添付一覧
脂肪の場合は，可能な限り筋肉層を除き，細切均一化した後，その5.00gを量り採る。
これにメタノール及び0.4％メタリン酸溶液の混液(1：1)35mlを加え，細砕した後，毎分3,000回転で10分間遠心分離を行い，綿栓ろ過する。
(2) 精製法
a 筋肉，肝臓及び腎臓の場合の(2) 精製法を準用する。
c 乳の場合
(1) 抽出法
試料10.0gを量り採り，メタノール及び1.2％メタリン酸溶液の混液(1：1)35mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，毎分3,000回転で10分間遠心分離を行い，綿栓ろ過する。
(2) 精製法
a 筋肉，肝臓及び腎臓の場合の(2) 精製法のイ 牛及び鶏の場合を準用する。
d 魚介類の場合
(1) 抽出法
殻付きの貝類の場合は，殻を除き，細切均一化した後，その5.00gを量り採る。
その他の魚介類の場合は，細切均一化した後，その5.00gを量り採る。
これにメタノール及び1.2％メタリン酸溶液の混液(1：1)35mlを加え，細砕した後，毎分3,000回転で10分間遠心分離を行い，綿栓ろ過する。
(2) 精製法
a 筋肉，肝臓及び腎臓の場合の(2) 精製法のイ 牛及び鶏の場合を準用する。
6．操作法
a 牛、鶏、乳及び魚介類の場合
(1) 定性試験
次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。
操作条件
カラム充てん剤 オクタデシルシリル化シリカゲルを用いる。
カラム管 内径4.0～6.0mm，長さ150mmのステンレス管を用いる。
カラム温度 40゜
検出器 吸光波長235nmで操作する。
移動相 アセトニトリル及びリン酸緩衝液(pH2.5)の混液(1：3)を用いる。スピラマイシンⅠが約10分で流出する流速に調整する。
(2) 定量試験
(1) 定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。
b 豚の場合
(1) 定量試験
試験溶液をディスクに吸着させ，検査用平板に置き，35゜で18時間培養する。阻止円の直径をスピラマイシンⅠの標準品と比較して定量を行う。
(2) 確認試験
a 牛及び鶏の場合の(1) 定性試験と同様の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。
7．定量限界
牛の筋肉、脂肪、肝臓及び腎臓 0.05mg／kg(スピラマイシン及びネオスピラマイシンそれぞれについて)
鶏の筋肉、脂肪、肝臓及び腎臓 0.05mg／kg(スピラマイシン及びネオスピラマイシンそれぞれについて)
乳及び魚介類 0.05mg／kg(スピラマイシン及びネオスピラマイシンそれぞれについて)
豚の筋肉、脂肪、肝臓及び腎臓 0.1mg／kg(スピラマイシンとして)
8．留意事項
(1) 標準溶液の調製
(1) スピラマイシンⅠ標準品をメタノールに溶解してスピラマイシンⅠ標準原液とすること(スピラマイシンⅠ 1,000mg／l)。本標準原液は、0～4゜保存で3ヶ月間安定であること。
(2) ネオスピラマイシンⅠ標準品をメタノールに溶解して標準原液とすること(ネオスピラマイシンⅠ 1,000mg／l)。本標準原液は、0～4゜保存で3ヶ月間安定であること。
(3) スピラマイシンⅠ及びネオスピラマイシンⅠ標準原液を0.05mol／lリン酸二カリウム溶液で逓減希釈し、検量線作成用標準溶液とすること。
(2) その他
本試験法によりスピラマイシンが検出された場合には、紫外可視多波長検出器及び質量検出器付き高速液体クロマトグラフを用いて確認することが望ましいこと。
9．参考文献
なし
10．類型
A
スピロメシフェン試験法(農産物)
1．分析対象化合物
スピロメシフェン
4―ヒドロキシ―3―メシチル―1―オキサスピロ［4.4］ノナ―3―エン―2―オン(以下、エノール体という。)
2．装置
液体クロマトグラフ・質量分析計(LC／MS)
3．試薬、試液
次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。
スピロメシフェン標準品 本品はスピロメシフェン98％以上を含み、融点は96～101℃である。
エノール体標準品 本品はエノール体99％以上を含み、融点は256～258℃である。
4．試験溶液の調製
1)抽出
果実及び野菜の場合は試料20.0gを量り採る。穀類及び豆類の場合は試料10.0g、茶の場合は試料5.00gにそれぞれ水20mLを加え、2時間放置する。
これにアセトニトリル、ギ酸及び水(80：1：20)混液100mLを加え、ホモジナイズした後、抽出液をろ紙とガラス繊維ろ紙を敷いたロートで吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトニトリル、ギ酸及び水(80：1：20)混液50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせ、アセトニトリル、ギ酸及び水(80：1：20)混液を加えて正確に200mLとする。この50mL(穀類及び豆類の場合は20mL、茶の場合は40mL)を採り、40℃以下で約10mL(穀類及び豆類の場合は約4mL、茶の場合は約8mL)まで濃縮する。濃縮液に水を加えて50mLとし、これにギ酸0.1mLを加え、酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：19)混液50mLで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にn―ヘキサン10mLを加えて溶かす。
