添付一覧
検出器：FTD又はNPD
カラム：5％フェニル―メチルシリコン、内径0.25mm、長さ30m、膜厚0.25μm
カラム温度：100℃(1分)―30℃／分―300℃(10分)
注入口温度：250℃、検出器温度：280℃
キャリヤーガス：ヘリウム
保持時間の目安：約11分
2) GC／MS
カラム：5％フェニル―メチルシリコン、内径0.25mm、長さ30m、膜厚0.25μm
カラム温度：80℃(1分)―20℃／分―300℃(10分)
注入口温度：240℃
キャリヤーガス：ヘリウム
イオン化モード(電圧)：EI(70eV)
主なイオン(m／z)：383、197
注入量：2μL
保持時間の目安：約15分
8．定量限界
0.01mg／kg
9．留意事項
1) 試験法の概要
トルフェンピラドを試料からアセトンで抽出し、n―ヘキサンに転溶する。活性炭ミニカラム及び合成ケイ酸マグネシウムカラムで精製した後、GC(FTD)又はGC(NPD)で測定し、GC／MSで確認する方法である。
2) 注意点
(1) 精製が不十分な場合はアセトニトリル／ヘキサン分配［n―ヘキサン30mLに溶解し、n―ヘキサン飽和アセトニトリル30mLで2回抽出］やシリカゲルミニカラム(690mg)［エーテル／n―ヘキサン(1：9)5mLで負荷、同混液5mLで洗浄、エーテル／n―ヘキサン(3：7)20mLで溶出］による精製を追加するとよい。
(2) トルフェンピラドの感度が試料の注入の前後で大幅に変動する場合がある。試料を数本注入し、感度を十分に安定させてから標準溶液を注入する等の措置が必要である。
10．参考文献
1) 平成13年厚生労働省告示第56号「アラクロール、イソプロカルブ、クレソキシムメチル、ジエトフェンカルブ、テニルクロール、テブフェンピラド、パクロブトラゾール、ビテルタノール、ピリプロキシフェン、ピリミノバックメチル、フェナリモル、ブタクロール、フルトラニル、プレチラクロール、メトラクロール、メフェナセット、メプロニル及びレナシル試験法」
2) 平成14年厚生労働省告示第94号「カフェンストロール、ジフェノコナゾール、シプロコナゾール、シメトリン、チフルザミド、テトラコナゾール、テブコナゾール、トリアジメノール、フルジオキソニル、プロピコナゾール、ヘキサコナゾール及びペンコナゾール試験法」
11．類型
C
1―ナフタレン酢酸試験法(農産物)
1．分析対象化合物
1―ナフタレン酢酸(抱合体を含む)
2．装置
液体クロマトグラフ・タンデム型質量分析計(LC―MS／MS)
3．試薬、試液
次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。
1―ナフタレン酢酸標準品 本品は1―ナフタレン酢酸95％以上を含む。
4．試験溶液の調製
1)抽出
① 穀類、豆類及び種実類の場合
試料10.0gに水20mLを加え、30分間放置する。これに1mol／L塩酸5mL及びアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトン50mLを加えてホモジナイズした後、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、アセトンで正確に200mLとする。この20mLを採り、40℃以下で約3mLまで濃縮した後、水を加えて約10mLとする。
② 果実及び野菜の場合
試料20.0gに1mol／L塩酸5mL及びアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトン50mLを加えてホモジナイズした後、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、アセトンで正確に200mLとする。この10mLを採り、40℃以下で約1mLまで濃縮した後、水を加えて約10mLとする。
③ 茶の場合
試料5.00gに水20mLを加え、30分間放置する。これに1mol／L塩酸5mL及びアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトン50mLを加えてホモジナイズした後、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、アセトンで正確に200mLとする。この40mLを採り、40℃以下で約6mLまで濃縮した後、水を加えて約10mLとする。
2)加水分解
1)で得られた溶液に3mol／L塩酸5mL及びアセトン5mLを加え、80℃で18時間放置する。反応液に10w／v％塩化ナトリウム溶液100mLを加え、ジエチルエーテル50mLで2回振とう抽出する。ジエチルエーテル層を合わせ、2w／v％リン酸水素二カリウム溶液50mLで2回振とう抽出する。水層を合わせ、3mol／L塩酸でpH2以下に調整した後、ジエチルエーテル50mLで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。茶以外の場合は、この残留物にアセトン及びn―ヘキサン(3：17)混液5mLを加えて溶かす。茶の場合は、この残留物にアセトン5mLを加えて溶かす。
3)精製
① 茶以外の場合
シリカゲルミニカラム(690mg)にアセトン及びn―ヘキサン各5mLを順次注入し、流出液は捨てる。このカラムに2)で得られた溶液を注入した後、アセトン及びn―ヘキサン(3：17)混液5mLを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトン、酢酸及びn―ヘキサン(5：1：95)混液20mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物を2mmol／L酢酸アンモニウム溶液及びメタノール(7：3)混液に溶解し、正確に2mLとしたものを試験溶液とする。
② 茶の場合
a)グラファイトカーボンカラムクロマトグラフィー
グラファイトカーボンミニカラム(250mg)にアセトン5mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに2)で得られた溶液を注入した後、アセトン25mLを注入し、全溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン及びn―ヘキサン(3：17)混液5mLを加えて溶かす。
b)シリカゲルカラムクロマトグラフィー
シリカゲルミニカラム(690mg)にアセトン及びn―ヘキサン各5mLを順次注入し、流出液は捨てる。このカラムにa)で得られた溶液を注入した後、アセトン及びn―ヘキサン(3：17)混液5mLを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトン、酢酸及びn―ヘキサン(5：1：95)混液20mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物を2mmol／L酢酸アンモニウム溶液及びメタノール(7：3)混液に溶解し、正確に2mLとしたものを試験溶液とする。
5．検量線の作成
1―ナフタレン酢酸標準品の2mmol／L酢酸アンモニウム溶液及びメタノール(7：3)混液の溶液を数点調製し、それぞれLC―MS／MSに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。なお、本法に従って試験溶液を調製した場合、試料中0.01mg／kgに相当する試験溶液中濃度は0.005mg／Lである。
6．定量
試験溶液をLC―MS／MSに注入し、5の検量線で1―ナフタレン酢酸の含量を求める。
7．確認試験
LC―MS／MSにより確認する。
8．測定条件
(例)
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル 内径2.0mm、長さ150mm、粒子径5μm
カラム温度：40℃
移動相：2mmol／L酢酸アンモニウム溶液及びメタノール混液(7：3)で16分間保持した後、(3：7)までの濃度勾配を0.1分間で行い、4分間保持する。
イオン化モード：ESI(－)
主なイオン(m／z)：プリカーサーイオン185、プロダクトイオン141
注入量：10μL
保持時間の目安：13分
9．定量限界
0.01mg／kg
10．留意事項
1)試験法の概要
1―ナフタレン酢酸(抱合体を含む)を試料から塩酸酸性下でアセトンで抽出する。抱合体を塩酸酸性下で加水分解した後、ジエチルエーテルに転溶する。転溶した溶液からリン酸水素二カリウム溶液に転溶した後、これを再び塩酸酸性下でジエチルエーテルに転溶する。茶以外はそのまま、茶はグラファイトカーボンミニカラムで精製後、いずれもシリカゲルミニカラムで精製し、LC―MS／MSで定量及び確認する方法である。
2)注意点
① 加水分解は密栓して行う。
