト等を高比重液層の界面部分に集めて選択的に分離・精製する方法である。濃縮物中の比重の大きい粒子は沈渣として排除され、オーシスト等は水層と高比重層の界面部分に集まるので、その界面部分(絮状沈殿層：フラッフ)又は沈渣以外の全液層を回収することによってオーシスト等を選択的に分離濃縮することができる。しかし、生物性懸濁粒子など、高比重液層よりも比重が小さい粒子はオーシスト等との分離ができず、それらを多く含む試料では必ずしも十分な分離・精製ができない。
1) 試薬
(1) 精製水：2．1 1)(1)に同じ。
(2) 10倍濃度PBS(pH7.4)：2．1 1)(2)に同じ。
(3) PBS(pH7.4)：2．1 1)(3)に同じ。
(4) 高比重液：次の(a)、(b)のいずれかを用いる。用時に室温に戻し、液体比重計により比重を確認する。
i) ショ糖液(比重1.20)：精製水650mLにサッカロース(C12H22O11FW：342)500gを攪拌しながら徐々に加えて溶解する。
ii) コロイドPVP処理シリカ―ショ糖混合液(比重1.10)：精製水45mLにコロイドPVP処理シリカ(Percoll又はそれと同等のもの)45mL及び2.5Mショ糖液10mL(8.55gのショ糖を精製水に溶解して全量を10mLとする)を加えて混合する。
2) 器具及び器材
(1) 遠心沈殿機：2．1 2)(9)に同じ。
(2) パスツールピペット
(3) 遠沈管：2．1 2)(8)の容量15mLで、目盛り付きのもの。
(4) 液体比重計
3) 操作
2 懸濁粒子の捕捉・濃縮で得られた沈渣を丁寧にほぐした後、PBS約3mL注1)を加えてよく攪拌する注2)。攪拌後、直ちに試験管立てに入れてパスツールピペットにより高比重液約2mLを遠沈管底部にゆっくり注入して2重層とする注3)。重層界面が乱れないように注意して遠心沈殿機に入れ、1,050×gで10分間遠心する注4)。パスツールピペットを用いて、まずフラッフを回収し、新たな15mL遠沈管(回収用遠沈管)に移す。次いで、PBS層の全量、高比重液層上層部1／4～1／2程度を回収し、先の回収液に加える(1回目の回収)。
遠沈管に残った沈渣を再び丁寧にほぐした後、遠沈管残液の約4倍量のPBSを加えてよく攪拌し、高比重液約2mLを遠沈管底部にゆっくり注入して2重層とする。これを1,050×gで10分間遠心した後、1回目の回収と同様に、フラッフ、PBS層、高比重層上層部を回収して、1回目の回収液に加える(2回目の回収)。
この回収液の全量を染色用試料とし、4オーシスト等の検出に移る。
注1) 沈渣量が多い場合は加えるPBSを適宜増量する。沈渣量が0.5mLを超える場合は、遠沈管1本当たりの沈渣量が0.5mL以下になるように数本に分割して行う。
注2) 超音波処理により沈渣中の粒子塊を破砕・分散させると回収率が改善されることがある。その際、超音波処理によるオーシスト等の破壊がないように十分注意する。
注3) 攪拌後直ちに高比重液を注入する。直ちに注入できなかった場合は、必ず再度攪拌してから高比重液を加える。高比重液を加える際に、ゴム球等を用いて強制的に注入すると2層界面が乱れやすいので、ピペット先端を遠沈管最下端に付けた後、ピペットエンド(吸い口部分)をわずかに解放してゆっくり自然落下させて注入するとよい。また、パスツールピペットを抜き取る際に、ピペット先端で遠沈管内壁をなぞるようにしてゆっくり引き上げると境界面を乱さない。
注4) 遠心後、遠沈管内に上からPBS層、フラッフ、高比重液層が形成され、最下部に沈渣が集積している。このフラッフにオーシスト等が選択的に濃縮される。なお、場合によって500×g、10分程度の遠心処理でオーシスト等の回収率が向上したとの報告もある。
3．2 免疫磁性体粒子法(免疫磁気ビーズ法)
本法は、表面にクリプトスポリジウム等に対する特異抗体を吸着させた磁性体粒子と濃縮試料中のオーシスト等を選択的に結合させ、その後に磁石を用いて磁性体粒子に結合したオーシスト等を回収するものである。この方法を用いることで、オーシスト等を高度に選択的に回収することができる。しかし、オーシスト等と免疫磁性体粒子の結合力が比較的弱いため、個々の操作に細心の注意が求められる。また、共存する懸濁粒子の量や性状によっては回収率が低下することがあるので、本法の採用に当たっては、予め密度勾配遠沈法との比較評価や添加系での回収率の確認等を行い、試料水の水質に応じた適正な操作条件を構築する必要がある。
