これにアセトン100mlを加え，3分間細砕した後，ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り，アセトン50mlを加え，3分間細砕した後，上記と同様に操作して，ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ，40°以下で約30mlに濃縮する。

これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液100mlを入れた300mlの分液漏斗に移す。n―ヘキサン100mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い，洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，n―ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にn―ヘキサン50mlを加え，上記と同様に操作して，n―ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn―ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ，40°以下でn―ヘキサンを除去する。

この残留物にn―ヘキサン30mlを加え，100mlの分液漏斗に移す。これにn―ヘキサン飽和アセトニトリル30mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，アセトニトリル層をすり合わせ減圧濃縮器中に移す。n―ヘキサン層にn―ヘキサン飽和アセトニトリル30mlを加え，上記と同様の操作を2回繰り返し，アセトニトリル層をその減圧濃縮器中に合わせ，40°以下でアセトニトリルを除去する。この残留物にエーテル及びn―ヘキサンの混液(5：95)5mlを加えて溶かす。

b　精製法

内径15mm，長さ300mmのクロマトグラフ管に，カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム5gをエーテル及びn―ヘキサンの混液(5：95)に懸濁したもの，次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ，カラムの上端に少量のエーテル及びn―ヘキサンの混液(5：95)が残る程度までエーテル及びn―ヘキサンの混液(5：95)を流出させる。このカラムにa　抽出法で得られた溶液を注入した後，エーテル及びn―ヘキサンの混液(5：95)70mlを注入し，流出液は捨てる。次いでアセトン及びn―ヘキサンの混液(5：95)80mlを注入し，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40°以下でアセトン及びn―ヘキサンを除去する。この残留物にアセトンを加えて溶かし，正確に1mlとして，これを試験溶液とする。

6．操作法

a　定性試験

次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。

操作条件

カラム　内径0.25mm，長さ30mのケイ酸ガラス製の細管に，ガスクロマトグラフィー用メチルシリコンを0.25μmの厚さでコーティングしたもの。

カラム温度　60°で3分間保持し，その後毎分20°で昇温し，260°に到達後10分間保持する。

試験溶液注入口温度　260°

注入方式　スプリットレス

検出器　280°で操作する。

ガス流量　キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。ベンフレセートが約14分で流出する流速に調整する。空気及び水素の流量を至適条件に調整する。

b　定量試験

a　定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

c　確認試験

a　定性試験と同様の操作条件でガスクロマトグラフィー・質量分析を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。また，必要に応じ，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

7．定量限界

0.02mg／kg

8．留意事項

なし

9．参考文献

なし

10．類型

A

ボスカリド試験法(農産物)

1．分析対象化合物

ボスカリド

2．装置

アルカリ熱イオン化検出器付きガスクロマトグラフ(GC(FTD))又は高感度窒素・リン検出器付きガスクロマトグラフ(GC(NPD))

ガスクロマトグラフ・質量分析計(GC／MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

ボスカリド標準品　本品はボスカリド98％以上を含み、融点は143～150℃である。

4．試験溶液の調製

1)　抽出

(1)　穀類、豆類及び種実類の場合

試料10.0gを量り採り、水20mLを加え、2時間放置する。これにアセトン100mLを加え、3分間ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトン50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、40℃以下で約30mLに濃縮する。これに10％塩化ナトリウム溶液100mLを加え、n―ヘキサン100mL及び50mLで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。

この残留物にn―ヘキサン30mLを加え、n―ヘキサン飽和アセトニトリル30mLで3回振とう抽出する。抽出液を合わせて、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にn―ヘキサン5mLを加えて溶かす。

(2)　果実及び野菜の場合

試料20.0gを量り採り、アセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトン50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、40℃以下で約30mLに濃縮する。これに10％塩化ナトリウム溶液100mLを加え、n―ヘキサン100mL及び50mLで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にn―ヘキサン5mLを加えて溶かす。

(3)　植物油(精製)の場合

試料2.5gを量り採り、n―ヘキサン30mLを加え、n―ヘキサン飽和アセトニトリル30mLで3回振とう抽出する。抽出液を合わせて、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にn―ヘキサン5mLを加えて溶かす。

(4)　干しぶどうの場合

試料に等量の水を加えて磨砕し、試料10.0g相当を量り採る。これにアセトン100mLを加え、3分間ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、水10mL及びアセトン50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、40℃以下で約30mLに濃縮する。これに10％塩化ナトリウム溶液100mLを加え、n―ヘキサン100mL及び50mLで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にn―ヘキサン5mLを加えて溶かす。

2)　精製

クロマトグラフ管(内径15mm)に、カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム10gをn―ヘキサンに懸濁させて充てんし、上に無水硫酸ナトリウム5gを積層する。このカラムに、1)で得られた溶液を注入した後、アセトン・n―ヘキサン混液(1：19)100mLを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトン・n―ヘキサン混液(3：7)100mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をアセトンに溶解し、穀類、豆類及び種実類の場合は正確に2mL、果実及び野菜の場合は正確に4mL、植物油(精製)の場合は正確に0.5mL、干しぶどうの場合は正確に2mLとしたものを試験溶液とする。

5．検量線の作成

ボスカリド標準品の0.05～1mg／Lアセトン溶液を数点調製し、それぞれ2μLをGCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

6．定量

試験溶液2μLをGCに注入し、5の検量線でボスカリドの含量を求める。

7．測定条件

1)　GC

検出器：FTD又はNPD

カラム：メチルシリコン、内径0.25mm、長さ30m、膜厚0.25μm

カラム温度：100℃(1分)―30℃／分―250℃(0分)―6℃／分―300℃(2分)

注入口温度：250℃、検出器温度：280℃

キャリヤーガス：ヘリウム

保持時間：約12.2分

2)　GC／MS

カラム：5％フェニル―メチルシリコン、内径0.25mm、長さ30m、膜厚0.25μm

カラム温度：100℃(1分)―30℃／分―280℃(5分)

注入口温度：250℃

キャリヤーガス：ヘリウム

イオン化モード(電圧)：EI(70eV)

主なイオン(m／z)：342、140

注入量：1μL

保持時間：約10.4分

8．定量限界

0.01mg／kg

9．留意事項

1)　試験法の概要

ボスカリドを試料からアセトンで抽出し、n―ヘキサンに転溶する。合成ケイ酸マグネシウムカラムクロマトグラフィーで精製した後、GC(FTD)又はGC(NPD)で測定し、GC／MSで確認する方法である。

穀類、豆類、種実類、果実、野菜については、平成13年厚生労働省告示第56号「カフェンストロール、ジフェノコナゾール、シプロコナゾール、シメトリン、チフルザミド、テトラコナゾール、テブコナゾール、トリアジメノール、フルジオキソニル、プロピコナゾール、ヘキサコナゾール及びペンコナゾール試験法」に同じである。