② LC―MS／MS測定で、連続注入する際に、直前に注入した試料からの妨害ピークの影響で測定が困難な場合はカラム洗浄してから測定すると良い。
③ 1―ナフタレン酢酸のLC―MS／MS測定で、試験法開発時には測定条件に示したイオン以外に有効な測定イオンが見いだせなかったため、必要に応じて以下の条件を確認に用いると良い。
カラム：フェニルシリル化シリカゲル 内径2.1mm、長さ150mm、粒子径5μm
カラム温度：40℃
移動相：2mmol／L酢酸アンモニウム溶液及びアセトニトリル混液(9：1)で5分間保持した後、(1：1)までの濃度勾配を10分間で行い、(1：1)で4分間保持する。
イオン化モード：ESI(－)
主なイオン(m／z)：プリカーサーイオン185、プロダクトイオン141
保持時間の目安：10分
11．参考文献
1―ナフタレン酢酸ナトリウム農薬抄録
12．類型
C
鉛試験法(農産物)
この試験に用いるすべてのガラス器具は，ホウケイ酸ガラス製のもの又はメチルシラザン処理(器具の内壁をトリメチルクロルシラン，ピリジン及びヘキサメチルジシラザンの混液(1：5：3)で湿らせ，10分後水洗し，乾燥する。)を施したものとする。また，この試験には鉛をできるだけ除いた水及び試液を用いる。
1．試薬・試液
次に示すもの以外は，総則の3に示すものを用いる。
アンモニア・シアン化カリウム・亜硫酸ナトリウム溶液 アンモニア水392mlにシアン化カリウム溶液30ml及び水を加えて1,000mlとした後，亜硫酸ナトリウム1.5gを加えて溶かす。
塩酸ヒドロキシルアミン溶液 塩酸ヒドロキシルアミン20gを水に溶かして約65mlとし，分液漏斗に入れ，チモールブルー試液2～3滴を加え，液が黄色を呈するまでアンモニア水を加える。次に4％ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム溶液10mlを加え，よく振り混ぜた後，静置し，クロロホルム10～15mlずつで抽出する。終点は，抽出液5mlに硫酸銅溶液(1→100)5滴を加えて振り混ぜるとき黄色を呈しなくなつた点とする。次いでこの抽出後の水溶液に液が赤色になるまで希塩酸を加え，更にクロロホルム15mlを加え，振り混ぜた後，静置し，水層を分取し，これに水を加えて100mlとする。
灰化補助液 硝酸マグネシウムを飽和するまで水に溶かす。
クエン酸アンモニウム溶液 クエン酸アンモニウム250gを水に溶かして500mlとし，アンモニア水を滴下してpH9に調整する。次いで鉛を除くために，これに適量の抽出用ジチゾン・四塩化炭素溶液を加え，このジチゾン・四塩化炭素溶液が固有の緑色を保つようになるまで抽出を繰り返す。液中に残存するジチゾンをクロロホルムで，次いで四塩化炭素で除く。
シアン化カリウム溶液 シアン化カリウム50gを水に溶かして100mlとする。次いで鉛を除くために，これに適量の抽出用ジチゾン・四塩化炭素を加え，このジチゾン・四塩化炭素溶液が固有の緑色を保つようになるまで抽出を繰り返す。液中に残存するジチゾンをクロロホルムで，次いで四塩化炭素で除いた後，水を加えて500mlとする。
抽出用ジチゾン・四塩化炭素溶液 ジチゾン40～50mgを四塩化炭素に溶かして1,000mlとする。
必要があれば，次の方法で調製する。
ジチゾン0.1gをクロロホルム100mlに溶かして分液漏斗に採り，これにアンモニア水の溶液(1→100)100mlを加え，振り混ぜた後，静置し，アンモニア抽出液を採る。このアンモニア水による抽出を2～3回繰り返し，アンモニア抽出液を合わせ，これを四塩化炭素少量で数回洗つた後，塩酸(1→2)を加えてわずかに酸性とする。これに四塩化炭素200mlを加え，振り混ぜた後，静置し，四塩化炭素抽出液を採る。この四塩化炭素による抽出を2～3回繰り返し，四塩化炭素抽出液を合わせ，水50mlを用いて洗つた後，適量の四塩化炭素を加え，1,000ml中ジチゾン40～50mgを含むように調整する。
抽出用ジチゾン・四塩化炭素溶液を四塩化炭素で10倍に薄めたもののジチゾン濃度は，この液を液層の厚さ1cmのセルに入れ，四塩化炭素を対照液として，波長620nmにおいて測定した吸光度をAとするとき，次式によって表される。
濃度(mg／l)≒(77±3)×A
この液は冷暗所に保存し，用時必要量を採り，その約1／2容量の1％硝酸を加え，振り混ぜた後，静置し，水層を除いて用いる。
定量用ジチゾン・四塩化炭素溶液 抽出用ジチゾン・四塩化炭素溶液を四塩化炭素で薄めてジチゾン10mg／lの濃度とする。
2．試験溶液の調製
a 灰化
検体20.0g(なつみかんの外果皮，日本なし，りんご及びほうれんそうの場合は，10.0g)を白金製又は透明石英製の蒸発皿又はビーカーに量り採り，赤外線ランプで十分に乾燥する。次いでこれを電気炉に入れ，徐々に温度を上げ，500～550°で灰化する。灰化が十分でないときは，冷後灰化補助液1～2mlを加え，乾燥後，再び500～550°で灰化する。冷後少量の水で湿らせ，次いで塩酸2mlを注意して加え，水浴上で加熱して溶かし，これを試験溶液とする。
不溶物が残るときは，加熱して乾固し，冷後再び塩酸2mlを加え，加温して溶かす。さらに，不溶物が残るときは，水を加えて4～5倍容量に薄め，ガラスろ過器でろ過する。この残留物を50％クエン酸及び熱塩酸の混液(1：1)0.5～1ml，次いで熱40％酢酸アンモニウム溶液0.5～1mlで洗い，両洗液をろ液に合わせる。残留物が多量の場合は，これを白金皿に移し，フッ化水素酸5mlを加え，蒸発乾固し，冷後塩酸及び水数滴を加えて溶かし，これをろ液に合わせる。
b 抽出法
a 灰化で得られた溶液に水20mlを加え，分液漏斗に移し，塩酸ヒドロキシルアミン溶液2ml，クエン酸アンモニウム溶液10ml及びチモールブルー試液2滴を加え，黄色を呈するまでアンモニア水を滴下した後，シアン化カリウム溶液5mlを加え，アンモニア水の溶液(1→3)を滴下してpH9.0～9.5(青緑～青色)に調整する。必要があればpH試験紙を用いてpHを調べる。この液に抽出用ジチゾン・四塩化炭素溶液5mlを加え，30秒間振り混ぜた後，静置し，ジチゾン・四塩化炭素抽出液を第2の分液漏斗に採る。第2の分液漏斗に1％硝酸10mlを加え，30秒間振り混ぜた後，静置し，ジチゾン・四塩化炭素抽出液を第3の分液漏斗に採り，これに1％硝酸8mlを加え，30秒間振り混ぜた後，静置し，ジチゾン・四塩化炭素抽出液を除く。第2及び第3の分液漏斗の硝酸抽出液を20mlのメスフラスコに移し，1％硝酸を標線まで加える。
3．定量試験
2．試験溶液の調製のb 抽出法で得られた硝酸抽出液10mlを分液漏斗に採り，アンモニア・シアン化カリウム・亜硫酸ナトリウム溶液10ml及び四塩化炭素2mlを加え，振り混ぜた後，静置し，四塩化炭素層をできるだけ完全に除く。これに定量用ジチゾン・四塩化炭素溶液10mlを加え，30秒間振り混ぜる。分液漏斗の脚部及び活栓の内部の水分をろ紙片で除き，脱脂綿を脚部に挿入してジチゾン・四塩化炭素抽出液を流出させ，液層の厚さ1cmのセルに入れ，四塩化炭素を対照液として，波長520nmにおける吸光度を測定し，4．の検量線によつて鉛の含量を求める。
鉛の含量が30μgを超えるときは，硝酸抽出液に適量の1％硝酸を加え，その10mlを用いて，再び上記の操作を行い鉛の含量を求める。
4．検量線の作製
鉛標準液0.5，1.0，2.0及び3.0mlを別々に量り採り，それぞれに1％硝酸を加えて10mlとし，別に1％硝酸10mlを採る。これらを3．定量試験と同様に操作して検量線を作製する。
5．定量限界
(記載無し)
6．留意事項
分析対象化合物は、無機鉛である。
7．参考文献
なし
8．類型
A
ニコチン試験法(農産物)
1．分析対象化合物
ニコチン
2．装置
ガスクロマトグラフ・質量分析計(GC／MS)
3．試薬、試液
次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。
酢酸ブチル 酢酸ブチル(特級)
ニコチン標準品 本品はニコチン99％以上を含む。
［2H3］メチルニコチン標準品 本品は［2H3］メチルニコチン98％以上を含む。
4．試験溶液の調製
試料3～5gを正確に量り採り、内標準物質として［2H3］メチルニコチン82ngを添加し、よく混和する。これに、アンモニア水1mLを加えて、pH12に調整し、トルエン3mLを加え、15時間振とう抽出する。4,200回転で遠心分離し、トルエン層2mLを採る。これに0.05mol／L塩酸1mLを加え、1分間激しく混合し、水層0.7～0.8mLを採り、これに5mol／L水酸化ナトリウム溶液3滴及びトルエン0.5mLを加え、1分間激しく混合する。トルエン層を採り、これを試験溶液とする。
5．検量線の作成