2)精製
①シリカゲルカラムクロマトグラフィー
シリカゲルミニカラム(500mg)にn―ヘキサン10mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに1)で得られた溶液を注入した後、容器を酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：19)混液10mLで洗い、洗液をカラムに注入し、流出液は捨てる。次に酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：19)混液10mLを注入し、流出液は捨てる。次いで酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：19)混液15mLを注入し、溶出液(Ⅰ：スピロメシフェン画分)を採る。さらにギ酸、酢酸エチル及びn―ヘキサン(0.1：25：75)混液10mLを注入し、溶出液(Ⅱ：エノール体画分)を採る。溶出液(Ⅰ)を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をアセトニトリル及び0.01％ギ酸溶液(1：1)混液に溶解し、果実及び野菜の場合は正確に10mL、穀類、豆類及び茶の場合は正確に2mLとしたものをスピロメシフェンの試験溶液とする。
②グラファイトカーボンカラムクロマトグラフィー
グラファイトカーボンミニカラム(500mg)にギ酸、酢酸エチル及びn―ヘキサン(0.1：25：75)混液5mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに①で得られた溶出液(Ⅱ)を注入する。次に、ギ酸、酢酸エチル及びn―ヘキサン(0.1：25：75)混液5mL及びアセトニトリル及びギ酸(99：1)混液10mLを順次注入し、全溶出液を合わせ、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をアセトニトリル及び0.01％ギ酸溶液(1：1)混液に溶解し、果実及び野菜の場合は正確に10mL、穀類、豆類及び茶の場合は正確に2mLとしたものをエノール体の試験溶液とする。
5．検量線の作成
スピロメシフェン標準品の0.005～0.1mg／L及びエノール体標準品の0.0025～0.05mg／Lを含むアセトニトリル及び0.01％ギ酸溶液(1：1)混液の混合標準溶液を数点調製する。それぞれ2μLをLC／MSに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。
6．定量
試験溶液2μLをLC／MSに注入し、5の検量線でスピロメシフェン及びエノール体の含量を求める。次式により、エノール体を含むスピロメシフェンの含量を求める。
スピロメシフェン(エノール体を含む。)の含量(ppm)＝A＋B×1.36
A：スピロメシフェンの含量(ppm)
B：エノール体の含量(ppm)
7．確認試験
LC／MSにより確認する。
8．測定条件
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル 内径2.1mm、長さ150mm、粒子径5μm
カラム温度：40℃
移動相：アセトニトリル及び0.01％ギ酸溶液の混液(3：7)から(4：1)までの濃度勾配を15分間で行い、さらに(9：1)までの濃度勾配を7分間で行う。
イオン化モード：スピロメシフェンESI(＋)、エノール体ESI(－)
主なイオン(m／z)：スピロメシフェン273、エノール体271
保持時間の目安：
スピロメシフェン 20分
エノール体 11分
9．定量限界
各化合物 0.01mg／kg (エノール体はスピロメシフェン換算)
10．留意事項
1)試験法の概要
スピロメシフェン及びエノール体を試料からアセトニトリル、ギ酸及び水(80：1：20)混液で抽出し、酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：19)混液に転溶した後、シリカゲルミニカラムでスピロメシフェンとエノール体に分画し、エノール体はさらにグラファイトカーボンミニカラムで精製した後、LC／MSで測定及び確認する方法である。なお、スピロメシフェン及びエノール体のそれぞれについて定量を行い、エノール体についてはその含量に換算係数を乗じてスピロメシフェンの含量に変換し、これらの和を分析値とする。
2)注意点
①スピロメシフェンからエノール体への変換を抑えるためにギ酸酸性下にて抽出を行う。
②抽出液のろ過の際には、ろ紙の上にガラス繊維ろ紙を積層することにより、目詰りを防止し、ろ過を容易にする。
③葉緑素の少ない試料では、エノール体をエチレンジアミントリ酢酸―N―プロピルシリル化シリカゲルミニカラム(1000mg)で精製しても良い。