2)　注意点

(1)　アセトニトリル／n―ヘキサン分配では、ダイズでエマルジョンを形成した。綿栓ろ過や、液量を各50mLに増量することでエマルジョンの低減が可能である。

(2)　精製が不十分な場合は以下の精製を追加することができる。

a)　オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(360mg)

メタノール及び水各10mLで予備洗浄を行う。試料液をメタノール・水混液(3：7)10mLで負荷、同混液10mLで洗浄し、流出液を捨てた後、メタノール・水混液(1：1)20mLで溶出させる。

b)　活性炭ミニカラム(500mg)

アセトニトリル・トルエン混液(3：1)5mLで予備洗浄を行う。試料液をアセトニトリル・トルエン混液(3：1)5mLで負荷、同混液10mLで溶出させる。全量を採取する。

c)　アミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(360mg)

n―ヘキサン5mLで予備洗浄を行う。試料液をエーテル・n―ヘキサン混液(3：17)5mLで負荷、同混液5mLで洗浄し、流出液を捨てた後、エーテル・n―ヘキサン混液(1：1)25mLで溶出させる。

(3)　合成ケイ酸マグネシウムカラムクロマトグラフィーでは、カフェンストロール等12農薬分析法に対応できるように、溶出溶媒としてアセトン・n―ヘキサン混液(3：7)を採用しているが、ボスカリドのみを対象とする場合は、アセトン・n―ヘキサン混液(3：17)でも溶出可能である。

(4)　ボスカリドの感度が試験溶液の注入の前後で大幅に変動する場合がある。試験溶液を数回注入し、感度を十分に安定させてから標準溶液を注入する等の措置が必要である。

11　参考文献

平成13年厚生労働省告示第56号「カフェンストロール、ジフェノコナゾール、シプロコナゾール、シメトリン、チフルザミド、テトラコナゾール、テブコナゾール、トリアジメノール、フルジオキソニル、プロピコナゾール、ヘキサコナゾール及びペンコナゾール試験法」

12　類型

C

ボスカリド試験法(畜産物)

1．分析対象化合物

ボスカリド

2．装置

ガスクロマトグラフ・質量分析計(GC／MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

ボスカリド標準品　本品はボスカリド98％以上を含み、融点は143～150℃である。

4．試験溶液の調製

1)　抽出

(1)　筋肉、脂肪、肝臓、腎臓及びその他の食用部分の場合

筋肉、肝臓、腎臓及びその他の食用部分の場合は、細切均一化した後、その20.0gを量り採る。

脂肪の場合は、細切均一化した後、その5.0gを量り採る。

これに水20mLを加え、ホモジナイズしたのち、アセトン・n―ヘキサン混液(1：2)100mLを加え、さらにホモジナイズし、2,500回転／分で5分間遠心分離する。上澄液を200mLの三角フラスコに分取する。遠心管内の残留物にn―ヘキサン50mLを加えホモジナイズしたのち、2,500回転／分で5分間遠心分離し、上澄液を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置したのち、あらかじめ重量を測定したすり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いで、アセトン・n―ヘキサン混液(1：2)20mLを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40℃以下で溶媒を除去したのち、残留物の重量を測定し、これを脂肪重量とする。この残留物の全量または一定量を採り、アセトン・シクロヘキサン混液(1：4)で、抽出脂肪0.50g／5mLまたは試料5.0g／5mLになるように溶解し、これを抽出溶液とする。

(2)　乳、卵の場合

試料20.0gを量り採り、アセトニトリル100mLを加えてホモジナイズしたのち、2,500回転／分で5分間遠心分離する。上澄液を300mLの分液漏斗に分取する。遠心管内の残留物にアセトニトリル50mLを加えホモジナイズしたのち、2,500回転／分で5分間遠心分離し、上澄液を上記の分液漏斗に合わせる。これに塩化ナトリウム10gを加え、振とう機を用いて3分間激しく振り混ぜたのち、静置し、分離した水層を除く。アセトニトリル層をすり合わせ減圧濃縮器に移し、40℃以下で溶媒を除去する。この時水が残らなかった場合には、残留物に少量のアセトン・シクロヘキサン混液(1：4)を加えて超音波抽出する操作を3回繰り返し、抽出液を合わせて試料5g／5mLになるようにしてこれを抽出溶液とする。また、水が残った場合には、酢酸エチル20mLを加えて残留物を溶解したのち、無水硫酸ナトリウムを加えて超音波抽出する。抽出液をすり合わせ減圧濃縮器中にろ過し、酢酸エチル10mLを用いて先の減圧濃縮器を洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40℃以下で溶媒を除去する。この残留物をアセトン・シクロヘキサン混液(1：4)で試料5g／5mLになるように溶解し、これを抽出溶液とする。

2)　精製

(1)　筋肉、脂肪、乳及び卵の場合

1)抽出で得られた抽出溶液を3,000回転／分で5分間遠心分離し、その上澄液5mLをゲル浸透クロマトグラフィー用カラム(ポリスチレンジビニルベンゼン共重合体カラム)に注入し、アセトン・シクロヘキサン混液(1：4)で溶出する。58～165mLに溶出する画分をすり合わせ減圧濃縮器中に採り、40℃以下で溶媒を除去する。この残留物にアセトン・n―ヘキサン混液(1：1)2mLを加えて溶かす。この溶液をあらかじめアセトン・n―ヘキサン混液(1：1)10mLで洗浄したエチレンジアミン―N―プロピルシリル化シリカゲルミニカラム(500mg)に注入したのち、減圧濃縮器をアセトン・n―ヘキサン混液(1：1)1mLで洗い、洗液を先のカラムに注入する操作を3回繰り返す。カラムにアセトン・n―ヘキサン混液(1：1)15mLを注入し、全溶出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り、40℃以下で溶媒を除去する。この残留物をアセトン・n―ヘキサン混液(1：1)1mL［脂肪の場合は0.5mL］に溶解し、これを試験溶液とする。