ニコチン標準品及び［2H3］メチルニコチンを0.01％トリエチルアミン含有酢酸ブチルに溶解し、それぞれ100mg／L溶液を調製する。これらの溶液を混合し、0.01％トリエチルアミン含有酢酸エチルで希釈して、ニコチン12～240ng／mL(［2H3］メチルニコチン各82ng／mL含有)溶液を数点調製する。標準原液は暗所に冷凍保存し、使用の直前に希釈する。それぞれ2μLをGC／MSに注入し、ニコチンと［2H3］メチルニコチンのピーク高比又はピーク面積比を求め、検量線を作成する。
6．定量
試験溶液2μLをGC／MSに注入し、5の検量線でニコチンの含量を求める。
7．確認試験
GC／MSにより確認する。
8．測定条件
GC／MS
カラム：5％フェニル―メチルシリコン、内径0.25mm、長さ30m、膜厚0.25μm
カラム温度：70℃(1分)―25℃／分―280℃(3分)
注入口温度：235℃
検出器温度：280℃
イオン化モード(電圧)：EI(70eV)
主なイオン(m／z)：ニコチン162、133、84、［2H3］メチルニコチン165、136、87
保持時間の目安：6分(ニコチン及び［2H3］メチルニコチンの保持時間はほぼ同じ)
9．定量限界
0.01mg／kg
10．留意事項
1) 試験法の概要
内標準物質として［2H3］メチルニコチンを添加した試料から、塩基性条件下でニコチンをトルエンで抽出し、酸性条件下で水に転溶する。再度塩基性条件下でトルエンに転溶し、GC／MSで測定及び確認する方法である。
2) 注意点
(1) 遠心分離を行ってもトルエン層が分離しにくい場合は、塩化ナトリウムを少量加えて混ぜ、再度遠心分離する。
(2) 夾雑物が少ない試料では、遠心分離後の液々分配による精製を省略することができる。
(3) 液々分配において、水層の分離が悪い場合は、遠心分離を行うとよい。
(4) 不活性化処理したライナーに、不活性化処理したガラスウールを詰めて使用する。ライナーを交換した後は、120ng／mLのニコチンと82ng／mLの内標準を含む標準溶液を10～15回注入することにより装置を安定化させる必要がある。
(5) 環境中のニコチンによる試薬や装置の汚染の可能性があるので、事前に確認する必要がある。
11．参考文献
なし
12．類型
D(Siegmund,B.,et.al.,Development of a simple sample preparation technique for gaschromatographic-mass spectrometric determination of nicotine in edible nightshades(Solanaceae),Journal of Chromatography A，840，249―260，1999)
ニテンピラム試験法(農産物)
1．分析対象化合物
ニテンピラム、CPMA〔2―［N―(6―クロロ―3―ピリジルメチル)―N―エチル］アミノ―2―メチルイミノ酢酸〕、CPMF〔N―(6―クロロ―3―ピリジルメチル)―N―エチル―N’―メチルホルムアミジン〕
2．装置
紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ，アルカリ熱イオン化検出器又は高感度窒素・リン検出器付きガスクロマトグラフ及びガスクロマトグラフ・質量分析計を用いる。
3．試薬、試液
次に示すもの以外は，総則の3に示すものを用いる。
スチレンジビニルベンゼン共重合体吸着剤 スチレンジビニルベンゼン共重合体(無極性，粒径250～600μm，平均孔径30nm)をアセトンを用いて十分洗い，アセトン中に保存する。
4．標準品
ニテンピラム 本品はニテンピラム99％以上を含む。
融点 本品の融点は83゜である。
N―(6―クロロ―3―ピリジルメチル)―N―エチルホルムアミド(以下「CPF」という。) 本品はCPF97％以上を含む。
5．試験溶液の調製
a ニテンピラム試験溶液
(1) 抽出法
イ 穀類の場合
検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後，その10.0gを量り採り，水20mlを加え，2時間放置する。
これにアセトン100mlを加え，3分間細砕した後，ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り，アセトン50mlを加え，3分間細砕した後，上記と同様に操作して，ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ，40゜以下で約20mlに濃縮する。
これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液100mlを入れた300mlの分液漏斗に移す。ジクロロメタン100mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い，洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，ジクロロメタン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にジクロロメタン50mlを加え，上記と同様に操作して，ジクロロメタン層を上記の三角フラスコに合わせる操作を2回繰り返す。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置する。
ロ 果実及び野菜の場合
検体約1kgを細切均一化した後，その20.0gを量り採る。
これにアセトン100mlを加え，3分間細砕した後，ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り，アセトン50mlを加え，3分間細砕した後，上記と同様に操作して，ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ，40゜以下で約20mlに濃縮する。
多孔性ケイソウ土カラム(20ml保持用)に上記の減圧濃縮器中の溶液を注入し，15分間放置した後，n―ヘキサン50mlを注入し，流出液は捨てる。エーテル及びn―ヘキサンの混液(1：1)50mlを注入し，流出液は捨てる。次いでジクロロメタン50mlを注入し，流出液を100mlの三角フラスコ中に採る。
ハ 抹茶の場合
検体5.00gを量り採り，0.05mol／l塩酸100mlを加え，2時間放置した後，振とう機を用いて30分間激しく振り混ぜる。これにケイソウ土10gを加えて振り混ぜた後，ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いて300mlの三角フラスコ中に吸引ろ過する。0.05mol／l塩酸50mlを用いてろ紙上の残留物を洗い，洗液を上記の三角フラスコ中に合わせ，0.05mol／l塩酸を加えて200mlとする。
内径15mm，長さ300mmのクロマトグラフ管に，スチレンジビニルベンゼン共重合体吸着剤20mlをアセトンに懸濁したものを入れ，カラムの上端に少量のアセトンが残る程度までアセトンを流出させる。このカラムにアセトン50mlを注入し，流出液は捨てる。水200mlを注入し，流出液は捨てる。次いで上記の溶液を注入し，毎分約5mlの流速で流出させ，流出液は捨てる。0.05mol／l塩酸50mlを注入し，流出液は捨てる。水50mlを注入し，毎分約5mlの流速で流出させ，流出液は捨てる。次いでアセトン100mlを注入し，毎分約5mlの流速で流出させ，流出液を100mlの三角フラスコ中に採る。
ベンゼンスルホニルプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(500mg)の上部に脱脂綿を挿入した後，アセトン5mlを注入し，流出液は捨てる。このカラムに上記の溶液を注入し，毎分約3mlの流速で流出させ，流出液は捨てる。水20mlを注入し，流出液は捨てる。次いで0.5mol／lアンモニア水10mlを注入し，流出液を50mlの三角フラスコ中に採り，酢酸0.3mlを加える。
多孔性ケイソウ土カラム(20ml保持用)に上記の溶液を注入し，15分間放置した後，n―ヘキサン50mlを注入し，流出液は捨てる。エ―テル及びn―ヘキサンの混液(1：1)50mlを注入し，流出液は捨てる。次いでジクロロメタン50mlを注入し，流出液を100mlの三角フラスコ中に採る。
ニ 抹茶以外の茶の場合
検体9.00gを100゜の水540mlに浸し，室温で5分間放置した後，ろ過し，冷後ろ液360mlを500mlの三角フラスコに移し，2mol／l塩酸8mlを加える。
内径15mm，長さ300mmのクロマトグラフ管に，スチレンジビニルベンゼン共重合体吸着剤20mlをアセトンに懸濁したものを入れ，カラムの上端に少量のアセトンが残る程度までアセトンを流出させる。このカラムにアセトン50mlを注入し，流出液は捨てる。水200mlを注入し，流出液は捨てる。次いで上記の溶液を注入し，毎分約5mlの流速で流出させ，流出液は捨てる。0.05mol／l塩酸50mlを注入し，流出液は捨てる。水50mlを注入し，毎分約5mlの流速で流出させ，流出液は捨てる。次いでアセトン100mlを注入し，毎分約5mlの流速で流出させ，流出液を100mlの三角フラスコ中に採る。
ベンゼンスルホニルプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(500mg)の上部に脱脂綿を挿入した後，アセトン5mlを注入し，流出液は捨てる。このカラムに上記の溶液を注入し，毎分約3mlの流速で流出させ，流出液は捨てる。水20mlを注入し，流出液は捨てる。次いで0.5mol／lアンモニア水10mlを注入し，流出液を50mlの三角フラスコ中に採り，酢酸0.3mlを加える。
多孔性ケイソウ土カラム(20ml保持用)に上記の溶液を注入し，15分間放置した後，n―ヘキサン50mlを注入し，流出液は捨てる。エーテル及びn―ヘキサンの混液(1：1)50mlを注入し，流出液は捨てる。次いでジクロロメタン50mlを注入し，流出液を100mlの三角フラスコ中に採る。
(2) 精製法
内径15mm，長さ300mmのクロマトグラフ管に，カラムクロマトグラフィー用シリカゲル(粒径63～200μm)10gをジクロロメタンに懸濁したもの，次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ，カラムの上端に少量のジクロロメタンが残る程度までジクロロメタンを流出させる。このカラムに(1) 抽出法で得られた溶液を注入した後，アセトン及びジクロロメタンの混液(1：1)50mlを注入し，流出液は捨てる。次いでアセトン50mlを注入し，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40゜以下でアセトンを除去する。この残留物にメタノール及び0.05mol／lリン酸二水素カリウム溶液の混液(3：17)を加えて溶かし，正確に5mlとして，これを試験溶液とする。
b 2―［N―(6―クロロ―3―ピリジルメチル)―N―エチル］アミノ―2―メチルイミノ酢酸(以下「CPMA」という。)及びN―(6―クロロ―3―ピリジルメチル)―N―エチル―N′―メチルホルムアミジン(以下「CPMF」という。)試験溶液
(1) 抽出法
イ 穀類の場合
検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後，その10.0gを量り採り，水20mlを加え，2時間放置する。
これにアセトン100mlを加え，3分間細砕した後，ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り，アセトン50mlを加え，3分間細砕した後，上記と同様に操作して，ろ液をその減圧濃縮器中に合わせる。これを50゜の水浴中で90分間加温した後，40゜以下で約10mlに濃縮する。これにトリエチルアミン0.2mlを加え，50゜の水浴中で30分間加温する。
これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液100mlを入れた300mlの分液漏斗に移す。エーテル100mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い，洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，エーテル層を300mlの三角フラスコに移す。水層にエーテル50mlを加え，上記と同様に操作して，エーテル層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置する。
ロ 果実及び野菜の場合
検体約1kgを精密に量り，必要に応じ適量の水を量つて加え，細切均一化した後，検体20.0gに相当する量を量り採る。
これにアセトン100mlを加え，3分間細砕した後，ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り，アセトン50mlを加え，3分間細砕した後，上記と同様に操作して，ろ液をその減圧濃縮器中に合わせる。これを50゜の水浴中で90分間加温した後，40゜以下で約10mlに濃縮する。これにトリエチルアミン0.2mlを加え，50゜の水浴中で30分間加温する。
多孔性ケイソウ土カラム(20ml保持用)に上記の溶液を注入し，15分間放置した後，n―ヘキサン50mlを注入し，流出液は捨てる。次いでエーテル50mlを注入し，流出液を100mlの三角フラスコ中に採る。
ハ 抹茶の場合
検体5.00gを量り採り，0.05mol／l塩酸100mlを加え，2時間放置する。振とう機を用いて30分間激しく振り混ぜる。これにケイソウ土10gを加えて振り混ぜた後，ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いて300mlの三角フラスコ中に吸引ろ過する。0.05mol／l塩酸50mlを用いてろ紙上の残留物を洗い，洗液を上記の三角フラスコ中に合わせ，0.05mol／l塩酸を加えて200mlとする。
内径15mm，長さ300mmのクロマトグラフ管に，スチレンジビニルベンゼン共重合体吸着剤20mlをアセトンに懸濁したものを入れ，カラムの上端に少量のアセトンが残る程度までアセトンを流出させる。このカラムにアセトン50mlを注入し，流出液は捨てる。水200mlを注入し，流出液は捨てる。次いで上記の溶液を注入し，毎分約5mlの流速で流出させ，流出液は捨てる。0.05mol／l塩酸50mlを注入し，流出液は捨てる。水50mlを注入し，毎分約5mlの流速で流出させ，流出液は捨てる。次いでアセトン100mlを注入し，毎分約5mlの流速で流出させ，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採る。これを50゜の水浴中で90分間加温した後，40゜以下で約10mlに濃縮する。これにトリエチルアミン0.2mlを加え，50゜の水浴中で30分間加温する。
多孔性ケイソウ土カラム(20ml保持用)に上記の溶液を注入し，15分間放置した後，n―ヘキサン50mlを注入し，流出液は捨てる。次いでエーテル50mlを注入し，流出液を100mlの三角フラスコ中に採る。
ニ 抹茶以外の茶の場合
検体9.00gを100゜の水540mlに浸し，室温で5分間放置した後，ろ過し，冷後ろ液360mlを500mlの三角フラスコに移し，2mol／l塩酸8mlを加える。
内径15mm，長さ300mmのクロマトグラフ管に，スチレンジビニルベンゼン共重合体吸着剤20mlをアセトンに懸濁したものを入れ，カラムの上端に少量のアセトンが残る程度までアセトンを流出させる。このカラムにアセトン50mlを注入し，流出液は捨てる。水200mlを注入し，流出液は捨てる。次いで上記の溶液を注入し，毎分約5mlの流速で流出させ，流出液は捨てる。0.05mol／l塩酸50mlを注入し，流出液は捨てる。水50mlを注入し，毎分約5mlの流速で流出させ，流出液は捨てる。次いでアセトン100mlを注入し，毎分約5mlの流速で流出させ，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採る。これを50゜の水浴中で90分間加温した後，40゜以下で約10mlに濃縮する。これにトリエチルアミン0.2mlを加え，50゜の水浴中で30分間加温する。
多孔性ケイソウ土カラム(20ml保持用)に上記の溶液を注入し，15分間放置した後，n―ヘキサン50mlを注入し，流出液は捨てる。次いでエーテル50mlを注入し，流出液を100mlの三角フラスコ中に採る。
(2) 精製法
内径15mm，長さ300mmのクロマトグラフ管に，カラムクロマトグラフィー用シリカゲル(粒径63～200μm)10gをエーテルに懸濁したもの，次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ，カラムの上端に少量のエーテルが残る程度までエーテルを流出させる。このカラムに(1) 抽出法で得られた溶液を注入した後，アセトン及びn―ヘキサンの混液(1：4)50mlを注入し，流出液は捨てる。次いでアセトン50mlを注入し，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40゜以下でアセトンを除去する。この残留物にアセトンを加えて溶かし，正確に5mlとして，これを試験溶液とする。
6．操作法
a 定性試験
(1) ニテンピラムの試験を行う場合
紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフを用いて，次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。
操作条件
カラム充てん剤 オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)を用いる。
