(3)　抹茶以外の茶の場合

検体6.00gを100°の水360mlに浸し，室温で5分間放置した後，ろ過し，冷後ろ液300mlを500mlの分液漏斗に移す。これにアセトン20ml，塩化ナトリウム15g及びn―ヘキサン100mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，n―ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にアセトン20ml及びn―ヘキサン50mlを加え，上記と同様に操作して，n―ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn―ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ，40°以下で約1mlに濃縮し，更に室温で窒素を通じて乾固する。この残留物に酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(1：19)20mlを加えて溶かす。

b　精製法

(1)　合成ケイ酸マグネシウムカラムクロマトグラフィー

内径15mm，長さ300mmのクロマトグラフ管に，カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム10gをn―ヘキサンに懸濁したもの，次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ，カラムの上端に少量のn―ヘキサンが残る程度までn―ヘキサンを流出させる。このカラムにa　抽出法で得られた溶液10mlを注入した後，酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(1：19)40mlを注入し，流出液は捨てる。次いで酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(3：17)70mlを注入し，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40°以下で約1mlに濃縮し，更に室温で窒素を通じて乾固する。この残留物に酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(1：49)10mlを加えて溶かす。

(2)　シリカゲルカラムクロマトグラフィー

内径15mm，長さ300mmのクロマトグラフ管に，カラムクロマトグラフィー用シリカゲル(粒径150～425μm)10gをn―ヘキサンに懸濁したもの，次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ，カラムの上端に少量のn―ヘキサンが残る程度までn―ヘキサンを流出させる。このカラムに(1)　合成ケイ酸マグネシウムカラムクロマトグラフィーで得られた溶液を注入した後，酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(1：49)50mlを注入し，流出液は捨てる。次いで酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(1：9)70mlを注入し，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40°以下で約1mlに濃縮し，更に室温で窒素を通じて乾固する。この残留物にアセトンを加えて溶かし，正確に2mlとして，これを試験溶液とする。

6．操作法

a　定性試験

次の操作条件で試験を行う。試験結果がいずれの操作条件においても標準品と一致しなければならない。

操作条件1

カラム充てん剤　カラム担体に対してガスクロマトグラフィー用シリコンを5％含ませる。

クロマトグラフ管　内径2～3mm，長さ1.0～1.5mのガラス管を用いる。

カラム温度　210～240°

試験溶液注入口温度　230～270°

検出器　250～280°で操作する。

ガス流量　キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。ピリダベンが約6分で流出する流速に調整する。空気及び水素の流量を至適条件に調整する。

操作条件2

カラム　内径0.53mm，長さ10～15mのケイ酸ガラス製の細管に，ガスクロマトグラフィー用メチルシリコンを0.5～15μmの厚さでコーティングしたもの。

カラム温度　210～240°

試験溶液注入口温度　230～270°

検出器　250～280°で操作する。

ガス流量　キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。ピリダベンが約6分で流出する流速に調整する。空気及び水素の流量を至適条件に調整する。

b　定量試験

a　定性試験の操作条件1又は2のうちいずれかの条件で得られた試験結果に基づき，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

c　確認試験

b　定量試験と同様の操作条件でガスクロマトグラフィー・質量分析を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。また，必要に応じ，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

7．定量限界

0.01mg／kg(ホップ及び茶にあっては0.04mg／kg)

8．留意事項

なし

9．参考文献

なし

10．類型

A

ピリダリル試験法(農産物)

1．分析対象化合物

ピリダリル

2．装置

アルカリ熱イオン化検出器付きガスクロマトグラフ(GC―FTD)、高感度窒素・リン検出器付きガスクロマトグラフ(GC―NPD)又は電子捕獲型検出器付きガスクロマトグラフ(GC―ECD)

ガスクロマトグラフ・質量分析計(GC／MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

グラファイトカーボンミニカラム(250mg)　内径12～13mmのポリエチレン製のカラム管に、グラファイトカーボン250mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離特性を有するものを用いる。

ピリダリル標準品　本品はピリダリル98％以上を含む。

4．試験溶液の調製

1)　抽出

(1)　豆類の場合

試料10.0gを量り採り、水20mLを加え、2時間放置する。

これにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトン50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液にアセトンを加えて正確に200mLとする。この100mLを採り、40℃以下で約15mLまで濃縮する。これに10％塩化ナトリウム溶液100mLを加え、n―ヘキサン100mL及び50mLで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。

この残留物にn―ヘキサン50mLを加え、n―ヘキサン飽和アセトニトリル50mLずつで3回振とう抽出する。抽出液を合わせ、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン及びトルエン(4：1)混液5mLを加えて溶かす。

(2)　果実及び野菜の場合

試料20.0gにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトン50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液にアセトンを加えて正確に200mLとする。この100mLを採り、40℃以下で約15mLまで濃縮する。これに10％塩化ナトリウム溶液100mLを加え、n―ヘキサン100mL及び50mLで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン及びトルエン(4：1)混液5mLを加えて溶かす。

2)　精製

(1)　グラファイトカーボンカラムクロマトグラフィー

グラファイトカーボンミニカラム(250mg)にアセトン及びトルエン(4：1)混液10mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに、1)で得られた溶液を注入した後、さらにアセトン及びトルエン(4：1)混液15mLを注入する。全溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にn―ヘキサン5mLを加えて溶かす。

(2)　アミノプロピルシリル化シリカゲルカラムクロマトグラフィー

アミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(360mg)にn―ヘキサン10mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに(1)で得られた溶液を注入した後、さらにn―ヘキサン10mLを注入する。全溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をアセトンに溶解し、豆類の場合は正確に1mL、果実及び野菜の場合は正確に2mLとしたものを試験溶液とする。

5．検量線の作成

ピリダリル標準品の0.1～2mg／Lアセトン溶液を数点調製し、それぞれ2μLをGCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