免疫磁性体粒子法の基本操作及び留意事項は次の通りである。
2 懸濁粒子の捕捉・濃縮で得られた沈渣に所定の緩衝液を加え、十分攪拌して分散注1)させた後、免疫磁性体粒子を所定量加える。これを混和して免疫磁性体粒子とオーシスト等を結合させたのち、磁石により免疫磁性体粒子―オーシスト等の結合物を回収する。次いで、回収物に所定の解離液を加えて結合を解き、磁石で磁性体粒子のみを容器壁面等に固定してから液層を回収する。この回収液を精製濃縮液とし、4オーシスト等の検出に移る。
なお、本法は操作の方法や条件が必ずしも確立されていないので、当面、本法を採用する場合は以下の点に十分留意する必要がある。
(1) 操作法等については試薬キットの用法や使用上の注意に従う。
(2) 懸濁粒子が多い試料ではオーシスト等の回収率が低下する傾向が認められるので、濃縮物と免疫磁性体粒子との適正な混合比を検討しておく必要がある。
(3) 濃縮物と免疫磁性体粒子を混合する場合、オーシスト等と免疫磁性体粒子を効率的に接触・反応させるための工夫が必要である。特に、試料水中の懸濁物質の捕捉・濃縮過程で形成された濃縮物の塊を十分にほぐして、オーシスト等が良好な分散状態にあるようにしなければならない注1)。また、免疫磁性体粒子と懸濁物質とを均一に混和させるように注意する必要がある。
(4) 免疫磁性体粒子とオーシスト等の結合力は比較的弱いので、反応後は強い振とうや衝撃を避ける。
(5) 免疫磁性体粒子とオーシスト等の反応時間は室温で30分間ないし1時間が一般的だが、低温下で一晩の反応でも良好な結果が得られる。あるいは、試薬キットに特別な指示があれば、その指示に従う。
(6) 遺伝子検出法用の試料を調製する場合は、遺伝子増幅反応への阻害物質の混入を極力防ぐため、夾雑物が完全に除去されるまで免疫磁性体粒子―オーシスト等の結合物を繰り返し洗浄する。
(7) その他、微量の試料を散逸させないよう、丁寧に取り扱う必要がある。
注1) 超音波処理が効果的であるとの報告がある。
4 オーシスト等の検出
4．1 蛍光抗体染色―顕微鏡検査法
水試料の濃縮物中にはオーシスト等以外の粒子が多数混在しているのが一般的であり、そのままでは夾雑物の妨害により顕微鏡観察が不可能であることから、免疫反応を利用してオーシスト等を特異的に染色し、顕微鏡観察を容易にする方法である。蛍光抗体染色法には蛍光標識した一次抗体のみで行う直接蛍光抗体染色法と、一次抗体と蛍光標識した二次抗体の2種類の抗体を使用する間接蛍光抗体染色法の二通りの方法がある。
4．1．1 直接蛍光抗体染色法
本法は、染色用試料をろ過して懸濁粒子をメンブレンフィルター上に捕捉し、メンブレンフィルター上のオーシスト等をFITC標識単クローン抗体を用いて特異的に染色する方法である。
1) 試薬
(1) 精製水：2．1 1)(1)に同じ。
(2) メタノール：試薬特級
(3) 抗体試薬：FITC標識抗―クリプトスポリジウムオーシスト単クローン抗体、FITC標識抗―ジアルジアシスト単クローン抗体。単体の抗体試薬又は試薬キットとして市販されている。
(4) ブロッキング試薬：10％ウシ血清アルブミン加PBS、10％カゼイン加PBS、10％ヤギ血清加PBSなど。自家調製する場合はメンブレンフィルター(孔径2μm以下)でろ過して冷蔵保存する。
(5) 10倍濃度PBS(pH7.4)：2．1 1)(2)に同じ。
(6) PBS(pH7.4)：2．1 1)(3)に同じ。
(7) 封入剤：以下の封入剤のいずれかを用いる。
i) DABCO―グリセリン(セルロースアセテートメンブレンフィルター用)：グリセリン(比重1.26)12.6gを60～70℃に加温し、これにDABCO(1，4―Diazabicyclo［2，2，2］octane又はこれと同等のもの)0.2gを加えて撹拌・溶解する。使用時に調製するのがよい。
ii) 水性封入剤(PTFEメンブレンフィルター用)：DABCO―PBS(PBS、pH7.4、にDABCO0.2gを加えて攪拌・溶解したもので、使用時に調製する)又は市販の蛍光試料用水性封入剤(Fluoprepまたはそれと同等のもの)。
(8) エタノール段階希釈液(脱水用グリセリン加エタノール段階希釈液)：グリセリン、エタノール及び精製水を下記の比率で混合する。