(2)　肝臓、腎臓及びその他の食用部分の場合

1)抽出で得られた抽出溶液を3,000回転／分で5分間遠心分離し、その上澄液5mLをゲル浸透クロマトグラフィー用カラム(ポリスチレンジビニルベンゼン共重合体カラム)に注入し、アセトン・シクロヘキサン混液(1：4)で溶出する。58～65mLに溶出する画分(画分Ⅰ)を採り、この溶液をあらかじめアセトン・シクロヘキサン混液(1：4)10mLで洗浄したエチレンジアミン―N―プロピルシリル化シリカゲルミニカラム(500mg)に注入したのち、容器をアセトン・シクロヘキサン混液(1：4)1mLで洗い、洗液を先のカラムに注入する操作を3回繰り返す。カラムにアセトン・シクロヘキサン混液(1：4)2mLを注入し、全溶出液を合わせてすり合わせ減圧濃縮器中に採り、40℃以下で溶媒を除去する。この残留物をn―ヘキサン1mLで溶解し、この溶液をあらかじめn―ヘキサン10mLで洗浄したシリカゲルミニカラムに注入したのち、減圧濃縮器をn―ヘキサン1mLで洗い、洗液を先のカラムに注入する操作を3回繰り返す。カラムにn―ヘキサン7mLを注入し、この溶出液は捨てる。次いで、カラムにエーテル・n―ヘキサン混液(1：19)15mLを注入し、溶出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採る。また、別に65～165mLに溶出する画分(画分Ⅱ)をその減圧濃縮器中に合わせ、40℃以下で溶媒を除去する。この残留物をアセトン・n―ヘキサン混液(1：1)1mLに溶解し、これを試験溶液とする。

5．検量線の作成

ボスカリド標準品の0.05～1mg／L(脂肪の場合は0.01～0.2mg／L)アセトン・n―ヘキサン(1：1)溶液を数点調製し、それぞれ1μLをGC／MSに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

6．定量

試験溶液1μLをGC／MSに注入し、5の検量線でボスカリドの含量を求める。

7．測定条件

GC／MS

カラム：5％フェニル―メチルシリコン、内径0.25mm、長さ30m、膜厚0.25μm

カラム温度：100℃(1分)―30℃／分―280℃(5分)

注入口温度：250℃

キャリヤーガス：ヘリウム

イオン化モード(電圧)：EI(70eV)

主なイオン(m／z)：342、140

注入量：1μL

保持時間：約10.4分

8．定量限界

0.01mg／kg

9．留意事項

1)　試験法の概要

ボスカリドを試料からアセトン・n―ヘキサン混液(1：2)で抽出(乳、卵の場合はアセトニトリルで抽出)し、ゲル浸透クロマトグラフィーおよびエチレンジアミン―N―プロピルシリル化シリカゲルミニカラムクロマトグラフィーで精製した後、GC／MSで測定、確認する方法である。

2)　注意点

(1)　抽出時に上澄液を分取する操作で水を除かない場合は、大量の無水硫酸ナトリウムが必要である。分液漏斗を用いて水層を除去した後に無水硫酸ナトリウムによる脱水を行うとよい。

(2)　ゲル浸透クロマトグラフ条件の例

カラム：ポリスチレンジビニルベンゼン共重合体(内径20mm、長さ300mm)にガードカラムポリスチレンジビニルベンゼン共重合体(内径20mm、長さ100mm)を接続したもの、または同等品

移動相：アセトン・シクロヘキサン混液(1：4)

流速：5mL／min

カラム温度：40℃

注入量：5mL

モニター波長：254nm

分取範囲：

筋肉、脂肪、乳及び卵の場合：58～165mL(合計107mL)

肝臓、腎臓及びその他の食用部分の場合

画分Ⅰ：58～65mL(合計7mL)、画分Ⅱ：65～165mL(合計100mL)

ゲル浸透クロマトグラフィーは、あらかじめ使用する条件で、指標物質であるアクリナトリンおよびトリシクラゾール、ならびに対象物質ボスカリドの溶出位置を確認し、分取範囲を決定しておく。

分取範囲の確認：アクリナトリン及びトリシクラゾールの5mg／L混合溶液を移動相で調製し、その5mLをゲル浸透クロマトグラフに注入して254nmでモニターし、あらかじめ分取範囲を確認する。溶出液を適当な間隔で分取してGC／MSで測定するなど他の適切な方法を用いてもよい。

a)　筋肉、脂肪、乳及び卵の場合(図1参照)

アクリナトリンの保持時間からトリシクラゾールの溶出が終了するまで。

(例)58～165mL(合計107mL)

図1　筋肉、脂肪、乳及び卵の場合の分取範囲

b)　肝臓、腎臓及びその他の食用部分の場合(図2参照)

画分Ⅰ：アクリナトリンの保持時間からアクリナトリンの溶出が終了するまで。

画分Ⅱ：画分Ⅰの分取終了からトリシクラゾールの溶出が終了するまで。

(例)画分Ⅰ：58～65mL(合計7mL)．画分Ⅱ：65～165mL(合計100mL)

図2　肝臓、腎臓及びその他の食用部分の場合の分取範囲

(3)　ミニカラムは使用条件で検討対象農薬の溶出調査を事前に行い、溶出位置を確認してから使用する。なお、エチレンジアミン―N―プロピルシリル化シリカゲルミニカラムでは、ボスカリドを保持しないため、注入液から全ての溶出液を捕集する必要がある。

(4)　GC／MS測定において妨害が見られた場合には、シリカゲルミニカラム(690mg)による追加精製を行う。［エーテル・n―ヘキサン混液(1：49)10mLで予備洗浄。試料液をエーテル・n―ヘキサン混液(1：49)3mLで負荷、同混液10mLで洗浄し、次いで、アセトン・n―ヘキサン混液(1：1)20mLで溶出する。］

(5)　GC／MS測定では、ボスカリドの感度が試料の注入の前後で大幅に変動する場合がある。試料を数本注入し、感度を十分に安定させてから標準溶液を注入する等の措置が必要である。

(6)　脂肪含有量が高い試料では、試験溶液の濃縮倍率が低くなる。その際、目標の測定感度が得られない場合には、抽出脂肪を用いてゲル浸透クロマトグラフィー以降の操作を行い、複数の検液を合わせて試験溶液とする。

11　参考文献

なし

12　類型

C

ホセチル試験法(農産物)

1．分析対象化合物

ホセチル、亜リン酸

2．装置

アルカリ熱イオン化検出器，炎光光度型検出器(リン用干渉フィルター，波長526nm)又は高感度窒素・リン検出器付きガスクロマトグラフ，ガスクロマトグラフ・質量分析計及びメチル化装置を用いる。

メチル化装置の概略は，次の図による。

A：エーテル管

B：ジアゾメタン発生管

C：反応管

3．試薬、試液

次に示すもの以外は，総則の3に示すものを用いる。

強酸性陽イオン交換樹脂　カラムクロマトグラフィー用に製造した強酸性陽イオン交換樹脂(粒径75～150μm)をその樹脂の5倍の体積の1mol／l水酸化ナトリウム溶液を用いて2回洗い，次いで水を用いてpHが中性になるまで洗う。さらに，その樹脂の5倍の体積の3mol／l塩酸を用いて2回洗い，次いで水を用いてpHが中性になるまで洗つたものを水に懸濁して冷暗所に保管する。