6．定量

試験溶液2μLをGCに注入し、5の検量線でピリダリルの含量を求める。

7．確認試験

GC／MS又はGC／MS／MSにより確認する。

8．測定条件

1)　GC

検出器：FTD、NPD又はECD

カラム：メチルシリコン　内径0.53mm、長さ15m、膜厚1μm

カラム温度：250℃

注入口温度：250℃

検出器温度：280℃

キャリヤーガス：ヘリウム(ECDの場合は、高純度窒素ガス)

保持時間の目安：4分

2)　GC／MS

カラム：5％フェニル―メチルシリコン　内径0.25mm、長さ30m、膜厚0.25μm

カラム温度：200℃(1分)―10℃／分―280℃(5分)

注入口温度：250℃

キャリヤーガス：ヘリウム

イオン化モード(電圧)：EI(70eV)

主なイオン(m／z)：204、164、146

注入量：1μL

保持時間の目安：12分

9．定量限界

0.02mg／kg

10．留意事項

1)　試験法の概要

ピリダリルを試料からアセトンで抽出し、n―ヘキサンに転溶する。果実及び野菜はそのまま、豆類はアセトニトリル／ヘキサン分配で脱脂した後、グラファイトカーボンミニカラム及びアミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラムで精製した後、GC(FTD、NPD又はECD)で測定し、GC／MSで確認する方法である。

2)　注意点

(1)　グラファイトカーボンミニカラム(250mg)では、溶出溶媒としてアセトン及びトルエン(4：1)混液を用いているが、緑葉野菜のように夾雑物の比較的多い試料を対象とする場合は、酢酸エチル(20mL)やアセトン(20mL)でも溶出可能である。試料夾雑物の溶出量は、アセトン及びトルエンの混液で溶出するよりも若干低下することが期待できる。

(2)　精製が不十分な場合は、シリカゲルミニカラム(690mg)［試料溶液を負荷した後、n―ヘキサン10mLで洗浄、酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：19)混液10mLで溶出］やオクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(1,000mg)［試料溶液を負荷した後、アセトニトリル及び水(4：1)混液10mLで洗浄、アセトニトリル10mLで溶出］による精製を追加するとよい。

(3)　GC(ECD)測定では、試料夾雑物による影響を受けやすく、試料による感度変動が大きい。また、GC／MS測定では、ピリダリルの感度が食品の品目によって大幅に高まる場合がある。

11．参考文献

厚生労働省「ピリダリル試験法」(平成16年7月6日通知)

12．類型

C

ピリチオバックナトリウム塩試験法(農産物)

1．分析対象化合物

ピリチオバックナトリウム塩

2．装置

カラムスイッチングシステム及び紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ(HPLC―UV(カラムスイッチング))

液体クロマトグラフ・質量分析計(LC／MS)又は液体クロマトグラフ・タンデム型質量分析計(LC／MS／MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

0.03mol／Lリン酸緩衝液(pH3.0)　リン酸二水素カリウム7.21g、アジ化ナトリウム0.2g及びリン酸0.40mLに水を加えて2,000mLとし、リン酸又は50％水酸化ナトリウム溶液を加えてpH3.00に調整する。

水(pH2.4)　水にリン酸を加えてpH2.40(±0.05)に調整する。

オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(2,000mg)　内径12～13mmのポリエチレン製のカラム管に、オクタデシルシリル化シリカゲル2,000mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離性能を有するものを用いる。

トリメチルアミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(5,000mg)　内径19mmのポリエチレン製のカラム管に、トリメチルアミノプロピルシリル化シリカゲル5,000mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離性能を有するものを用いる。

4．試験溶液の調製

1)　抽出

試料5.00gにアセトニトリル及び0.01mol／L炭酸アンモニウム溶液(2：1)混液100mLを加え、ホモジナイズした後、3,000回転で15分間遠心分離する。

上澄液60mLを採り、これにジクロロメタン50mLを加え、振とうした後、ジクロロメタン層は捨てる。水層に塩化ナトリウム0.05g及びジクロロメタン50mLを加え、振とうした後、ジクロロメタン層は捨てる。

2)　精製

(1)　トリメチルアミノプロピルシリル化シリカゲルカラムクロマトグラフィー

トリメチルアミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(5,000mg)にメタノール20mL、水20mL及び0.01mol／L炭酸アンモウム溶液20mLを順次注入し、各流出液は捨てる。このカラムに1)で得られた水層を注入した後、0.01mol／L炭酸アンモニウム溶液5mLを注入し、各流出液は捨てる。

(2)　オクタデシルシリル化シリカゲルカラムクロマトグラフィー

オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(2,000mg)にメタノール5mL及び水10mLを順次注入し、各流出液は捨てる。次いで1mol／Lクエン酸カリウム溶液及びメタノール(3：1)混液20mLを注入し、カラムの上に同混液約10mLが残るまで流出させ、流出液は捨てる。このカラムを、(1)のミニカラムの下に連結し、(1)のミニカラムに1mol／Lクエン酸カリウム溶液及びメタノール(3：1)混液20mLを注入し、流出液を捨て、更に10分間通気して脱水する。

(1)のミニカラムを捨て、オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムに水10mL、水(pH2.4)10mL及び30％メタノール含有水(pH2.4)10mLを順次注入し、各流出液を捨て、更に15分間通気して脱水する。次いで、メタノール10mLを注入し、溶出液を50℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をアセトニトリル及び0.03mol／Lリン酸緩衝液(28：72)混液0.5mLに溶解したものを試験溶液とする。

5．検量線の作成

ピリチオバックナトリウム塩標準品をメタノールに溶解して標準原液を調製し、アセトニトリル及び0.03mol／Lリン酸緩衝液(28：72)混液で希釈して、0.03～0.8mg／Lの標準溶液を数点調製し、それぞれ100μLをHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法により検量線を作成する。