操作概要を以下に示す。予めメタノール5mL、次いで水5mLで洗浄したエチレンジアミントリ酢酸―N―プロピルシリル化シリカゲルミニカラム(1000mg)に、シリカゲルミニカラムで精製した溶出液(Ⅱ)を注入し、流出液は捨てる。このカラムに、ギ酸、酢酸エチル及びn―ヘキサン(0.1：25：75)混液5mLを注入し、流出液を捨てる。次に、メタノール10mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をアセトニトリル及び0.01％ギ酸溶液(1：1)混液に溶解し、果実及び野菜の場合は正確に10mL、穀類、豆類及び茶の場合は正確に2mLとしたものをエノール体の試験溶液とする。
11．参考文献
なし
12．類型
C
スピロメシフェン試験法(畜水産物)
1．分析対象化合物
スピロメシフェン
4―ヒドロキシ―3―メシチル―1―オキサスピロ［4.4］ノナ―3―エン―2―オン(以下、エノール体という。)
2．装置
液体クロマトグラフ・質量分析計(LC／MS)又は液体クロマトグラフ・タンデム型質量分析計(LC／MS／MS)
3．試薬、試液
次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。
スピロメシフェン標準品 本品はスピロメシフェン98％以上を含み、融点は96～101℃である。
エノール体標準品 本品はエノール体99％以上を含み、融点は256～258℃である。
4．試験溶液の調製
1)抽出
試料5.00gにアセトニトリル、ギ酸及び水(80：1：20)混液100mL並びにn―ヘキサン10mLを加え、ホモジナイズした後、毎分3,000回転で5分間遠心分離を行う。アセトニトリル、ギ酸及び水混液層を採り、n―ヘキサン層及び残留物にアセトニトリル、ギ酸及び水(80：1：20)混液50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様に遠心分離を行う。得られたアセトニトリル、ギ酸及び水混液層を合わせ、アセトニトリル、ギ酸及び水(80：1：20)混液を加えて正確に200mLとし、この20mLを採り、40℃以下で約4mLまで濃縮する。
2)精製
オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(1,000mg)にアセトニトリル及び水各10mLを順次注入し、流出液は捨てる。このカラムに1)で得られた溶液に水10mLを加えたものを注入した後、容器をアセトニトリル及び0.01％ギ酸溶液(2：3)混液10mLで洗い、洗液をカラムに注入し、流出液は捨てる。次いでアセトニトリル及び0.01％ギ酸溶液(9：1)混液10mLを注入し、溶出液に同混液を加えて正確に10mLとしたものを試験溶液とする。
5．検量線の作成
スピロメシフェン標準品の0.0005～0.01mg／L及びエノール体標準品の0.00025～0.005mg／Lを含むアセトニトリル及び0.01％ギ酸溶液(9：1)混液の混合標準溶液を数点調製する。それぞれLC／MSの場合は10μL、LC／MS／MSの場合は4μLを注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。
6．定量
試験溶液10μLをLC／MSに、又は4μLをLC／MS／MSに注入し、5の検量線でスピロメシフェン及びエノール体の含量を求める。次式により、エノール体を含むスピロメシフェンの含量を求める。
スピロメシフェン(エノール体を含む。)の含量(ppm)＝A＋B×1.36
A：スピロメシフェンの含量(ppm)
B：エノール体の含量(ppm)
7．確認試験
LC／MS又はLC／MS／MSにより確認する。
8．測定条件
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル 内径2.0mm、長さ150mm、粒子径5μm
カラム温度：40℃
移動相：アセトニトリル及び0.01％ギ酸溶液の混液(1：1)から(9：1)までの濃度勾配を4分間で行い、(9：1)で11分間保持する。
イオン化モード：スピロメシフェンESI(＋)、エノール体ESI(－)
主なイオン(m／z)：
1)LC／MSの場合
スピロメシフェン273、エノール体271
2)LC／MS／MSの場合
スピロメシフェン；プリカーサーイオン273、プロダクトイオン91、67
エノール体；プリカーサーイオン271、プロダクトイオン209、159
注入量：
1)LC／MSの場合 10μL
2)LC／MS／MSの場合 4μL
保持時間の目安：
スピロメシフェン 9分
エノール体 5分
9．定量限界
各化合物 0.01mg／kg (エノール体はスピロメシフェン換算)
10．留意事項
1)試験法の概要
スピロメシフェン及びエノール体を試料からアセトニトリル、ギ酸及び水(80：1：20)混液にn―ヘキサンを加えた溶液で抽出する。n―ヘキサンを分離し、アセトニトリル、ギ酸及び水混液層をオクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムで精製した後、LC／MS又はLC／MS／MSで測定及び確認する方法である。なお、スピロメシフェン及びエノール体のそれぞれについて定量を行い、エノール体についてはその含量に換算係数を乗じてスピロメシフェンの含量に変換し、これらの和を分析値とする。
2)注意点
①スピロメシフェンからエノール体への変換を抑えるためにギ酸酸性下にて抽出を行う。