ジアゾメタンエーテル溶液　メチル化装置のエーテル管にエーテル5mlを入れる。メチル化装置のジアゾメタン発生管にジエチレングリコールモノエチルエーテル4ml及び10mol／l水酸化カリウム溶液2mlを入れる。メチル化装置の反応管にエーテル50mlを入れる。メチル化装置のジアゾメタン発生管にN―メチル―N―ニトロソ―p―トルエンスルホンアミド2gをエーテル5mlに溶かしたものを加えた後，窒素を5分間緩やかに通じて反応させ，反応管の溶液を採る。用時調製する。

透析膜チューブ　内径27mm，壁の厚さ20.3μmの透析用セルロースチューブを25cmの長さに切断して水洗した後，一端を閉じ，冷暗所に保管する。

4．標準品

ホセチル　本品はホセチル97％以上を含む。

分解点　本品の分解点は200°である。

亜リン酸　本品は亜リン酸97％以上を含む。

融点　本品の融点は73°である。

5．試験溶液の調製

a　抽出法

果実及び野菜の場合は，検体約1kgを精密に量り，必要に応じ適量の水を量つて加え，細切均一化した後，検体10.0gに相当する量を量り採る。

種実類の場合は，粉砕した後，その10.0gを量り採る。

ホップの場合は，細切均一化した後，検体5.00gを量り採る。

これを透析膜チューブに入れ，0.1mol／lシュウ酸溶液20mlを加え，開口部を閉じる。この透析膜チューブをあらかじめ水200mlを入れた250mlのねじ口びんに入れ，振とう機を用いて軽く振り混ぜながら24時間放置する。透析膜チューブを除いた後，そのねじ口びん中の溶液100mlをすり合わせ減圧濃縮器中に移し，50°以下で約5mlに濃縮する。

b　精製法

内径15mm，長さ300mmのクロマトグラフ管に，強酸性陽イオン交換樹脂(粒径75～150μm)2mlを水に懸濁したものを入れ，カラムの上端に少量の水が残る程度まで水を流出させる。このカラムにa　抽出法で得られた溶液を注入し，流出液を20mlのメスフラスコに採る。次いで水を注入し，流出液を上記のメスフラスコに合わせ，20mlとする。

c　メチル化

b　精製法で得られた溶液1mlを100mlのナス型フラスコに移し，イソプロピルアルコール5mlを加える。次いでジアゾメタンエーテル溶液をジアジメタンの黄色が残るまで加え，密栓し，15分間放置した後，40°以下で約5mlに濃縮する。これにイソプロピルアルコールを加え，正確に10mlとして，これを試験溶液とする。

6．操作法

a　定性試験

次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品それぞれの0.05mol／lシュウ酸溶液について，5．試験溶液の調製のc　メチル化と同様に操作して得られたものと一致しなければならない。

操作条件

カラム　内径0.53mm，長さ30mのケイ酸ガラス製の細管に，ガスクロマトグラフィー用50％シアノプロピル―メチルシリコンを0.5μmの厚さでコーティングしたもの。

カラム温度　75°で7分間保持し，その後毎分15°で昇温し，200°に到達後4分間保持する。

試験溶液注入口温度　230°

注入方式　スプリットレス

検出器　230°で操作する。

ガス流量　キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。亜リン酸エチルメチルが約5分で流出する流速に調整する。空気及び水素の流量を至適条件に調整する。

b　定量試験

a　定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき，ホセチル及び亜リン酸のそれぞれについてピーク高法又はピーク面積法により定量を行い，ホセチル及び亜リン酸の含量を求め，次式により，亜リン酸を含むホセチルの含量を求める。

ホセチル(亜リン酸を含む。)の含量(ppm)＝A＋B×1.44

A：ホセチルの含量(ppm)

B：亜リン酸の含量(ppm)

c　確認試験

a　定性試験と同様の操作条件でガスクロマトグラフィー・質量分析を行う。試験結果は標準品について，5．試験溶液の調製のc　メチル化と同様に操作して得られたものと一致しなければならない。また，必要に応じ，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

7．定量限界

0.5mg／kg

8．留意事項

ホセチルは、ホセチル及びその代謝物である亜リン酸のそれぞれについて定量を行い、亜リン酸についてはその含量に係数を乗じてホセチルの含量に換算し、これらの和を分析値とすること。

9．参考文献

なし

10．類型

A

マレイン酸ヒドラジド試験法(農産物)

マレイン酸ヒドラジドの分析値には、試験法1^注1)ではマレイン酸ヒドラジド、マレイン酸ヒドラジドグリコシド及びヒドラジンが含まれ、試験法2^注2)ではマレイン酸ヒドラジド及びマレイン酸ヒドラジドグリコシドが含まれる。

また、試験法1については、平成16年9月1日以前に告示で規定していた方法であり、試験法2については、文献を参考とした方法である。

したがって、マレイン酸ヒドラジドの分析については、これまでの試験検査機関における試験実績を踏まえ、試験法1を優先して用いることとし、感度が得られない等、必要な場合に試験法2を用いること。

注1)　試験法1：平成4年厚生省告示第239号「マレイン酸ヒドラジド試験法」

注2)　試験法2：平成16年2月25日付け厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知「マレイン酸ヒドラジド試験法」

○試験法1

1．分析対象化合物

マレイン酸ヒドラジド、マレイン酸ヒドラジドグリコシド、ヒドラジン

2．装置

可視分光光度計及びヒドラジン蒸留装置を用いる。ヒドラジン蒸留装置はホウケイ酸ガラス製で，その概略は，次の図による。

A：水溜

B：窒素流入口

C：グラスウールテープ

D：温度計

E：温度測定管

F：蒸留フラスコ

G：冷却管

H：受器

I：ガラス製冷却浴

3．試薬、試液

次に示すもの以外は，総則の3に示すものを用いる。

発色試薬　p―ジメチルアミノベンズアルデヒド2gを1mol／l硫酸100mlに溶かす。

4．標準品

マレイン酸ヒドラジド　マレイン酸ヒドラジド(特級)を水で3回再結晶する。用時調製する。

分解点　本品の分解点は260°である。

5．試験溶液の調製

検体約1kgを精密に量り，必要に応じ適量の水を量つて加え，細切均一化した後，検体5.00gに相当する量を300mlの蒸留フラスコに量り採り，シリコーン油1ml，水酸化ナトリウム50g及び水40mlを加える。温度測定管に，大豆油又は沸点の高い油1mlを入れ，温度計を入れる。上記の蒸留フラスコを加熱し，20秒ごとに揺り動かしながら水酸化ナトリウムを溶かす。水酸化ナトリウムを加えてから温度が160°に達するまでの時間が11～15分となるように加熱を調整し，温度が160°に達した時点で加熱を中止し，放冷する。温度が140°になつた時点で上記の蒸留フラスコの接合部を乾いた布で拭き取り，乾燥させ，亜鉛5g及び塩化第一鉄0.5gを加え，直ちに接合部にグリースを薄く塗り，これをヒドラジン蒸留装置に取り付ける。50mlの受器に発色試薬4mlを入れ，冷却管の先端を受器の液中に浸し，受器を氷水で冷却する。窒素の流量を受器に毎秒3気泡が発生するように調整する。冷却管は氷水を流す。