6．定量

試験溶液100μLをHPLC又はLC／MS(LC／MS／MS)に注入し、5の検量線でピリチオバックナトリウム塩の含量を求める。

7．確認試験

LC／MS(LC／MS／MS)により確認する。

8．測定条件

HPLC(カラムスイッチング方式)

検出器：UV(波長254nm)

カラム(1)：シアノプロピルシリル化シリカゲル(粒径5μm)　内径4.0mm、長さ150mm

カラム(2)：オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)、内径4.6mm、長さ250mm

カラム温度：40℃

移動相：

A：アセトニトリル、B：0.03mol／Lリン酸緩衝液(pH3.0)、C：水

カラム(1)とカラム(2)を離した状態で、試験溶液を注入後、A28％、B72％、流速1mL／分で操作し、ピリチオバックナトリウム塩の保持時間直前(注入から8～10分後)にカラム(1)とカラム(2)をつなぎ、ピリチオバックナトリウム塩をカラム(1)からカラム(2)に移す。

ピリチオバックナトリウム塩がカラム(2)に移動した後、カラム(1)とカラム(2)を切り離し、カラム(1)をA75％、C25％、流速2mL／分で5分間洗浄する。次いで、A43％、B57％、流速2mL／分で10分間調整した後、同移動相、流速1mL／分で1分間調整する。

再びカラム(1)とカラム(2)をつなぎ、A43％、B57％、流速1mL／分で操作し、ピリチオバックナトリウム塩を溶出させる。

次いで、両カラムをA75％、C25％、流速1mL／分で15分間洗浄した後、A43％、B57％、流速1mL／分で調整する。

カラム(1)とカラム(2)を離し、カラム(1)をA28％、B72％、流速2mL／分で5分間調整した後、流速1mL／分で1分間調整する。

注入量：100μL

保持時間の目安：37分

LC／MS／MS

カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)　内径4.6mm、長さ150mm

カラム温度：30℃

移動相：A液及びB液について下の表の濃度勾配で送液する。

A液：1％酢酸

B液：アセトニトリル

流量：1.0mL／分

イオン化モード：APCI

主なイオン(m／z)：ESI(＋)　プリカーサーイオン327、プロダクトイオン309

注入量：100μL

保持時間の目安：15分

9．定量限界

0.01mg／kg

10．留意事項

1)　試験法の概要

試料からピリチオバックナトリウム塩をアセトニトリル及び0.01mol／L炭酸アンモニウム溶液(2：1)混液で抽出し、ジクロロメタンで洗浄した後、トリメチルアミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラム及びオクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムで精製し、カラムスイッチングシステム付きHPLC―UV又はLC／MS(LC／MS／MS)で測定し、LC／MS(LC／MS／MS)で確認する方法である。

2)　注意点

(1)　本法はDuPont社が開発した、綿実を対象とした試験法である。Sumpter,S.R.らの方法ではカラムスイッチングシステム付きHPLCで測定している。LC／MS／MSの条件は、Bramble,F.Q.らの報告を引用した。

(2)　0.03mol／Lリン酸緩衝液(pH3.0)は毎日使用前に0.45μmのフィルターでろ過する。

(3)　試験溶液の調製時は、アセトニトリル及び0.03mol／Lリン酸緩衝液(28：72)混液に溶解する前の状態で冷蔵保存可能である。

11．参考文献

Bramble,F.Q.ら，Analytical method for the determination of pyrithiobac sodium in cotton gintrash using ASE extraction and LC／MS／MS analysis,DuPont社報告、

http://www.epa.gov/oppbead1/methods/rammethods/2001_035M.tif

12．類型

D(Sumpter,S.R.ら，Improved analytical enforcement method for the determination of KIH―2031(DPX-PE350)residues in cottonseed using column-switching liquid chromatography、DuPont社報告、

http://www.epa.gov/oppbead1/methods/rammethods/1994_001M.tif)

ピリデート試験法(農産物)

1．分析対象化合物

ピリデート、ピリデートヒドロキシ体、ピリデートヒドロキシ体抱合体

2．装置

紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフを用いる。

3．試薬、試液

次に示すもの以外は，総則の3に示すものを用いる。

0.2mol／l酢酸アンモニウム緩衝液　酢酸アンモニウム15.4gを蒸留水に溶かして1,000mlとし，アンモニア水を加えてpH9に調整する。

4．標準品

ピリデート　本品はピリデート99％以上を含む。

融点　本品の融点は27°である。

ピリデートヒドロキシ体　本品はピリデートヒドロキシ体99％以上を含む。

融点　本品の融点は216～218°である。

5．試験溶液の調製

a　抽出法

穀類，豆類及び種実類の場合は，検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後，その10.0gを量り採り，水20mlを加え，2時間放置する。

野菜の場合は，検体約1kgを精密に量り，必要に応じ適量の水を量つて加え，細切均一化した後，検体20.0gに相当する量を量り採る。

これにアセトン，0.2mol／l酢酸アンモニウム緩衝液及びモルホリンの混液(100：20：0.5)120mlを加え，3分間細砕した後，ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り，上記の混液50mlを加え，上記と同様に操作して，ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ，40°以下で約70mlに濃縮する。