②精製が不十分な場合は、グラファイトカーボンミニカラム(250mg)による精製を追加するとよい。
操作概要を以下に示す。オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム精製操作で、アセトニトリル及び0.01％ギ酸溶液(2：3)混液10mLをカラムに注入し、流出液を捨てた後、予めアセトニトリル及び0.01％ギ酸溶液(9：1)混液5mLで洗浄したグラファイトカーボンミニカラムをオクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムの下部に接続する。この連結カラムにアセトニトリル及び0.01％ギ酸溶液(9：1)混液10mLを注入し、溶出液にアセトニトリル及び0.01％ギ酸溶液(9：1)混液を加えて正確に10mLとしたものを試験溶液とする。
11．参考文献
なし
12．類型
C
スルファキノキサリン、スルファジアジン、スルファジミジン、スルファジメトキシン、スルファメトキサゾール、スルファメトキシピリダジン、スルファメラジン、スルファモノメトキシン及びスルフイソゾール試験法(畜水産物)
1．分析対象化合物
農薬等の成分である物質 |
分析対象化合物 |
スルファキノキサリン |
スルファキノキサリン |
スルファジアジン |
スルファジアジン |
スルファジミジン |
スルファジミジン |
スルファジメトキシン |
スルファジメトキシン |
スルファメトキサゾール |
スルファメトキサゾール |
スルファメトキシピリダジン |
スルファメトキシピリダジン |
スルファメラジン |
スルファメラジン |
スルファモノメトキシン |
スルファモノメトキシン |
スルフイソゾール |
スルフイソゾール |
2．装置
紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ(HPLC―UV)又は多波長検出器付き高速液体クロマトグラフ(HPLC―DAD)
3．試薬、試液
次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。
アセトニトリル 液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。
水 液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。
メタノール 液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。
エチレンジアミン―N―プロピルシリル化シリカゲルミニカラム(500mg) 内径12～13mmのポリエチレン製のカラム管にエチレンジアミン―N―プロピルシリル化シリカゲル500mgを充填したもの又はこれと同等の分離特性を有するものを用いる。
スルファキノキサリンナトリウム標準品 本品はスルファキノキサリン99.0％以上を含み、融点は247～248℃である。
スルファジアジン標準品 本品はスルファジアジン99.0％以上を含み、融点は252～256℃である。
スルファジミジン標準品 本品はスルファジミジン99.0％以上を含み、融点は197～200℃である。
スルファジメトキシン標準品 本品はスルファジメトキシン99.0％以上を含み、融点は193～203℃である。
スルファメトキサゾール標準品 本品はスルファメトキサゾール99.0％以上を含み、融点は166～172℃である。
スルファメトキシピリダジン標準品 本品はスルファメトキシピリダジン99.0％以上を含み、180～183℃である。
スルファメラジン標準品 本品はスルファメラジン99.0％以上を含み、融点は234～238℃である。
スルファモノメトキシン標準品 本品はスルファモノメトキシン99.0％以上を含み、融点は204～206℃である。
スルフイソゾール標準品 本品はスルフイソゾール98.0％以上を含み、融点は141～142℃である。
4．試験溶液調製法
1) 抽出
試料5.00gを量り採り、無水硫酸ナトリウム10g及び酢酸エチル20mLを加えて1分間ホモジナイズした後、毎分3,000回転で10分間遠心分離し、酢酸エチル層を採る。残留物を酢酸エチル20mLずつで2回上記と同様に操作し、得られた酢酸エチル層を合わせる。適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、綿栓ろ過する。これを40℃以下で約5mLに濃縮し、n―ヘキサン7mLを加える。
2) 精製
エチレンジアミン―N―プロピルシリル化シリカゲルミニカラム(500mg)に、n―ヘキサン5mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに1)で得られた溶液を毎分5mLで注入した後、酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：1)混液3mL、n―ヘキサン3mLを注入し、流出液は捨てる。カラム内のn―ヘキサンを加圧又は減圧により除去した後、カラムに20％アセトニトリル―0.05mol／Lギ酸アンモニウムを5mL注入し、溶出液を試験溶液とする。
5．検量線の作成