上記の蒸留フラスコを加熱し，沸騰が始まり泡立つてきたら，泡が上記の蒸留フラスコの3分の2以上に沸き上がらないように加熱を調整する。

温度が173°に達した時点で，水をゆつくり滴下し，168°になつた時点で滴下を中止する。この操作を繰り返しながら蒸留を行い，留液35mlを採る。塩化第一鉄を加えてからこの操作を終了するまでの時間が15～20分となるように一連の操作及び加熱を調整する。留液に濁りが生ずる場合には硫酸を2滴加え，振り混ぜる。この留液に水を加え，正確に40mlとして，これを試験溶液とし，10分以内に6．定量試験により定量する。

6．定量試験

発色試薬4mlに水を加えて40mlとしたものを対照液として，試験溶液について波長430，460及び490nmにおける吸光度を測定し，次式により補正吸光度を求め，7．の検量線によつてマレイン酸ヒドラジドの含量を求める。

補正吸光度＝B－((A＋C)／2)

A：430nmにおける吸光度

B：460nmにおける吸光度

C：490nmにおける吸光度

7．検量線の作成

マレイン酸ヒドラジド100mgを1,000mlのメスフラスコに量り採り，0.1mol／l水酸化ナトリウム溶液を加えて1,000mlとする。

この液の0.2，0.4，0.6，0.8及び1.0mlを別々に量り採り，それぞれに0.1mol／l水酸化ナトリウム溶液を加えて1.0mlとする。これらを，5．試験溶液の調製及び6．定量試験と同様に操作して，検量線を作製する。

8．定量限界

0.2mg／kg

9．留意事項

なし

10．参考文献

なし

11．類型

A

○試験法2

1．分析対象化合物

マレイン酸ヒドラジド、マレイン酸ヒドラジドグリコシド(以下、配糖体という。)

2．装置

アルカリ熱イオン化検出器付きガスクロマトグラフ(GC(FTD))又は高感度窒素・リン検出器付きガスクロマトグラフ(GC(NPD))

ガスクロマトグラフ・質量分析計(GC／MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

5％含水合成ケイ酸マグネシウム　カラムクロマトグラフィー用に製造した合成ケイ酸マグネシウム(粒径150～250μm)を130℃で4時間加熱した後、デシケーター中で放冷する。これに5％含水となるように水を加えて、密栓し、混合して24時間以上放置したもの。

マレイン酸ヒドラジド標準品　本品はマレイン酸ヒドラジド99％以上を含む。

4．試験溶液調製法

1)　加水分解、メチル化

試料2.0gに2.4mol／L塩酸20mLを加え、冷却管を取り付け、沸騰水浴上で2時間加熱還流する。

放冷後、これに10mol／L水酸化ナトリウム溶液5mLと硫酸ジメチル1mLを加え、発生するガスを時々抜きながら、室温で30分間振とうする。反応液を酢酸エチル50mL及び30mLで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン・n―ヘキサン混液(1：4)1mLを加えて溶かす。

2)　精製

クロマトグラフ管(内径15mm)に5％含水合成ケイ酸マグネシウム10gをn―ヘキサンに懸濁させて充てんし、上に無水硫酸ナトリウム約5gを積層する。このカラムに、1)で得られた溶液を注入し、流出液は捨てる。さらに、アセトン・n―ヘキサン混液(1：4)50mLを注入し、流出液は捨てる。次いで、アセトン・n―ヘキサン混液(1：4)70mLを注入し、溶出液にキーパーとしてトルエン0.5mLを加え、40℃以下で濃縮し、残留物をアセトンに溶解し、正確に1mLとしたものを試験溶液とする。

5．検量線の作成

マレイン酸ヒドラジド標準品の1～20mg／L　0.1mol／L塩酸溶液を数点調製し、それぞれ1mLを採り、0.1mol／L水酸化ナトリウム溶液25mLと硫酸ジメチル1mLを加え、発生するガスを時々抜きながら、室温で30分間振とうする。反応液を酢酸エチル50mL及び30mLで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液にトルエン0.5mLを加え、40℃以下で濃縮し、残留物をアセトンに溶解し、正確に1mLとしたものを検量線用溶液とする。2μLをGCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

6．定量

試験溶液2μLをGCに注入し、5の検量線でマレイン酸ヒドラジドの含量を求める。

7．測定条件

GC

検出器：FTD又はNPD

カラム：50％フェニル―メチルシリコン　内径0.53mm、長さ10m、膜厚2.0μm

カラム温度：100℃―10℃／分―200℃

注入口温度：200℃

検出器温度：250℃

キャリヤーガス：ヘリウム

保持時間の目安：5分

8．定量限界

0.5mg／kg

9．留意事項

1)　試験法の概要

試料に塩酸を加えて加熱還流し、配糖体をマレイン酸ヒドラジドに加水分解する。マレイン酸ヒドラジドをアルカリ性下でメチル化した後、酢酸エチルで抽出する。5％含水合成ケイ酸マグネシウムカラムで精製し、GC(FTD)又はGC(NPD)で測定し、GC／MSで確認する方法である。

2)　注意点

(1)　マレイン酸ヒドラジドジメチルの酢酸エチルによる抽出率は約30％である。そこでマレイン酸ヒドラジド標準品を試料と同様に操作したものを検量線用溶液として用いる。

(2)　本法の定量限界は0.5mg／kgである。残留基準値がこれより低い作物においては、試料量を増やすことにより対応する。

10．参考文献

なし

11．類型

D(寺師朗子ら、食品衛生学雑誌、37、401―406(1996))

マンジプロパミド試験法(農産物)

1．分析対象化合物

マンジプロパミド

2．装置

液体クロマトグラフ・質量分析計(LC―MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

マンジプロパミド標準品　本品はマンジプロパミド98％以上を含む。

4．試験溶液の調製

1)　抽出

果実及び野菜の場合は試料20.0gを量り採る。穀類、豆類及び種実類の場合は試料10.0g、茶の場合は試料5.00gにそれぞれ水20mLを加え、30分間放置する。

これにアセトニトリル100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトニトリル50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせ、アセトニトリルを加えて正確に200mLとする。この2mL(茶の場合は4mL)を採り、これに水6mL(茶の場合は12mL)を加える。