これをあらかじめ酢酸エチル50mlを入れた200mlの分液漏斗(Ⅰ)に移す。0.2mol／l酢酸アンモニウム緩衝液15mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い，洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，水層を200mlの分液漏斗(Ⅱ)に移す。これに酢酸エチル50mlを加え，上記と同様に操作して，水層を200mlの三角フラスコに移す。

b　加水分解

これに1mol／l硫酸を加えてpH4に調整し，空冷管を付けて60°で40分間加熱する。冷後200mlの分液漏斗に移し，蒸留水15mlを用いて三角フラスコを洗い，洗液を分液漏斗に合わせる。これに酢酸エチル50mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，酢酸エチル層を200mlの三角フラスコに移す。水層に酢酸エチル50mlを加え，上記と同様に操作して，酢酸エチル層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いで酢酸エチル20mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ，40°以下で酢酸エチルを除去する。この残留物に酢酸1滴を加え，アセトン及びn―ヘキサンの混液(1：9)20mlを加えて溶かす。

c　精製法

(1)　合成ケイ酸マグネシウムカラムクロマトグラフィー

内径15mm，長さ300mmのクロマトグラフ管に，カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム5gをn―ヘキサンに懸濁したもの，次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ，カラムの上端に少量のn―ヘキサンが残る程度までn―ヘキサンを流出させる。このカラムにa　抽出法で得られた溶液を注入した後，アセトン及びn―ヘキサンの混液(1：9)80mlを注入し，流出液は捨てる。次いでアセトン及びn―ヘキサンの混液(2：8)60mlを注入し，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40°以下でアセトン及びヘキサンを除去する。この残留物に酢酸1滴を加え，アセトン及びn―ヘキサンの混液(2：8)10mlを加えて溶かす。

(2)　シリカゲルカラムクロマトグラフィー

内径15mm，長さ300mmのクロマトグラフ管に，カラムクロマトグラフィー用シリカゲル(粒径63～200μm)5g，次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gをn―ヘキサンに懸濁したものを入れ，カラムの上端に少量のn―ヘキサンが残る程度までn―ヘキサンを流出させる。このカラムに(1)　合成ケイ酸マグネシウムカラムクロマトグラフィーで得られた溶液を注入した後，アセトン及びn―ヘキサンの混液(2：8)10mlを注入し，流出液は捨てる。次いでアセトン及びn―ヘキサンの混液(2：8)100mlを注入し，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40°以下でアセトン及びn―ヘキサンを除去する。この残留物にメタノールを加えて溶かし，正確に1mlとして，これを試験溶液とする。

6．操作法

a　定性試験

次の操作条件で試験を行う。試験結果はピリデートヒドロキシ体の標準品と一致しなければならない。

操作条件

カラム充てん剤　オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)を用いる。

クロマトグラフ管　内径4～6mm，長さ150～250mmのステンレス管を用いる。

カラム温度　40°

検出器　波長280nmで操作する。

移動相　メタノール，水及び酢酸の混液(4：6：0.05)を用いる。ピリデートヒドロキシ体が13～14分で流出する流速に調整する。

b　定量試験

a　定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき，ピーク高法又はピーク面積法によりピリデートヒドロキシ体の定量を行い，これに係数1.83を乗じてピリデートの含量を求める。

7．定量限界

0.01mg／kg(なたねにあっては0.05mg／kg)

8．留意事項

ピリデートは、ピリデート及びピリデートヒドロキシ体抱合体をピリデートヒドロキシ体に変換した後、ピリデートヒドロキシ体について定量を行い、その含量に係数を乗じてピリデートの含量に換算し、これを分析値とすること。

9．参考文献

なし

10．類型

A

ピリフェノックス試験法(農産物)

1．分析対象化合物

ピリフェノックス(E体)、ピリフェノックス(Z体)

2．装置

電子捕獲型検出器付きガスクロマトグラフ及びガスクロマトグラフ・質量分析計を用いる。

3．試薬、試液

総則の3に示すものを用いる。

4．標準品

ピリフェノックス(E体)　本品はピリフェノックス(E体)99％以上を含む。

沸点　本品の沸点は139～140°(減圧・0.0040kPa)である。

ピリフェノックス(Z体)　本品はピリフェノックス(Z体)99％以上を含む。

融点　本品の融点は63.5～64.0°である。

5．試験溶液の調製

a　抽出法

(1)　豆類、果実、野菜及び抹茶の場合

豆類の場合は、検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後、その20.0gを量り採る。

果実及び野菜類の場合は、検体約1kgを精密に量り、必要に応じ適量の水を量つて加え、塩酸ヒドロキシルアミン50gを加えて細切均一化した後、検体20.0gに相当する量を量り採る。

抹茶の場合は，検体20.0gを量り採る。

これに5％酢酸鉛溶液10ml及びメタノール100mlを加え，振とう機を用いて30分間激しく振り混ぜた後，静置し，ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り，メタノール50mlを加え，振とう機を用いて30分間激しく振り混ぜた後，静置し，上記と同様に操作して，ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ，40°以下で約50mlに濃縮する。

これをあらかじめ5％塩化ナトリウム溶液100ml及びジクロロメタン50mlを入れた500mlの分液漏斗に移す。これにアセトニトリル50ml及び1mol／l水酸化ナトリウム溶液10mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，ジクロロメタン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にジクロロメタン50mlを加え，上記と同様に操作して，ジクロロメタン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでジクロロメタン20mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う。洗液をその減圧濃縮器中に合わせ，40°以下でジクロロメタンを除去する。この残留物に酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(3：17)10mlを加えて溶かす。

(2)　抹茶以外の茶の場合

検体9.00gを100°の水540mlに浸し，室温で5分間放置した後，ろ過し，冷後ろ液360mlを500mlの三角フラスコに移す。これにアセトン100ml及び飽和酢酸鉛溶液2mlを加え，10秒間振り混ぜた後，ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いて吸引ろ過し，ろ液を1,000mlの三角フラスコに移す。次いでアセトン及び水の混液(1：1)50mlを用いて500mlの三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う。洗液を1,000mlの三角フラスコに合わせる。