スルファキノキサリン、スルファジアジン、スルファジミジン、スルファジメトキシン、スルファメトキサゾール、スルファメトキシピリダジン、スルファメラジン、スルファモノメトキシン及びスルフイソゾール標準品について、0.005～1.0mg／Lの20％アセトニトリル―0.05mol／Lギ酸アンモニウム溶液を数点調製する。それぞれHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。
6．定量
試験溶液をHPLCに注入し、5の検量線でスルファキノキサリン、スルファジアジン、スルファジミジン、スルファジメトキシン、スルファメトキサゾール、スルファメトキシピリダジン、スルファメラジン、スルファモノメトキシン及びスルフイソゾールの含量を求める。
7．確認試験
LC／MS又はLC／MS／MSにより確認する。
8．測定条件
HPLC
検出器：UV又はDAD(波長272nm)
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル 内径2.0～6.0mm、長さ100～250mm、粒子径2～5μm
カラム温度：30℃
移動相：メタノール、アセトニトリル及び0.05mol／Lギ酸(2：3；15)混液
保持時間の目安：30～40分(スルファキノキサリン)
9．定量限界
0.01mg／kg
10．留意事項
1) 試験法の概要
スルファキノキサリン、スルファジアジン、スルファジミジン、スルファジメトキシン、スルファメトキサゾール、スルファメトキシピリダジン、スルファメラジン、スルファモノメトキシン及びスルフイソゾールを試料から酢酸エチルで抽出し、エチレンジアミン―N―プロピルシリル化シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した後、HPLC―UV又はHPLC―DADにより測定する方法である。
2) 注意点
(1) 抽出液を濃縮乾固後、酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液を加えると、サルファ剤の再溶解が不十分な場合があるので、抽出液の濃縮時には乾固させないようにすること。
(2) n―ヘキサンでミニカラムを洗浄した後に、ミニカラム中に残存しているn―ヘキサンを完全に留去しないと、試験溶液中にn―ヘキサンが混入して、測定結果に影響を及ぼすことがある。
11．参考文献
Y.Ito et al.,J.Chromatogr.A，898，95―102(2000)
12．類型
D
スルファジミジン試験法(畜水産物)
1．分析対象化合物
スルファジミジン
2．装置
紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフを用いる。
3．試薬．試液
次に示すもの以外は，総則の3に示すものを用いる。
アルミナ(中性)ミニカラム(1,850mg) 内径8～9mmのポリエチレン製のカラム管に，カラムクロマトグラフィー用に製造したアルミナ(中性)1,850mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離特性を有するものを用いる。
4．標準品
スルファジミジン 本品はスルファジミジン99％以上を含む。
融点 本品の融点は198～201°である。
5．試験溶液の調製
a 抽出法
(1) 筋肉，脂肪，肝臓及び腎臓の場合
検体を細切均一化した後，その5.00gを量り採り，アセトニトリル25ml及び無水硫酸ナトリウム10gを加え，細砕した後，毎分3,000回転で5分間遠心分離を行い，アセトニトリル層を100mlの分液漏斗中に移す。これにアセトニトリル飽和n―ヘキサン25mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，アセトニトリル層をすり合わせ減圧濃縮器中に移す。遠心分離管の残留物にアセトニトリル25mlを加え，1分間激しく振り混ぜた後，上記と同様の条件で遠心分離を行い，アセトニトリル層をその分液漏斗中に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，アセトニトリル層をそのすり合わせ減圧濃縮器中に合わせ，n―プロパノール10mlを加え，40°以下でアセトニトリル及びn―プロパノールを除去する。この残留物にアセトニトリル及び水の混液(19：1)3mlを加えて溶かす。
(2) 乳の場合
試料10.0gを量り採り，アセトニトリル25ml及び無水硫酸ナトリウム20gを加え，毎分3,000回転で5分間遠心分離を行い，アセトニトリル層を100mlの分液漏斗中に移す。これにアセトニトリル飽和n―ヘキサン25mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，アセトニトリル層をすり合わせ減圧濃縮器中に移す。遠心分離管の残留物にアセトニトリル25mlを加え，1分間激しく振り混ぜた後，前記と同様の条件で遠心分離を行い，アセトニトリル層をその分液漏斗中に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，アセトニトリル層をそのすり合わせ減圧濃縮器中に合わせ，n―プロパノール10mlを加え，40°以下でアセトニトリル及びn―プロパノールを除去する。この残留物にアセトニトリル及び水の混液(19：1)3mlを加えて溶かす。