2)　精製

①　オクタデシルシリル化シリカゲルカラムクロマトグラフィー及びグラファイトカーボンカラムクロマトグラフィー

オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(1,000mg)にアセトニトリル及び水各5mLを順次注入し、流出液は捨てる。グラファイトカーボンミニカラム(500mg)にアセトニトリル及び水各5mLを順次注入し、流出液は捨てる。オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムに、1)で得られた溶液を注入した後、さらにアセトニトリル及び水(1：1)混液5mLを注入し、流出液は捨てる。次いでこのカラムの下部にグラファイトカーボンミニカラムを接続し、アセトニトリル及び水(7：3)混液10mLを注入し、流出液は捨てる。オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムを除去した後、グラファイトカーボンミニカラムにアセトニトリル及び水(9：1)混液10mLを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトン20mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物に酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：4)混液5mLを加えて溶かす。

②　シリカゲルカラムクロマトグラフィー

シリカゲルミニカラム(690mg)に酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：4)混液5mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに①で得られた溶液を注入した後、さらに酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：4)混液5mLを注入し、流出液は捨てる。次いで酢酸エチル及びn―ヘキサン(2：3)混液10mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をアセトニトリル、ギ酸及び水(500：1：500)混液に溶解し、果実及び野菜の場合は正確に4mL、穀類、豆類、種実類及び茶の場合は正確に2mLとしたものを試験溶液とする。

5．検量線の作成

マンジプロパミド標準品の0.0005～0.01mg／L溶液(アセトニトリル、ギ酸及び水(500：1：500)混液)を数点調製し、それぞれ10μLをLC―MSに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

6．定量

試験溶液10μLをLC―MSに注入し、5の検量線でマンジプロパミドの含量を求める。

7．確認試験

LC―MSにより確認する。

8．測定条件

(例)

カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル内径2.1mm、長さ150mm、粒子径5μm

カラム温度：40℃

移動相：アセトニトリル、ギ酸及び水(500：1：500)混液

イオン化モード：ESI(＋)

主なイオン(m／z)：414,412

保持時間の目安：8分

9．定量限界

0.01mg／kg

10．留意事項

1)　試験法の概要

マンジプロパミドを試料からアセトニトリルで抽出し、オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム、グラファイトカーボンミニカラム及びシリカゲルミニカラムで精製した後、LC―MSで定量及び確認する方法である。

2)　注意点

①　マンジプロパミドのLC―MS測定で、試験法開発時に使用したイオンを以下に示す。

定量イオン(m／z)：412

定性イオン(m／z)：414

②　夾雑成分の少ない農産物では、グラファイトカーボンミニカラムによる精製を省略することが可能である。

③　一部の農産物(大豆、キャベツ及びぶどう)については、「LC―MSによる農薬等の一斉試験法Ⅰ(農産物)」が適用可能であることが報告されている。

11．参考文献

なし

12．類型

C

ミクロブタニル試験法(農産物)

1．分析対象化合物

ミクロブタニル

2．装置

アルカリ熱イオン化検出器又は高感度窒素・リン検出器付きガスクロマトグラフ及びガスクロマトグラフ・質量分析計を用いる。

3．試薬、試液

次に示すもの以外は，総則の3に示すものを用いる。

凝固液　塩化アンモニウム2g及びリン酸4mlに水を加えて400mlとする。

4．標準品

ミクロブタニル　本品はミクロブタニル99％以上を含む。

融点　本品の融点は68～69°である。

5．試験溶液の調製

a　抽出法

(1)　穀類，果実，野菜及び抹茶の場合

穀類の場合は，検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後，その20.0gを量り採り，水40mlを加え，2時間放置する。

果実及び野菜の場合は，検体約1kgを精密に量り，必要に応じ適量の水を量つて加え，細切均一化した後，検体20.0gに相当する量を量り採る。

抹茶の場合は，検体5.00gを量り採り，水20mlを加え，2時間放置する。

これにアセトン100mlを加え，3分間細砕した後，ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り，アセトン50mlを加え，3分間細砕した後，上記と同様に操作して，ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ，40°以下で約50mlに濃縮する。

これをあらかじめ5％塩化ナトリウム溶液200ml及びn―ヘキサン100mlを入れた500mlの分液漏斗に移す。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，n―ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にn―ヘキサン50mlを加え，上記と同様に操作して，n―ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn―ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ，40°以下でn―ヘキサンを除去する。

この残留物にアセトン20mlを加えて溶かし，凝固液50ml及びケイソウ土2gを加え，時々振り混ぜながら5分間放置し，ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いて吸引ろ過し，ろ液を200mlの分液漏斗に移す。アセトン及び凝固液の混液(2：5)50mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う。洗液を上記の分液漏斗に合わせる。これにn―ヘキサン50mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，n―ヘキサン層を200mlの三角フラスコに移す。水層にn―ヘキサン50mlを加え，上記と同様に操作して，n―ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn―ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ，40°以下で約1mlに濃縮し，更に室温で窒素を通じて乾固する。この残留物にアセトン及びn―ヘキサンの混液(3：17)10mlを加えて溶かす。

(2)　抹茶以外の茶の場合

検体6.00gを100°の水360mlに浸し，室温で5分間放置した後，ろ過し，冷後ろ液300mlを500mlの分液漏斗に移す。これにアセトン20ml，塩化ナトリウム15g及びn―ヘキサン100mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，n―ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にアセトン20ml及びn―ヘキサン70mlを加え，上記と同様に操作して，n―ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn―ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ，40°以下で約1mlに濃縮し，更に室温で窒素を通じて乾固する。この残留物にアセトン及びn―ヘキサンの混液(3：17)10mlを加えて溶かす。

b　精製法

内径15mm，長さ300mmのクロマトグラフ管に，カラムクロマトグラフィー用シリカゲル(粒径150～425μm)5gをn―ヘキサンに懸濁したもの，次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ，カラムの上端に少量のn―ヘキサンが残る程度までn―ヘキサンを流出させる。このカラムにa　抽出法で得られた溶液を注入した後，アセトン及びn―ヘキサンの混液(3：17)50mlを注入し，流出液は捨てる。次いでアセトン及びn―ヘキサンの混液(3：7)100mlを注入し，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40°以下で約1mlに濃縮し，更に室温で窒素を通じて乾固する。この残留物に酢酸エチルを加えて溶かし，正確に20mlとして，これを試験溶液とする。

6．操作法

a　定性試験

次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。

操作条件

カラム　内径0.25mm，長さ30mのケイ酸ガラス製の細管に，ガスクロマトグラフィー用5％フェニル―メチルシリコンを0.25μmの厚さでコーティングしたもの。

カラム温度　100°で1分間保持し，その後毎分30°で昇温し，280°に到達後5分間保持する。

試験溶液注入口温度　250°

注入方式　スプリットレス

検出器　280°で操作する。

ガス流量　キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。ミクロブタニルが約7分で流出する流速に調整する。空気及び水素の流量を至適条件に調整する。

b　定量試験

a　定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

c　確認試験

a　定性試験と同様の操作条件でガスクロマトグラフィー・質量分析を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。また，必要に応じ，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