これをあらかじめ5％塩化ナトリウム溶液100ml及びジクロロメタン50mlを入れた1,000mlの分液漏斗に移す。これにアセトニトリル50ml及び1mol／l水酸化ナトリウム溶液10mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，ジクロロメタン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にジクロロメタン50mlを加え，上記と同様に操作して，ジクロロメタン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでジクロロメタン20mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う。洗液をその減圧濃縮器中に合わせ，40°以下でジクロロメタンを除去する。この残留物に酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(3：17)10mlを加えて溶かす。

b　精製法

内径15mm，長さ300mmのクロマトグラフ管に，カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム5gをn―ヘキサンに懸濁したもの，次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ，カラムの上端に少量のn―ヘキサンが残る程度までn―ヘキサンを流出させる。このカラムにa　抽出法で得られた溶液を注入した後，酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(3：17)50mlを注入し，流出液は捨てる。次いで酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(3：7)100mlを注入し，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40°以下で酢酸エチル及びn―ヘキサンを除去する。この残留物に酢酸エチルを加えて溶かし，正確に10mlとして，これを試験溶液とする。

6．操作法

a　定性試験

次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。

操作条件

カラム　内径0.53mm，長さ15mのケイ酸ガラス製の細管に，ガスクロマトグラフィー用5％フェニル―メチルシリコンを1.5μmの厚さでコーティングしたもの。

カラム温度　180°で2分間保持し，その後毎分5°で昇温し，240°に到達後5分間保持する。

試験溶液注入口温度　280°

検出器　290°で操作する。

注入方式　スプリットレス

ガス流量　キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。ピリフェノックス(E体)が約11分で流出する流速に調整する。

b　定量試験

a　定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき，ピリフェノックス(E体)及びピリフェノックス(Z体)のそれぞれについてピーク高法又はピーク面積法により定量を行い，ピリフェノックス(E体)及びピリフェノックス(Z体)の和としてピリフェノックスの含量を求める。

7．定量限界

0.01mg／kg

8．留意事項

ピリフェノックスは、ピリフェノックス(E体)及びピリフェノックス(Z体)のそれぞれについて定量を行い、これらの和を分析値とすること。

9．参考文献

なし

10．類型

A

ピリフルキナゾン試験法(農産物)

1．分析対象化合物

ピリフルキナゾン

1，2，3，4―テトラヒドロ―3―［(3―ピリジルメチル)アミノ］―6―［1，2，2，2―テトラフルオロ―1―(トリフルオロメチル)エチル］キナゾリン―2―オン(以下「代謝物B」という。)

2．装置

液体クロマトグラフ・タンデム型質量分析計(LC―MS／MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

ピリフルキナゾン標準品　本品はピリフルキナゾン95％以上を含む。

代謝物B標準品　本品は代謝物B95％以上を含む。

4．試験溶液の調製

1)　抽出

①　穀類、豆類及び種実類の場合

試料10.0gに水20mLを加え、30分間放置する。これにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトン50mLを加えてホモジナイズした後、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせ、アセトンを加えて正確に200mLとする。この10mLを採り、水20mLを加える。

②　果実及び野菜の場合

試料20.0gにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトン50mLを加えてホモジナイズした後、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせ、アセトンを加えて正確に200mLとする。この5mLを採り、水10mLを加える。

③　茶の場合

試料5.00gに水20mLを加え、30分間放置する。これにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトン50mLを加えてホモジナイズした後、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせ、アセトンを加えて正確に200mLとする。この10mLを採り、水20mLを加える。

2)　精製

ジビニルベンゼン―N―ビニルピロリドン共重合体ミニカラム(500mg)にアセトニトリル及び水各10mLを順次注入し、流出液は捨てる。このカラムに1)で得られた溶液を注入した後、アセトニトリル及び水(3：7)混液10mLを注入し、流出液は捨てる。次いで、アセトニトリル及び水(1：1)混液10mLを注入し、溶出液をアセトニトリル及び水(1：1)混液で正確に10mLとしたものを試験溶液とする。

5．検量線の作成

ピリフルキナゾン標準品及び代謝物B標準品のアセトニトリル及び水(1：1)混液の溶液を数点調製し、それぞれをLC―MS／MSに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。本法に従って試験溶液を調製した場合、穀類、豆類、種実類、果実及び野菜では試料中0.01mg／kgに相当する試験溶液中濃度は各化合物とも0.0005mg／Lであり、茶では試料中0.02mg／kgに相当する試験溶液中濃度は各化合物とも0.0005mg／Lである。なお、代謝物Bについては、ピリフルキナゾンに換算した値である。

6．定量

試験溶液をLC―MS／MSに注入し、5の検量線でピリフルキナゾン及び代謝物Bの含量を求める。代謝物Bを含むピリフルキナゾンの含量を求める場合には、次式により求める。

ピリフルキナゾン(代謝物Bを含む。)の含量(ppm)＝A＋B×1.100

A：ピリフルキナゾンの含量(ppm)

B：代謝物Bの含量(ppm)

7．確認試験

LC―MS／MSにより確認する。

8．測定条件

(例)

カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル　内径2.0mm、長さ150mm、粒子径5μm

カラム温度：40℃

移動相：アセトニトリル及び5mmol／L酢酸アンモニウム溶液(1：1)混液

イオン化モード：ESI(＋)

主なイオン(m／z)

ピリフルキナゾン：プリカーサーイオン465、プロダクトイオン423、107、93、92

代謝物B：プリカーサーイオン423、プロダクトイオン107、93、92

注入量：10μL

保持時間の目安

ピリフルキナゾン：8分

代謝物B：6分

9．定量限界

各化合物0.01mg／kg(代謝物Bはピリフルキナゾン換算)

茶の場合は、各化合物0.02mg／kg(代謝物Bはピリフルキナゾン換算)

10．留意事項

1)　試験法の概要

ピリフルキナゾン及び代謝物Bを試料からアセトンで抽出し、ジビニルベンゼン―N―ビニルピロリドン共重合体ミニカラムで精製した後、LC―MS／MSで定量及び確認する方法である。