b 精製法
アルミナ(中性)ミニカラム(1,850mg)に，アセトニトリル及び水の混液(19：1)10mlを注入し，流出液は捨てる。このカラムにa 抽出法で得られた溶液を注入し，流出液は捨てる。このカラムにアセトニトリル及び水の混液(17：3)10mlを注入し，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40°以下でアセトニトリル及び水を除去する。この残留物にアセトニトリル及び0.025mol／lリン酸一ナトリウム溶液の混液(3：17)1.0mlを加えて溶かし，アセトニトリル飽和n―ヘキサン0.5mlを加え，毎分3,000回転で5分間遠心分離を行う。n―ヘキサン層を捨て，アセトニトリル及びリン酸一ナトリウム溶液の混液層を採り，これを試験溶液とする。
6．操作法
a 定性試験
次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。
操作条件
カラム充てん剤 オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)を用いる。
カラム管 内径4.0～6.0mm，長さ150mmのステンレス管を用いる。
カラム温度 40°
検出器 吸光波長268nmで操作する。
移動相 アセトニトリル及び0.025mol／lリン酸一ナトリウム溶液の混液(3：17)を用いる。スルファジミジンが約10分で流出する流速に調整する。
b 定量試験
a 定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。
7．定量限界
筋肉，脂肪，肝臓及び腎臓 0.01mg／kg 乳 0.005mg／kg
8．留意事項
5．試験溶液の調製のb 精製法において用いるアルミナ(中性)ミニカラムは，予め標準品を用いて，その保持，溶出性能及び精製効果，回収率(90～100％)を確認すると伴に，定量限界が筋肉，脂肪，肝臓及び腎臓については0.01mg／kg以下，乳については0.005mg／kg以下であることを確認すること。
9．参考文献
なし
10．類型
A
セトキシジム試験法(農産物)
1．分析対象化合物
セトキシジム、MSO［セトキシジムスルホキシド］、MSO2［セトキシジムスルホン］、M2S、M2SO、M2SO2、5―OH―MSO2
2．装置
紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフを用いる。
3．試薬、試液
総則の3に示すものを用いる。
4．標準品
セトキシジム 本品はセトキシジム99％以上を含む。
(RS)2―(エトキシイミノブチル)―5―［2―(エチルスルホニル)プロピル］―3，5―ジヒドロキシシクロヘキサ―2―エノン(以下「5―OH―MSO2」という。) 本品は5―OH―MSO298％以上を含む。
5．試験溶液の調製
a 抽出法
穀類，豆類及び種実類の場合は，検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後，その20.0gを量り採る。
果実及び野菜の場合は，検体約1kgを精密に量り，必要に応じ適量の水を量つて加え，細切均一化した後，検体20.0gに相当する量を量り採る。
これにメタノール100mlを加え，振とう機を用いて30分間激しく振り混ぜた後，静置し，ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いて吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に，メタノール50mlを加え，上記と同様に操作して，ろ液を500mlの三角フラスコ(Ⅰ)に合わせる。これに水150mlを加えた後，水酸化カルシウム4gを加え，1分間振り混ぜた後，静置し，ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いて500mlの三角フラスコ(Ⅱ)に吸引ろ過する。次いで水及びメタノールの混液(1：1)30mlを用いて三角フラスコ(Ⅰ)を洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う。洗液を500mlの三角フラスコ(Ⅱ)に合わせる。これに1mol／l塩酸を加えてpH3～4に調整し，過酸化水素水0.5mlを加え，50°で16時間加熱し，冷後これを500mlの分液漏斗に移す。
これに塩化ナトリウム5g及びn―ヘキサン50mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，n―ヘキサン層を捨てる。水層にジクロロメタン(特級)80mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，ジクロロメタン層を1,000mlの分液漏斗に移す。水層にジクロロメタン(特級)80mlを加え，上記と同様の操作を2回繰り返し，ジクロロメタン層を上記の分液漏斗に合わせる。これに塩化ナトリウム5g及び0.01mol／l水酸化ナトリウム溶液(特級)50mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，ジクロロメタン層を500mlの三角フラスコに移す。水層にジクロロメタン50mlを加え，上記と同様に操作して，ジクロロメタン層を上記の三角フラスコに合わせる。これを液相分離ろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中にろ過し，40°以下で30mlに濃縮する。