7．定量限界

0.02mg／kg(茶にあっては0.08mg／kg)

8．留意事項

なし

9．参考文献

なし

10．類型

A

ミルベメクチン及びレピメクチン試験法(農産物)

1．分析対象化合物

2．装置

蛍光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ(HPLC―FL)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

無水トリフルオロ酢酸　無水トリフルオロ酢酸(特級)

ミルベメクチンA3標準品　本品はミルベメクチンA395％以上を含む。

ミルベメクチンA4標準品　本品はミルベメクチンA495％以上を含む。

レピメクチン標準品　本品はレピメクチン97％以上を含む。

4．試験溶液の調製

1)抽出

①穀類、豆類及び種実類の場合

試料10.0gに水20mLを加え、30分間放置する。これにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトン50mLを加えてホモジナイズした後、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、アセトンで正確に200mLとする。この20mLを採り、40℃以下で濃縮し、アセトンを除去する。10％塩化ナトリウム溶液100mLを加え、酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：4)混液50mLで2回振とう抽出する。抽出液を合わせ、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にn―ヘキサン30mLを加え、n―ヘキサン飽和アセトニトリル30mLで2回振とう抽出する。抽出液を合わせ、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン及びn―ヘキサン(1：19)混液5mLを加えて溶かす。

②果実及び野菜の場合

試料20.0gにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトン50mLを加えてホモジナイズした後、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、アセトンで正確に200mLとする。この10mLを採り、40℃以下で濃縮し、アセトンを除去する。10％塩化ナトリウム溶液100mLを加え、酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：4)混液50mLで2回振とう抽出する。抽出液を合わせ、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン及びn―ヘキサン(1：19)混液5mLを加えて溶かす。

③茶の場合

試料5.00gに水20mLを加え、30分間放置する。これにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトン50mLを加えてホモジナイズした後、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、アセトンで正確に200mLとする。この40mLを採り、40℃以下で濃縮し、アセトンを除去する。10％塩化ナトリウム溶液100mLを加え、酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：4)混液50mLで2回振とう抽出する。抽出液を合わせ、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン及びn―ヘキサン(1：19)混液5mLを加えて溶かす。

2)精製

グラファイトカーボンミニカラム(500mg)の下にシリカゲルミニカラム(690mg)を連結し、アセトン及びn―ヘキサン各10mLを順次注入し、流出液は捨てる。このカラムに1)で得られた溶液を注入した後、アセトン及びn―ヘキサン(1：19)混液15mLを注入し、流出液は捨てる。次いで、アセトン及びn―ヘキサン(3：7)混液30mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にトルエン1mLを加えて溶かす。

3)蛍光誘導体化

2)で得られた溶液にトリエチルアミン0.05mL及び無水トリフルオロ酢酸0.1mLを加えて密栓し、40℃で30分間緩やかに振とう後、トリエチルアミン0.05mLを加え、窒素気流下で溶媒を除去する。この残留物をメタノールに溶解し、正確に5mLとしたものを試験溶液とする。

5．検量線の作成

1)ミルベメクチンについて

ミルベメクチンA3標準品及びミルベメクチンA4標準品の混合標準溶液(各2mg／Lアセトニトリル溶液)を調製する。混合標準溶液1mLを採り窒素気流下で溶媒を除去した後、トルエン1mLを加えて溶かし、4．試験溶液の調製3)蛍光誘導体化と同様の操作を行い、蛍光誘導体の検量線用メタノール溶液を調製する。この溶液を希釈してメタノール溶液を数点調製し、それぞれHPLC―FLに注入し、ピーク高法もしくはピーク面積法で検量線を作成する。なお、本法に従って試験溶液を調製した場合、試料中0.01mg／kgに相当する試験溶液中濃度は各0.002mg／Lである。

2)レピメクチンについて

レピメクチン標準品の2mg／Lアセトニトリル溶液を調製し、その1mLを採り窒素気流下で溶媒を除去した後、トルエン1mLを加えて溶かし、4．試験溶液の調製3)蛍光誘導体化と同様の操作を行い、蛍光誘導体の検量線用メタノール溶液を調製する。この溶液を希釈してメタノール溶液を数点調製し、それぞれHPLC―FLに注入し、レピメクチンA3及びレピメクチンA4の両ピークの高さ又は面積の合計を用いて、ピーク高法もしくはピーク面積法で検量線を作成する。なお、本法に従って試験溶液を調製した場合、試料中0.01mg／kgに相当する試験溶液中濃度は0.002mg／Lである。

6．定量

試験溶液をHPLC―FLに注入し、5の検量線でミルベメクチンA3、ミルベメクチンA4及びレピメクチンの含量を求める。

7．確認試験

HPLC―FLにより確認する。

8．測定条件

(例)

検出器：FL(励起波長368nm、蛍光波長460nm)

カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル、内径4.6mm、長さ150mm、粒子径5μm

カラム温度：40℃

移動相：アセトニトリル及び水(9：1)混液

注入量：20μL

保持時間の目安：

ミルベメクチンA3；14分

ミルベメクチンA4；18分

レピメクチンA3；13分

レピメクチンA4；15分

9．定量限界

0.01mg／kg

10．留意事項

1)試験法の概要

ミルベメクチン(ミルベメクチンA3及びミルベメクチンA4)及びレピメクチン(レピメクチンA3及びレピメクチンA4)を試料からアセトンで抽出し、酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：4)混液で転溶した後、穀類、豆類及び種実類はアセトニトリル／ヘキサン分配で脱脂する。グラファイトカーボン／シリカゲル連結ミニカラムで精製した後、蛍光誘導体化しHPLC―FLで定量及び確認する方法である。

2)注意点

①蛍光誘導体化において、30分間振とう後に添加するトリエチルアミンは、誘導体化反応を停止するために加える。誘導体化後に溶媒を除去した後、残留物が0.1～0.2mL程度残る。また、蛍光誘導体は不安定であることから、蛍光誘導体化後の操作は速やかに行い、測定まで即日で行うと良い。

②確認条件

検出器：蛍光光度型検出器(励起波長368nm、蛍光波長460nm)

カラム：フェニル結合型シリカゲル、内径4.6mm、長さ250mm、粒子径5μm

カラム温度：40℃

移動相：アセトニトリル及び水の混液(3：1)