クロマトグラフ管 内径4.6mm，長さ150mmのステンレス管を用いる。
カラム温度 40゜
検出器 波長270nmで操作する。
移動相 メタノール及び0.05mol／lリン酸二水素カリウム溶液の混液(3：17)を用いる。ニテンピラムが約9分で流出する流速に調整する。
(2) CPMA及びCPMFの試験を行う場合
アルカリ熱イオン化検出器又は高感度窒素・リン検出器付きガスクロマトグラフを用いて，次の操作条件で試験を行う。試験結果はCPFの標準品と一致しなければならない。
操作条件
カラム 内径0.25mm，長さ30mのケイ酸ガラス製の細管に，ガスクロマトグラフィー用50％フェニル―メチルシリコンを0.25μmの厚さでコーティングしたもの。
カラム温度 50゜で2分間保持し，その後毎分10゜で昇温し，250゜に到達後10分間保持する。
試験溶液注入口温度 270゜
検出器 270゜で操作する。
ガス流量 キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。CPFが約22分で流出する流速に調整する。
空気及び水素の流量を至適条件に調整する。
b 定量試験
a 定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき，ニテンピラム並びにCPMA及びCPMFから誘導されるCPFのそれぞれについてピーク高法又はピーク面積法により定量を行い，ニテンピラム及びCPFの含量を求め，次式により，CPMA及びCPMFを含むニテンピラムの含量を求める。
ニテンピラム(CPMA及びCPMFを含む。)の含量(ppm)＝A＋B×1.36
A：ニテンピラムの含量(ppm)
B：CPFの含量(ppm)
c 確認試験
CPMA及びCPMFの試験溶液について，a 定性試験と同様の操作条件でガスクロマトグラフィー・質量分析を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。また，必要に応じ，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。
7．定量限界
米0.05mg／kg、果実・野菜0.025mg／kg、茶0.1mg／kg
8．留意事項
ニテンピラムは、ニテンピラム並びにその代謝物であるCPMA及びCPMFから誘導されるCPFのそれぞれについて定量を行い、ニテンピラム及びCPFの含量を求め、CPFについてはその含量に係数を乗じてニテンピラムの含量に換算し、これらの和を分析値とすること。
9．参考文献
なし
10．類型
A
ノバルロン試験法(農産物)
1．分析対象化合物
ノバルロン
2．装置
紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ(HPLC(UV))
液体クロマトグラフ・質量分析計(LC／MS)
3．試薬、試液
次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。
メタノール 高速液体クロマトグラフ用に製造されたもの
ノバルロン標準品 本品はノバルロン 99％以上を含み、融点は176～178℃である。
4．試験溶液の調製
1) 抽出
(1) 穀類、豆類及び種実類の場合
試料10.0gを量り採り、水20mLを加え、2時間放置する。
これにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトン50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液にアセトンを加えて正確に200mLとする。この100mLを採り、40℃以下で約15mLまで濃縮する。これに10％塩化ナトリウム溶液100mLを加え、n―ヘキサン100mL及び50mLで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。
この残留物にn―ヘキサン50mLを加え、n―ヘキサン飽和アセトニトリル50mLずつで2回振とう抽出する。抽出液を合わせ、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にn―ヘキサン5mLを加えて溶かす。
(2) 果実及び野菜の場合
試料20.0gにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトン50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液にアセトンを加えて正確に200mLとする。この100mLを採り、40℃以下で約15mLまで濃縮する。これに10％塩化ナトリウム溶液100mLを加え、n―ヘキサン100mL及び50mLで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にn―ヘキサン5mLを加えて溶かす。
2) 精製
(1) 活性炭カラムクロマトグラフィー
活性炭ミニカラム(500mg)にn―ヘキサン10mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに、1)で得られた溶液を注入し、流出液は捨てる。さらに、n―ヘキサン5mLを注入し、流出液は捨てる。次いで、酢酸エチル・n―ヘキサン混液(1：1)20mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物に酢酸エチル・n―ヘキサン混液(1：19)5mLを加えて溶かす。
(2) アミノプロピルシリル化シリカゲルカラムクロマトグラフィー
アミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(360mg)に酢酸エチル・n―ヘキサン混液(1：19)10mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに(1)で得られた溶液を注入し、流出液は捨てる。さらに、酢酸エチル・n―ヘキサン混液(1：19)10mLを注入し、流出液は捨てる。次いで、酢酸エチル・n―ヘキサン混液(1：1)10mlを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物を水・メタノール混液(1：4)に溶解し、正確に2mL(穀類、豆類及び種実類の場合は、1mL)としたものを試験溶液とする。
5．検量線の作成
ノバルロン標準品の0.1～2mg／L水・メタノール混液(1：4)溶液を数点調製し、それぞれ40μLをHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。
6．定量
試験溶液40μLをHPLCに注入し、5の検量線でノバルロンの含量を求める。
7．測定条件
1) HPLC
検出器：UV(波長252nm)
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)、内径4～4.6mm、長さ250mm
カラム温度：40℃
移動相：水・メタノール混液(1：4)
保持時間の目安：8分
2) LC／MS
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)、内径2mm、長さ150mm
移動相：水・メタノール混液(1：4)
イオン化モード：ESI
主なイオン(m／z)：正イオンモード493、515、負イオンモード491
注入量：2μL
保持時間の目安：5分
8．定量限界
0.02mg／kg
9．留意事項
1) 試験法の概要
ノバルロンを試料からアセトンで抽出し、n―ヘキサンに転溶する。果実、野菜はそのまま、穀類、豆類、種実類はアセトニトリル／ヘキサン分配で脱脂した後、活性炭ミニカラム及びアミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラムにより精製した後、HPLC(UV)で測定し、LC／MSで確認する方法である。
2) 注意点
(1) 活性炭ミニカラムにおける溶出挙動は、試料の種類や試料負荷量によって影響を受けやすいので注意を要する。当該カラムは精製の初期段階で使用しているので、保持力の低下を起こしやすく、洗浄画分にノバルロンが溶出される可能性がある。その場合は、n―ヘキサン洗浄を省略して、酢酸エチル・n―ヘキサン混液(1：1)のみで負荷および溶出を行う必要がある。
(2) 精製が不十分な場合は、シリカゲルミニカラム(690mg)［アセトン・n―ヘキサン混液(1：19)10mLで洗浄、アセトン・n―ヘキサン混液(3：7)10mLで溶出］やオクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(1000mg)［アセトニトリル・水混液(1：1)10mLで洗浄、アセトニトリル・水混液(4：1)10mL又はアセトニトリル10mLで溶出］などによる精製を追加するとよい。