b スルホン化
a 抽出法で得られた溶液にm―クロロ過安息香酸約20mgを加え，密栓し，時々振り混ぜながら30°で10分間放置する。これに5％チオ硫酸ナトリウム溶液30mlを加え，振とう機を用いて10分間激しく振り混ぜた後，静置し，ジクロロメタン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にジクロロメタン(特級)20mlを加え，上記と同様に操作して，ジクロロメタン層を上記の三角フラスコに合わせる。これを液相分離ろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中にろ過し，40°以下でジクロロメタンを除去する。この残留物に酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(2：3)10mlを加えて溶かす。
c 精製法
内径15mm，長さ300mmのクロマトグラフ管に，カラムクロマトグラフィー用シリカゲル(粒径150～425μm)10gを酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(2：3)に懸濁したもの，次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ，カラムの上端に少量の酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(2：3)が残る程度まで酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(2：3)を流出させる。このカラムにb スルホン化で得られた溶液を注入した後，酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(2：3)150mlを注入し，流出液は捨てる。次にアセトン及びn―ヘキサンの混液(3：7)200mlを注入し，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40°以下でアセトン及びn―ヘキサンを除去する。この残留物にジクロロメタン(特級)を加えて溶かし，正確に5mlとして，これを試験溶液とする。
6．操作法
a 定性試験
次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品それぞれについて，5．試験溶液の調製のa 抽出法，b スルホン化及びc 精製法と同様に操作して得られたものと一致しなければならない。
操作条件
カラム充てん剤 カラムクロマトグラフィー用シリカゲルを用いる。
クロマトグラフ管 内径2～3mm，長さ200～500mmのステンレス管を用いる。
検出器 波長254nmで操作する。
移動相 ジクロロメタン及びメタノールの混液(49：1)を用いる。(RS)6―〔2―(エチルスルホニル)プロピル〕―4―オキソ―2―プロピル―4，5，6，7―テトラヒドロベンゾオキサゾールが約6～8分で流出する流速に調整する。
b 定量試験
a 定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき，セトキシジム及び5―OH―MSO2のそれぞれについてピーク高法又はピーク面積法により定量を行い，セトキシジム及び5―OH―MSO2の含量を求め，次式により，5―OH―MSO2を含むセトキシジムの含量を求める。
セトキシジム(5―OH―MSO2を含む。)の含量(ppm)＝A＋B×0.87
A：セトキシジムの含量(ppm)
B：5―OH―MSO2の含量(ppm)
7．定量限界
0.01mg／kg
8．留意事項
セトキシジムは、セトキシジム及び5―OH―MSO2のそれぞれについて定量を行い、5―OH―MSO2についてはその含量に係数を乗じてセトキシジムの含量に換算し、これらの和を分析値とすること。セトキシジムの分析値には、セトキシジム、MSO、MSO2、M2S、M2SO、M2SO2、5―OH―MSO2が含まれる。
9．参考文献
なし
10．類型
A
セファゾリン、セファピリン、セファレキシン、セファロニウム、セフォペラゾン及びセフロキシム試験法(畜水産物)
1．分析対象化合物
農薬等の成分である物質 |
分析対象化合物 |
セファゾリン |
セファゾリン |
セファピリン |
セファピリン |
セファレキシン |
セファレキシン |
セファロニウム |
セファロニウム |
セフォペラゾン |
セフォペラゾン |
セフロキシム |
セフロキシム |
2．装置
液体クロマトグラフ・質量分析計(LC／MS)
3．試薬、試液
次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。
アセトニトリル 液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。
水 液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。