保持時間の目安：

ミルベメクチンA3；13分

ミルベメクチンA4；15分

レピメクチンA3；16分

レピメクチンA4；18分

なお、試験法開発時にLC―MS／MSでの確認条件も検討したが、十分な感度が得られなかった。

③試験法開発時には、レピメクチンA3及びレピメクチンA4それぞれの標準品を入手できなかったため、両者の混合標準品(それぞれの割合はレピメクチンA3が20％以下、レピメクチンA4が80％以上のもの)を用いて両ピークの合計値で定量を行った。レピメクチンA3及びレピメクチンA4の各標準品が入手可能な場合には、それぞれの含量を求めその和を分析値とする。

11．参考文献

旧環境省告示ミルベメクチン試験法

12．類型

C

ミロサマイシン試験法(畜水産物)

1．分析対象化合物

ミロサマイシン

2．装置

液体クロマトグラフ・タンデム型質量分析計(LC―MS／MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

ジビニルベンゼン―N―ビニルピロリドン共重合体ミニカラム(60mg)内径8～9mmのポリエチレン製のカラム管にジビニルベンゼン―N―ビニルピロリドン共重合体60mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離特性を有するものを用いる。

ミロサマイシン標準品　本品はミロサマイシン95％以上を含む。

4．試験溶液の調製

1)抽出

①肉、脂肪、肝臓、腎臓、魚介類、乳及び卵の場合

試料10.0gにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、毎分3,500回転で5分間遠心分離し、上澄液を採る。残留物にアセトン50mLを加えてホモジナイズした後、毎分3,500回転で5分間遠心分離し、得られた上澄液を合わせ、アセトンを加えて正確に200mLとする。この10mLを採り、2―プロパノール5mLを加えて40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にn―ヘキサン30mLを加え、n―ヘキサン飽和アセトニトリル30mLずつで3回振とう抽出する。抽出液を合わせ、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物に水及びメタノール(7：3)混液10mLを加えて溶かす。

②はちみつの場合

試料10.0gに水10mLを加えて溶かした後、アセトン100mLを加え、振とう抽出した後、毎分3,500回転で5分間遠心分離し、上澄液を採る。残留物にアセトン50mLを加えてホモジナイズした後、毎分3,500回転で5分間遠心分離し、得られた上澄液を合わせ、アセトンを加えて正確に200mLとする。この10mLを採り、2―プロパノール5mLを加えて40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にn―ヘキサン30mLを加え、n―ヘキサン飽和アセトニトリル30mLずつで3回振とう抽出する。抽出液を合わせ、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物に水及びメタノール(7：3)混液10mLを加えて溶かす。

2)精製

ジビニルベンゼンーN―ビニルピロリドン共重合体ミニカラム(60mg)にメタノール5mL及び水及びメタノール(7：3)混液5mLを順次注入し、流出液は捨てる。このカラムに1)で得られた溶液を注入した後、さらに水及びメタノール(7：3)混液5mLを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトニトリル10mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をメタノールに溶解し、正確に5mLとしたものを試験溶液とする。

5．検量線の作成

ミロサマイシン標準品の0.001～0.02mg／L溶液(メタノール)を数点調製し、それぞれ5μLをLC―MS／MSに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

6．定量

試験溶液5μLをLC―MS／MSに注入し、5の検量線でミロサマイシンの含量を求める。

7．確認試験

LC―MS／MSにより確認する。

8．測定条件

(例)

カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル、内径2.1mm、長さ150mm、粒子径3.5μm

カラム温度：40℃

移動相：0.05vol％ギ酸・アセトニトリル溶液及び0.05vol％ギ酸混液(1：4)から(1：1)までの濃度勾配を15分間で行う。

イオン化モード：ESI(＋)

主なイオン(m／z)：プリカーサーイオン728、プロダクトイオン158、116

保持時間の目安：8分

9．定量限界

0.01mg／kg

10．留意事項

1)試験法の概要

ミロサマイシンを試料からアセトンで抽出し、アセトニトリル／ヘキサン分配で脱脂した後、ジビニルベンゼン―N―ビニルピロリドン共重合体ミニカラムで精製し、LC―MS／MSで定量及び確認する方法である。

2)注意点

①ミロサマイシンのLC―MS／MS測定で、試験法開発時に使用したイオンを以下に示す。

定量イオン(m／z)：プリカーサーイオン728、プロダクトイオン158

定性イオン(m／z)：プリカーサーイオン728、プロダクトイオン116

②遠心分離後の上澄液を採る際に、浮遊物等がある場合には綿栓ろ過を行うと良い。

③組織・臓器(肝臓、腎臓など)によっては、特に鮮度が高い場合、試料採取後放置するとミロサマイシンが減少する場合があることが報告されており、試料採取後速やかに抽出操作を開始することが望ましい。また、必要に応じて、放置中の減少がないことを確認することが望ましい。

11．参考文献

なし。

12．類型

C

メタアルデヒド試験法(農産物)

1．分析対象化合物

メタアルデヒド

2．装置

ガスクロマトグラフ・質量分析計(GC／MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

グラファイトカーボンミニカラム(250mg)　内径9mmのポリエチレン製のカラム管に、グラファイトカーボン250mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離特性を有するものを用いる。

多孔性ケイソウ土カラム(5mL保持用)　内径19～20mmのポリエチレン製のカラム管に、5mLを保持することができる量のカラムクロマトグラフィー用に製造した顆粒状多孔性ケイソウ土を充てんしたもの又はこれと同等の分離特性を有するものを用いる。

メタアルデヒド標準品　本品はメタアルデヒド97％以上を含み、融点は243～246℃(封管)である。

4．試験溶液の調製

1)　抽出

(1)　穀類、豆類及び種実類の場合

試料10.0gに水20mLを加え、2時間放置する。これにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトン50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、アセトンを加え正確に200mLとする。この20mLに水1mLを加え、40℃以下で約3mLまで濃縮する。

(2)　果実及び野菜の場合

試料20.0gにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトン50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、アセトンを加え正確に200mLとする。この10mLに水2mLを加え、40℃以下で約3mLまで濃縮する。

(3)　茶の場合

試料5.00gに水20mLを加え、2時間放置する。これにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトン50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、アセトンを加え正確に200mLとする。この40mLを40℃以下で約4mLまで濃縮する。

2)　精製

グラファイトカーボンミニカラム(250mg)及び合成ケイ酸マグネシウムミニカラム(900mg)に酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：9)混液5mLを注入し、流出液は捨てる。1)で得られた濃縮液を多孔性ケイソウ土カラムに注入し、10分間放置する。多孔性ケイソウ土カラムの下にグラファイトカーボンミニカラム及び合成ケイ酸マグネシウムミニカラムを接続する。酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：9)混液30mLを注入し、溶出液を40℃以下で約3mLまで濃縮する。濃縮液にn―ヘキサンを加えて正確に5mLとしたものを試験溶液とする。