10．参考文献
平成13年厚生労働省告示第56号「クロルフルアズロン、ジフルベンズロン、テブフェノジド、テフルベンズロン、フルフェノクスロン、ヘキサフルムロン及びルフェヌロン試験法」
11．類型
C
バミドチオン試験法(農産物)
1．分析対象化合物
バミドチオン、バミドチオンスルホキシド、バミドチオンスルホン
2．装置
電子捕獲型検出器付きガスクロマトグラフを用いる。
3．試薬、試液
次に示すもの以外は，総則の3に示すものを用いる。
緩衝液 リン酸一カリウム13.62gと水酸化ナトリウム2.36gを水に溶かして全量を1,000mlとする(pH7.0)。
バミドチオン標準溶液 バミドチオン50.0mgにアセトンを加えて500mlとし，この10mlを採り，アセトンを加えて100mlとする。
4．標準品
バミドチオン 本品はバミドチオン99％以上を含む。
融点 本品の融点は40°である。
5．試験溶液の調製
a 抽出法
穀類の場合は，検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後，その50.0gを量り採り，水100mlを加え，2時間放置する。
果実及び野菜の場合は，検体約1kgを精密に量り，必要に応じ適量の水を量つて加え，細切均一化した後，検体50.0gに相当する量を量り採る。
これにアセトン及びジクロロメタンの混液(1：1)150ml，ケイソウ土5g及び無水硫酸ナトリウム50gを加え，3分間細砕した後，500mlの三角フラスコにろ過する。ろ液に無水炭酸カリウム15gを加え，密栓し，時々振り混ぜながら15分間放置した後，ろ過する。ろ液にアセトンを加えて正確に200mlとし，その100mlをすり合わせ減圧濃縮器中に移し，30°でアセトン及びジクロロメタンを除去する。この残留物にアセトン2mlを加えて溶かす。
b 酸化
a 抽出法で得られた溶液に0.2％過マンガン酸カリウム溶液20ml及び緩衝液5mlを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，200mlの分液漏斗に移す。これにジクロロメタン50ml及び水20mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，ジクロロメタン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にジクロロメタン50mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，上記と同様の操作を2回繰り返し，ジクロロメタン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでジクロロメタン15mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ，30°でジクロロメタンを除去する。この残留物にアセトンを加えて正確に2mlとした後，よく振り混ぜ，毎分3,000回転で10分間遠心分離を行い，上澄液を試験溶液とする。
6．操作法
a 定性試験
次の操作条件で試験を行う。試験結果はバミドチオン標準溶液について，5．試験溶液の調製のb 酸化と同様に操作して得られたものと一致しなければならない。
操作条件
カラム 内径0.2mm，長さ25mのケイ酸ガラス製の細管に，ガスクロマトグラフィー用メチルシリコンを0.25μmの厚さでコーティングしたもの。
カラム温度 220°
試験溶液注入口温度 270°
検出器 270°で操作する。
注入方式 スプリット(10：1)
ガス流量 キャリヤーガスとして高純度窒素を用いる。バミドチオンスルホンが約13分で流出する流速に調整する。
b 定量試験
a 定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。
7．定量限界
0.02mg／kg
8．留意事項
バミドチオンの分析値には、バミドチオン、バミドチオンスルホキシド及びバミドチオンスルホンが含まれる。
9．参考文献
なし
10．類型
A
バリダマイシン試験法(農産物)
1．分析対象化合物
バリダマイシン
2．装置
液体クロマトグラフ・質量分析計(LC／MS)
3．試薬、試液
次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。
バリダマイシン標準品 本品はバリダマイシン90％以上を含む。
4．試験溶液の調製
1) 抽出
穀類及び豆類の場合は、試料10.0gを量り採り、水20mLを加えて2時間放置する。
果実、野菜及びハーブの場合は、試料20.0gを量り採る。
これに水及びメタノール(1：9)混液100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に水及びメタノール(1：9)混液50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。ろ液を合わせ、40℃以下で約20mLに濃縮する。
2) 精製
(1) スチレンジビニルベンゼン共重合体カラムクロマトグラフィー
スチレンジビニルベンゼン共重合体ミニカラム(500mg)にメタノール5mL及び水5mLを順次注入し、各流出液は捨てる。このカラムに1)で得られた溶液を注入し、さらに水10mLを注入し、溶出液を合わせ、水を加えて正確に200mLとする。
(2) グラファイトカーボンカラムクロマトグラフィー
グラファイトカーボンミニカラム(500mg)にメタノール10mL及び水10mLを順次注入し、各流出液は捨てる。このカラムに(1)で得られた溶液5mLを注入し、流出液は捨てる。さらに、水10mLを注入し、流出液は捨てる。次いで、メタノール20mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物を水に溶解し、正確に5mL(穀類及び豆類の場合は、2.5mL)としたものを試験溶液とする。
5．検量線の作成
バリダマイシン標準品の0.005～0.1mg／L水溶液を数点調製し、それぞれ5μLをLC／MSに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。
6．定量
試験溶液5μLをLC／MSに注入し、5の検量線でバリダマイシンの含量を求める。
7．確認試験
LC／MSにより確認する。
8．測定条件
LC／MS
カラム：トリアコンチルシリル化シリカゲル(粒径5μm)、内径2.0mm、長さ150mm
カラム温度：40℃
移動相：アセトニトリル及び0.01mol／L酢酸アンモニウム溶液(1：99)混液
移動相流速：0.2mL／分
イオン化モード：ESI(＋)
主なイオン(m／z)：498
保持時間の目安：8分
9．定量限界
0.05mg／kg
10．留意事項
1) 試験法の概要
バリダマイシンを試料から含水メタノールで抽出し、スチレンジビニルベンゼン共重合体ミニカラム及びグラファイトカーボンミニカラムで精製した後、LC／MSで測定及び確認する方法である。
2) 注意点
(1) スチレンジビニルベンゼン共重合体カラムクロマトグラフィーの代わりにn―ヘキサンで洗浄する方法がある。その場合は、濃縮液に水を加えて80mLとし、これにn―ヘキサン50mLを加えて、振とう洗浄する。精製効果はカラムクロマトグラフィーと大きな差はない。
(2) グラファイトカーボンカラムクロマトグラフィーでは、試料負荷量を大幅に増やすと、バリダマイシンの溶出率が低下するので、注意が必要である。
(3) バリダマイシンは糖鎖構造を持つ高極性化合物であるため、LCの分離カラムとしてはC18(オクタデシルシリル化シリカゲル)カラムよりもC30(トリアコンチルシリル化シリカゲル)カラムが適している。
(4) LC／MS測定において、バリダマイシン溶出後に妨害成分が溶出されることがある。このような場合は、アセトニトリル及び0.01mol／L酢酸アンモニウム溶液(1：1)混液を通液して洗浄すると良い。
11．参考文献
なし
12．類型
D(未発表資料)
ハロスルフロンメチル試験法(畜水産物)
1．分析対象化合物
ハロスルフロンメチル
2．装置
液体クロマトグラフ・質量分析計(LC―MS)又は液体クロマトグラフ・タンデム型質量分析計(LC―MS／MS)
3．試薬、試液
次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。
ハロスルフロンメチル標準品 本品はハロスルフロンメチル97％以上を含む。
4．試験溶液調製法
1) 抽出