2)　注意点

①　メタノールの使用により、ピリフルキナゾンの一部が代謝物Bに変換される可能性がある。

②　ピリフルキナゾン及び代謝物BのLC―MS／MS測定で、試験法開発時に使用したイオンを以下に示す。

ピリフルキナゾン

定量イオン(m／z)：プリカーサーイオン465、プロダクトイオン92

定性イオン(m／z)：プリカーサーイオン465、プロダクトイオン423、107、93

代謝物B

定量イオン(m／z)：プリカーサーイオン423、プロダクトイオン92

定性イオン(m／z)：プリカーサーイオン423、プロダクトイオン107、93

11．参考文献

なし

12．類型

C

ピリミジフェン試験法(農産物)

1．分析対象化合物

ピリミジフェン

2．装置

アルカリ熱イオン化検出器又は高感度窒素・リン検出器付きガスクロマトグラフ及びガスクロマトグラフ・質量分析計を用いる。

3．試薬、試液

総則の3に示すものを用いる。

4．標準品

ピリミジフェン　本品はピリミジフェン99％以上を含む。

融点　本品の融点は71～72゜である。

5．試験溶液の調製

a　抽出法

検体約1kgを精密に量り，必要に応じ適量の水を量つて加え，細切均一化した後，検体20.0gに相当する量を量り採る。

これにアセトン100mlを加え，3分間細砕した後，ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り，アセトン50mlを加え，3分間細砕した後，上記と同様に操作して，ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ，40゜以下でアセトンを除去する。

これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液100mlを入れた300mlの分液漏斗に移す。n―ヘキサン100mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い，洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，n―ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にn―ヘキサン50mlを加え，上記と同様に操作して，n―ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn―ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ，40゜以下でn―ヘキサンを除去する。この残留物にn―ヘキサン5mlを加えて溶かす。

b　精製法

内径15mm，長さ300mmのクロマトグラフ管に，カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム5gをn―ヘキサンに懸濁したもの，次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ，カラムの上端に少量のn―ヘキサンが残る程度までn―ヘキサンを流出させる。このカラムにa　抽出法で得られた溶液を注入した後，n―ヘキサン100mlを注入し，流出液は捨てる。次いでアセトン及びn―ヘキサンの混液(1：19)100mlを注入し，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40゜以下でアセトン及びn―ヘキサンを除去する。この残留物にアセトンを加えて溶かし，正確に2mlとして，これを試験溶液とする。

6．操作法

a　定性試験

次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。

操作条件

カラム　内径0.25mm，長さ30mのケイ酸ガラス製の細管に，ガスクロマトグラフィー用5％フェニル―メチルシリコンを0.25μmの厚さでコーティングしたもの。

カラム温度　70゜で2分間保持し，その後毎分30゜で昇温し，180゜に到達後1分間保持する。次に毎分5゜で昇温し，250゜に到達後，さらに，毎分10゜で昇温し，280゜に到達後，5分間保持する。

検出器　280゜で操作する。

ガス流量　キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。ピリミジフェンが約27分で流出する流速に調整する。空気及び水素の流量を至適条件に調整する。

b　定量試験

a　定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

c　確認試験

a　定性試験と同様の操作条件でガスクロマトグラフィー・質量分析を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。また，必要に応じ，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

7．定量限界

0.01mg／kg

8．留意事項

なし

9．参考文献

なし

10．類型

A

ピリミスルファン試験法(農産物)

1．分析対象化合物

ピリミスルファン

2．装置

液体クロマトグラフ・質量分析計(LC―MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

シリカゲルミニカラム(800mg)　内径8～9mmのポリエチレン製のカラム管に、カラムクロマトグラフィー用に製造したシリカゲル800mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離特性を有するものを用いる。

ピリミスルファン標準品　本品はピリミスルファン98％以上を含む。

4．試験溶液の調製

1)抽出

①穀類、豆類及び種実類の場合

試料10.0gに水20mLを加え、30分間放置する。これにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトン50mLを加えてホモジナイズした後、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、アセトンを加え正確に200mLとする。この20mLを採り、40℃以下で約2mLまで濃縮し、0.05vol％ギ酸10mLを加える。

②果実及び野菜の場合

試料20.0gにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトン50mLを加えてホモジナイズした後、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、アセトンを加え正確に200mLとする。この10mLを採り、40℃以下で約1mLまで濃縮し、0.05vol％ギ酸10mLを加える。

③茶の場合

試料5.00gに水20mLを加え、30分間放置する。これにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトン50mLを加えてホモジナイズした後、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、アセトンを加え正確に200mLとする。

2)精製

①グラファイトカーボンカラムクロマトグラフィー(茶の場合のみ)

グラファイトカーボンミニカラム(500mg)にアセトン5mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに1)③で得られた溶液20mLを注入した後、アセトン10mLを注入する。全溶出液を40℃以下で約2mLまで濃縮し、0.05vol％ギ酸10mLを加える。

②オクタデシルシリル化シリカゲルカラムクロマトグラフィー

オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(1,000mg)にアセトニトリル及び0.05vol％ギ酸各5mLを順次注入し、流出液は捨てる。このカラムに穀類、豆類、種実類、果実及び野菜の場合は1)で得られた溶液を、茶の場合は2)①で得られた溶液を注入した後、アセトニトリル及び0.05vol％ギ酸(3：7)混液10mLを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトニトリル及び0.05vol％ギ酸(3：2)混液10mLを注入し、溶出液にアセトニトリル及び0.05vol％ギ酸(3：2)混液を加えて正確に10mLとする。この5mLを採り、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン1mLを加えて溶解した後、n―ヘキサン19mLを加える。