試料10.0g(脂肪の場合は試料5.00g)を量り採り、アセトン及びn―ヘキサン(1：2)混液50mL、0.1mol／L塩酸6mL及び塩化ナトリウム8gを加え、ホモジナイズした後、毎分3,000回転で5分間遠心分離し、上層のアセトン及びn―ヘキサン層を採る。下層のアセトン及び水層にn―ヘキサン50mLを加え、ホモジナイズした後、毎分3,000回転で5分間遠心分離する。上層のアセトン及びn―ヘキサン層を先のアセトン及びn―ヘキサン層に合わせ、正確に100mLとする。この10mL(脂肪の場合は20mL)を採り、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にn―ヘキサン20mLを加え、n―ヘキサン飽和アセトニトリル20mLで振とう抽出する。アセトニトリル層を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン及びn―ヘキサン(3：1)混液5mLを加えて溶解する。
2) 精製
トリメチルアミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(500mg)にアセトン及びメタノール(1：1)混液及びアセトン及びn―ヘキサン(3：1)混液各10mLを順次注入し、流出液は捨てる。このカラムに1)で得られた溶液を注入した後、アセトン及びn―ヘキサン(3：1)混液10mLを注入し、流出液は捨てる。次いで、アセトン及びメタノール(1：1)混液10mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をメタノールに溶解し、正確に5mLとしたものを試験溶液とする。
5．検量線の作成
ハロスルフロンメチル標準品のメタノール溶液を数点調製し、それぞれLC―MS又はLC―MS／MSに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。なお、本法に従って試験溶液を調製した場合、試料中0.01mg／kgに相当する試験溶液中の濃度は0.002mg／Lである。
6．定量
試験溶液をLC―MS又はLC―MS／MSに注入し、5の検量線でハロスルフロンメチルの含量を求める。
7．確認試験
LC―MS又はLC―MS／MSにより確認する。
8．測定条件
(例)
1) LC―MSの場合
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル 内径2.1mm、長さ100mm、粒子径3μm
カラム温度：40℃
移動相：0.01vol％酢酸及び0.01vol％酢酸・メタノール溶液(1：4)混液
イオン化モード：ESI(－)
主なイオン(m／z)：433、254、252
注入量：10μL
保持時間の目安：5分
2) LC―MS／MSの場合
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル 内径2.1mm、長さ100mm、粒子径3μm
カラム温度：40℃
移動相：0.01vol％酢酸及び0.01vol％酢酸・メタノール溶液(17：3)混液で0.5分間保持した後、(1：9)までの濃度勾配を3.5分間で行い、5分間保持する。
イオン化モード：ESI(－)
主なイオン(m／z)：
プリカーサーイオン435、プロダクトイオン254
プリカーサーイオン433、プロダクトイオン252
注入量：2μL
保持時間の目安：8分
9．定量限界
0.01mg／kg
10．留意事項
1) 試験法の概要
ハロスルフロンメチルを試料から塩酸酸性下アセトン及びn―ヘキサン(1：2)混液で抽出し、アセトニトリル／ヘキサン分配で脱脂する。トリメチルアミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラムで精製した後、LC―MS又はLC―MS／MSで定量及び確認する方法である。
2) 注意点
① ハロスルフロンメチルの測定で、試験法開発時に使用したイオンを以下に示す。
LC―MS測定
定量イオン(m／z)：252
定性イオン(m／z)：433、254
LC―MS／MS測定
定量イオン(m／z)：プリカーサーイオン433、プロダクトイオン252
定性イオン(m／z)：プリカーサーイオン435、プロダクトイオン254
② 抽出時に試料に塩酸を先に添加すると、鶏卵及び乳でゲル化することがあるので、アセトン及びn―ヘキサン混液を塩酸よりも先に試料に添加する。
③ はちみつ試料では、脂質をほとんど含有しないことから、アセトニトリル／ヘキサン分配による脱脂操作を省略することが可能である。
11．参考文献
なし
12．類型
C
ビオレスメトリン試験法(農産物)
1．分析対象化合物
ビオレスメトリン
2．装置
ガスクロマトグラフ・質量分析計を用いる。
3．試薬、試液
総則の3に示すものを用いる。
4．標準品
ビオレスメトリン 本品はビオレスメトリン96％以上を含む。
融点 本品の融点は32°である。
5．試験溶液の調製
a 抽出法
(1) 穀類、豆類及び種実類の場合
検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後、その10.0gを量り採り、5％リン酸溶液20mlを加え、2時間放置する。
これにアセトン100mlを加え、3分間細砕した後、ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り、アセトン50mlを加え、3分間細砕した後、上記と同様に操作して、ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下で約30mlに濃縮する。
これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液100mlを入れた300mlの分液漏斗に移す。n―ヘキサン100mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い、洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、n―ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にn―ヘキサン50mlを加え、上記と同様に操作して、n―ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn―ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下でn―ヘキサンを除去する。
この残留物にn―ヘキサン30mlを加え、100mlの分液漏斗に移す。これにn―ヘキサン飽和アセトニトリル30mlを加え、振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、アセトニトリル層をすり合わせ減圧濃縮器中に移す。n―ヘキサン層にn―ヘキサン飽和アセトニトリル30mlを加え、上記と同様の操作を2回繰り返し、アセトニトリル層をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下でアセトニトリルを除去する。この残留物にn―ヘキサン2mlを加えて溶かす。
(2) 果実、野菜、茶及びホップの場合
果実及び野菜の場合は、検体約1kgを精密に量り、必要に応じ適量の水を量つて加え、細切均一化した後、検体20.0gに相当する量を量り採る。
茶及びホップの場合は、検体を粉砕した後、その5.00gを量り採り、水20mlを加え、2時間放置する。
これにアセトン100mlを加え、3分間細砕した後、ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り、アセトン50mlを加え、3分間細砕した後、上記と同様に操作して、ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下で約30mlに濃縮する。
これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液100mlを入れた300mlの分液漏斗に移す。n―ヘキサン100mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い、洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、n―ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にn―ヘキサン50mlを加え、上記と同様に操作して、n―ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn―ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40゜以下でn―ヘキサンを除去する。この残留物にn―ヘキサン2mlを加えて溶かす。
b 精製法