③シリカゲルカラムクロマトグラフィー

シリカゲルミニカラム(800mg)にアセトン及びn―ヘキサン(1：19)混液5mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに2)②で得られた溶液を注入し、流出液は捨てる。次いでアセトン及びn―ヘキサン(3：7)混液20mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をアセトニトリル及び0.05vol％ギ酸(3：2)混液に溶解し、穀類、豆類、種実類、果実及び野菜の場合は正確に5mL、茶の場合は正確に2.5mLとしたものを試験溶液とする。

5．検量線の作成

ピリミスルファン標準品のアセトニトリル及び0.05vol％ギ酸(3：2)混液の溶液を数点調製し、それぞれLC―MSに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。なお、本法に従って試験溶液を調製した場合、試料中0.01mg／kgに相当する試験溶液中濃度は0.001mg／Lである。

6．定量

試験溶液をLC―MSに注入し、5の検量線でピリミスルファンの含量を求める。

7．確認試験

LC―MSにより確認する。

8．測定条件

(例)

カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル内径2.0mm、長さ150mm、粒子径3μm

カラム温度：40℃

移動相：アセトニトリル及び0.05vol％ギ酸(1：3)から(3：1)までの濃度勾配を15分間で行い、(3：1)で3分間保持する。

イオン化モード：ESI(－)、ESI(＋)

主なイオン(m／z)：418［ESI(－)］、420［ESI(＋)］

注入量：5μL

保持時間の目安：15分

9．定量限界

0.01mg／kg

10．留意事項

1)試験法の概要

ピリミスルファンを試料からアセトンで抽出し、グラファイトカーボンミニカラム(茶の場合のみ)、オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム及びシリカゲルミニカラムで精製した後、LC―MSで定量及び確認する方法である。

2)注意点

①ピリミスルファンはn―ヘキサンへの溶解性が低いため、オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム精製後の残留物を溶解する際には、アセトンに溶解した後にn―ヘキサンを加える。このとき溶解が不十分であると、回収率が低下したりばらつくことがあるので、溶解の際に超音波処理をすると良い。

②ピリミスルファンのLC―MS測定で、試験法開発時に使用したイオンを以下に示す。

定量イオン(m／z)：418［ESI(－)］

定性イオン(m／z)：420［ESI(＋)］

また、LC―MS／MS測定の例を以下に示す。

イオン化モード：ESI(＋)

主なイオン(m／z)：プリカーサーイオン420、プロダクトイオン370、255

③ピリミスルファンのn―ヘキサン溶液あるいは酢酸エチル溶液では、無水硫酸ナトリウムによるピリミスルファンの損失が報告されている。

11．参考文献

なし

12．類型

C

ピリメタニル試験法(農産物)

1．分析対象化合物

ピリメタニル

2．装置

アルカリ熱イオン化検出器又は高感度窒素・リン検出器付きガスクロマトグラフ及びガスクロマトグラフ・質量分析計を用いる。

3．試薬、試液

次に示すもの以外は，総則の3に示すものを用いる。

カラムクロマトグラフィー用シリカゲル　カラムクロマトグラフィー用に製造したシリカゲル(粒径63～200μm)を130°で12時間以上加熱した後、デシケーター中で放冷し、これに対して水5％を加える。

4．標準品

ピリメタニル　本品はピリメタニル99％以上を含む。

融点　本品の融点は96～97°である。

5．試験溶液の調製

a　抽出法

(1)　豆類の場合

検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後、その10.0gを量り採り、水20mlを加え、2時間放置する。

これにアセトン100mlを加え、3分間細砕した後、ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り、アセトン50mlを加え、3分間細砕した後、上記と同様に操作して、ろ液をそのすり合わせ減圧濃縮器中に合わせ、40°以下で約30mlに濃縮する。

これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液100mlを入れた300mlの分液漏斗に移す。n―ヘキサン100mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い、洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、n―ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にn―ヘキサン50mlを加え、上記と同様に操作して、n―ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn―ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下でn―ヘキサンを除去する。

この残留物にn―ヘキサン30mlを加え、100mlの分液漏斗に移す。これにn―ヘキサン飽和アセトニトリル30mlを加え、振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、アセトニトリル層をすり合わせ減圧濃縮器中に移す。n―ヘキサン層にn―ヘキサン飽和アセトニトリル30mlを加え、上記と同様の操作を2回繰り返し、アセトニトリル層をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下でアセトニトリルを除去する。この残留物にn―ヘキサン5mlを加えて溶かす。

(2)　果実及び野菜の場合

検体約1kgを精密に量り、必要に応じ適量の水を量つて加え、細切均一化した後、検体20.0gに相当する量を量り採る。

これにアセトン100mlを加え、3分間細砕した後、ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り、アセトン50mlを加え、3分間細砕した後、上記と同様に操作して、ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下で約30mlに濃縮する。

これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液100mlを入れた300mlの分液漏斗に移す。n―ヘキサン100mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い、洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、n―ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にn―ヘキサン50mlを加え、上記と同様に操作して、n―ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn―ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下でn―ヘキサンを除去する。この残留物にn―ヘキサン5mlを加えて溶かす。

b　精製法

内径15mm、長さ300mmのクロマトグラフ管にカラムクロマトグラフィー用シリカゲル(粒径63～200μm)5gをn―ヘキサンに懸濁したもの、次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ、カラムの上端に少量のn―ヘキサンが残る程度までn―ヘキサンを流出させる。このカラムにa　抽出法で得られた溶液を注入した後、アセトン及びn―ヘキサンの混液(1：99)100mlを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトン及びn―ヘキサンの混液(1：19)50mlを注入し、流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り、40°以下でアセトン及びn―ヘキサンを除去する。この残留物にn―ヘキサンを加えて溶かし、正確に5mlとして、これを試験溶液とする。

6．操作法

a　定性試験

次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。

操作条件

カラム　内径0.25mm、長さ30mのケイ酸ガラス製の細管に、ガスクロマトグラフィー用5％フェニル―メチルシリコンを0.25μmの厚さでコーティングしたもの。

カラム温度　80°で2分間保持し、その後毎分30°で昇温し、180°に到達後1分間保持する。次に毎分5°で昇温し、250°に到達後、更に毎分10°で昇温し、280°に到達後5分間保持する。

試験溶液注入口温度　250°

検出器　280°で操作する。

ガス流量　キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。ピリメタニルが約11分で流出する流速に調整する。空気及び水素の流量を至適条件に調整する。

b　定量試験

a　定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき、ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

c　確認試験

a　定性試験と同様の操作条件でガスクロマトグラフィー・質量分析を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。また、必要に応じ、ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

7．定量限界

0.01mg／kg

8．留意事項

なし

9．参考文献

なし

10．類型

A

ピルリマイシン試験法(畜水産物)

1．分析対象化合物

ピルリマイシン(肝臓については、ピルリマイシン及びピルリマイシンスルホキシド)

2．装置

液体クロマトグラフ・質量分析計(LC／MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

塩酸ピルリマイシン一水和物標準品　本品は塩酸ピルリマイシン一水和物97％以上を含み、融点は210.5～212.5℃である。

ジビニルベンゼン―N―ビニルピロリドン共重合体ミニカラム(60mg)　内径12～13mmのポリエチレン製のカラム管にジビニルベンゼン―N―ビニルピロリドン共重合体60mgを充填したもの又はこれと同等の分離特性を有するものを用いる。

4．試験溶液の調製

1)　筋肉の場合

(1)　抽出

可能な限り脂肪層を除き、細切均一化した後、その5.00gを量り採る。

これにメタノール及び0.2％メタリン酸溶液の混液(3：7)100mLを加え、細砕した後、ケイソウ土を2～3mmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にメタノール及び0.2％メタリン酸溶液の混液(3：7)20mLを加え、かき混ぜた後、上記と同様に操作して、ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ、40℃以下で30mLに濃縮する。

(2)　精製

ジビニルベンゼン―N―ビニルピロリドン共重合体ミニカラム(60mg)に、メタノール5mL及び水5mLを順次注入し、流出液は捨てる。このカラムに(1)抽出法で得られた溶液を注入した後、水5mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムにメタノール5mLを注入し、溶出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り、40℃以下でメタノールを除去する。この残留物にアセトニトリル及び0.05％トリフルオロ酢酸の混液(1：3)1.0mLを加えて溶かし、これを試験溶液とする。

2)　脂肪の場合

(1)　抽出

可能な限り筋肉層を除き、細切均一化した後、その5.00gを量り採る。

これにn―ヘキサン30mL及び0.2％メタリン酸溶液70mLを加え、細砕した後、毎分3,000回転で5分間遠心分離する。0.2％メタリン酸溶液層を採り、ケイソウ土を2～3mmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にメタノール及び0.2％メタリン酸溶液の混液(3：7)20mLを加え、かき混ぜた後、上記と同様に操作して、ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ、40℃以下で30mLに濃縮する。

(2)　精製

1)筋肉の場合の(2)精製を準用する。

3)　肝臓、腎臓、乳及びその他の食用部分の場合

(1)　抽出

肝臓の場合は、細切均一化した後、その5.00gを量り採り、37℃で24時間放置する。

腎臓及びその他の食用部分の場合は、細切均一化した後、その5.00gを量り採る。

乳の場合は、5.00gを量り採る。

これにメタノール及び0.2％メタリン酸溶液の混液(3：7)100mLを加え、細砕した後、ケイソウ土3gを加えて混和し、ケイソウ土を2～3mmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にメタノール及び0.2％メタリン酸溶液の混液(3：7)20mLを加え、かき混ぜた後、上記と同様に操作して、ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ、40℃以下で約30mLに濃縮する。

(2)　精製

1)　筋肉の場合の(2)　精製を準用する。

5．検量線の作成

塩酸ピルリマイシン一水和物標準品の10mg(ピルリマイシンとして)／100mLメタノール溶液を、アセトニトリル及び0.05％トリフルオロ酢酸の混液で希釈して0.05～10mg(ピルリマイシンとして)／Lの範囲内で数点調製し、それぞれLC／MSに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

6．定量

試験溶液をLC／MSに注入し、5．の検量線でピルリマイシンの含量を求める。

7．測定条件　LC／MS

カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径2～5mm)、内径2.0～6.0mm、長さ100～250mmのステンレス管を用いる。

カラム温度：40℃

移動相：アセトニトリル及び0.05％トリフルオロ酢酸の混液(1：3)

主なイオン(m／z)：ESI＋において411

保持時間の目安：4～6分

8．定量限界

0.01mg／kg

9．留意事項

1)　試験法の概要

肝臓の場合は、代謝物であるピルリマイシンスルホキシドをピルリマイシンに変化させるために、37℃で24時間放置する。

ピルリマイシンを試料からメタノール及び0.2％メタリン酸溶液の混液で抽出し、ジビニルベンゼン―N―ビニルピロリドン共重合体ミニカラムで精製した後、LC／MSで測定及び確認する方法である。

2)　注意点

(1)　LC／MSにおける標準溶液及び試験溶液の標準的な注入量は、内径3.0mmのカラムにおいて10mLである。カラム及び装置により最適な注入量が異なる場合があるので、必要に応じて最適注入量を検討すること。

(2)　主なイオンは用いる装置により、最適なイオン化方法、生成するイオンが異なる場合があるので、装置ごとに最適条件を検討すること。

主なイオンの他に確認できるイオンとして、ESI＋においては363(m／z)がある。

10．参考文献

なし

11．類型

C

ファモキサドン試験法(農産物)

1．分析対象化合物

ファモキサドン

2．装置

紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ(HPLC(UV))

液体クロマトグラフ・質量分析計(LC／MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

アセトニトリル　高速液体クロマトグラフ用に製造されたもの