内径15mm、長さ300mmのクロマトグラフ管に、カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム5gをn―ヘキサンに懸濁したもの、次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ、カラムの上端に少量のn―ヘキサンが残る程度までn―ヘキサンを流出させる。このカラムにa 抽出法で得られた溶液を注入した後、n―ヘキサン100mlを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトン及びn―ヘキサンの混液(1：49)100mlを注入し、流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り、40゜以下でアセトン及びn―ヘキサンを除去する。この残留物にn―ヘキサンを加えて溶かし、正確に2mlとして、これを試験溶液とする。
6．操作法
a 定性試験
次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。
操作条件
カラム 内径0.25mm、長さ30mのケイ酸ガラス製の細管に、ガスクロマトグラフィー用5％フェニル―メチルシリコンを0.25μmの厚さでコーティングしたもの。
カラム温度 60゜で2分間保持し、その後毎分30゜で昇温し、180゜に到達後、更に毎分4°で昇温する。250°に到達後、更に毎分10°で昇温し、300°に到達後5分間保持する。
試験溶液注入口温度 250゜
検出器 250゜で操作する。
ガス流量 キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。ビオレスメトリンが約22分で流出する流速に調整する。
モニターイオン(m／z) 123、171及び338
b 定量試験
a 定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき、ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。
c 確認試験
a 定性試験と同様の操作条件で、ガスクロマトグラフィー・質量分析を行う。測定結果は標準品と一致しなければならない。
7．定量限界
0.01mg／kg
8．留意事項
なし
9．参考文献
なし
10．類型
A
ピクロラム試験法(農産物)
1．分析対象化合物
ピクロラム
2．装置
電子捕獲型検出器付きガスクロマトグラフ，ガスクロマトグラフ・質量分析計及びメチル化装置を用いる。
メチル化装置の概略は，次の図による。
A：エーテル管
B：ジアゾメタン発生管
C：反応管
3．試薬、試液
次に示すもの以外は，総則の3に示すものを用いる。
ジアゾメタンエーテル溶液 メチル化装置のエーテル管にエーテル5mlを入れる。メチル化装置のジアゾメタン発生管にジエチレングリコールモノエチルエーテル4ml及び10mol／l水酸化カリウム溶液2mlを入れる。メチル化装置の反応管にエーテル50mlを入れる。メチル化装置のジアゾメタン発生管にN―メチル―N―ニトロソ―p―トルエンスルホンアミド2gをエーテル5mlに溶かしたものを加えた後，窒素を5分間緩やかに通じて反応させ，反応管の溶液を採る。用時調製する。
リン酸緩衝液 0.2mol／lリン酸一水素カリウム溶液に0.2mol／lリン酸二水素カリウム溶液を加えてpH5に調整する。
4．標準品
ピクロラム 本品はピクロラム98％以上を含む。
分解点 本品の分解点は215°である。
5．試験溶液の調製
a 抽出法
検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後，その10.0gを量り採り，水100mlを加え，2時間放置する。
振とう機を用いて30分間激しく振り混ぜた後、ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いて三角フラスコに吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を水50mlで洗い、洗液を上記のろ液に合わせ、500mlの分液漏斗(Ⅰ)に移す。これにエーテル50ml及び塩化ナトリウム30gを加え、激しく振り混ぜた後、静置し、水層を500mlの分液漏斗(Ⅱ)に採る。これにエーテル100ml及びリン酸5mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，エーテル層を300mlの三角フラスコに移す。水層にエーテル50mlを加え，上記と同様に操作して，エーテル層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでエーテル20mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ，40°以下でエーテルを除去する。この残留物に水，0.01mol／lラウリル硫酸ナトリウム溶液及び1mol／lリン酸の混液(17：2：1)10mlを加えて溶かす。
b 精製法
オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(360mg)に，メタノール10mlを注入し，流出液は捨てる。次いで水10mlを注入し，流出液は捨てる。次いで0.01mol／lラウリル硫酸ナトリウム溶液10mlを注入し，流出液は捨てる。このカラムにa 抽出法で得られた溶液を注入し，流出液は捨てる。次いで水，0.01mol／lラウリル硫酸ナトリウム溶液及びリン酸緩衡液の混液(13：2：5)10mlを注入する。流出液をあらかじめ飽和塩化ナトリウム溶液40ml及びリン酸2mlを入れた200mlの分液漏斗に移す。これにエーテル50mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，エーテル層を200mlの三角フラスコに移す。水層にエーテル50mlを加え，上記と同様に操作して，エーテル層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでエーテル20mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ，40°以下でエーテルを除去する。
c メチル化
この残留物にジアゾメタンエーテル溶液をジアゾメタンの黄色が残るまで加え，密栓し，1分間放置した後，40°以下で溶媒を除去する。この残留物にエーテル5mlを加えて溶かす。
内径15mm，長さ300mmのクロマトグラフ管に，カラムクロマトグラフィー用アルミナ(塩基性)5gをエーテルに懸濁したもの，次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ，カラムの上端に少量のエーテルが残る程度までエーテルを流出させる。このカラムに上記の溶液を注入した後，エーテル70mlを注入し，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40°以下でエーテルを除去する。この残留物にn―ヘキサンを加えて溶かし，正確に5mlとして，これを試験溶液とする。
6．操作法
a 定性試験
次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品について，5．試験溶液の調製のc メチル化と同様に操作をして得られたものと一致しなければならない。
操作条件
カラム 内径0.53mm，長さ15mのケイ酸ガラス製の細管に，ガスクロマトグラフィー用50％フェニル―メチルシリコンを1μmの厚さでコーティングしたもの。
カラム温度 200°
試験溶液注入口温度 250°
検出器 280°で操作する。
ガス流量 キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。4―アミノ―3，5，6―トリクロロピリジン―2―カルボン酸メチルが約7分で流出する流速に調整する。
b 定量試験
a 定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。
c 確認試験
a 定性試験と同様の操作条件でガスクロマトグラフィー・質量分析を行う。試験結果は標準品について，5．試験溶液の調製のc メチル化と同様に操作をして得られたものと一致しなければならない。また，必要に応じ，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。
7．定量限界
0.01mg／kg
8．留意事項
なし
9．参考文献
なし
10．類型
A
ビスピリバックナトリウム塩試験法(農産物)
1．分析対象化合物
ビスピリバックナトリウム塩
2．装置
アルカリ熱イオン化検出器又は高感度窒素・リン検出器付きガスクロマトグラフ及びガスクロマトグラフ・質量分析計を用いる。
3．試薬、試液