メタノール 液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。
ジビニルベンゼン―N―ビニルピロリドン共重合体ミニカラム(60mg) 内径12～13mmのポリエチレン製のカラム管にジビニルベンゼン―N―ビニルピロリドン共重合体60mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離特性を有するものを用いる。
セファゾリンナトリウム標準品 本品はセファゾリンナトリウム97％以上を含む。
セファピリンナトリウム標準品 本品はセファピリンナトリウム90％以上を含む。
セファレキシン標準品 本品はセファレキシン99％以上を含む。
セファロニウム標準品 本品はセファロニウム98％以上を含む。
セフォペラゾンナトリウム標準品 本品はセフォペラゾンナトリウム95％以上を含む。
セフロキシムナトリウム標準品 本品はセフロキシムナトリウム99％以上を含む。
4．試験溶液の調製
1) 抽出
(1) 筋肉の場合
試料5.00gを量り採り、メタノール及び0.2％メタリン酸溶液(3：7)混液100mLを加えて細砕した後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にメタノール及び0.2％メタリン酸溶液(3：7)混液20mLを加えてかき混ぜた後、上記と同様に操作して、ろ液を合わせ、40℃以下で約30mLに濃縮する。
(2) 脂肪の場合
試料5.00gを量り採り、n―ヘキサン30mL及び0.2％メタリン酸溶液70mLを加えて細砕した後、毎分3,000回転で5分間遠心分離し、0.2％メタリン酸溶液層を採る。
(3) 肝臓、腎臓、乳及びその他の食用部分の場合
試料5.00gを量り採り、メタノール及び0.2％メタリン酸溶液(3：7)混液100mLを加えて細砕し、ケイソウ土3gを加えて混和した後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にメタノール及び0.2％メタリン酸溶液(3：7)混液20mLを加えてかき混ぜた後、上記と同様に操作して、ろ液を合わせ、40℃以下で約30mLに濃縮する。
2) 精製
ジビニルベンゼン―N―ビニルピロリドン共重合体ミニカラム(60mg)に、メタノール5mL及び水5mLを順次注入し、流出液は捨てる。このカラムに1)で得られた溶液を注入した後、水5mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムにメタノール5mLを注入し、溶出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り、40℃以下でメタノールを除去する。この残留物に水及びメタノール(7：3)混液1.0mLを加えて溶かし、これを試験溶液とする。
5．検量線の作成
セファロニウム標準品は10mgを水3mLに溶解後、メタノールを加えて100mLとする。その他の各標準品は10mg／100mLメタノール溶液を調製する。これらを水及びメタノール(7：3)混液で希釈して0.05～5mg／Lの標準溶液を数点調製する。それぞれLC／MSに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。
6．定量
試験溶液をLC／MSに注入し、5の検量線で各物質の含量を求める。
7．確認試験
LC／MSにより確認する。
8．測定条件
LC／MS
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル 内径2.0～6.0mm、長さ100～250mm、粒子径2～5μm
カラム温度：40℃
移動相：アセトニトリル及び0.01％ギ酸溶液の混液(1：19)から(1：1)までの濃度勾配を20分間で行う。
主なイオン(m／z)：
セファゾリン ESI＋において455
セファピリン ESI＋において424
セファレキシン ESI＋において348
セファロニウム ESI＋において459
セフォペラゾン ESI＋において646又はESI－において644
セフロキシム ESI－において423
保持時間の目安：10分(セファピリン)
9．定量限界
各分析対象化合物について0.01mg／kg
10．留意事項
1) 試験法の概要
セファゾリン、セファピリン、セファレキシン、セファロニウム、セフォペラゾン及びセフロキシムを試料からメタノール及び0.2％メタリン酸溶液の混液、または、0.2％メタリン酸溶液で抽出し、ジビニルベンゼン―N―ビニルピロリドン共重合体ミニカラムで精製した後、LC／MSで測定及び確認する方法である。
2) 注意点
(1) LC／MSにおける標準溶液及び試験溶液の標準的な注入量は、内径3.0mmのカラムにおいて10μLであるが、カラム及び装置により最適な注入量が異なる場合があるので、必要に応じて最適注入量を検討すること。
(2) LC／MSにおける測定条件は用いる装置により、最適なイオン化方法、生成するイオンが異なる場合があるので、装置ごとに最適条件を検討すること。
11．参考文献
なし
12．類型
C
セフキノム試験法(畜水産物)
1．分析対象化合物
セフキノム
2．装置
液体クロマトグラフ・タンデム型質量分析計(LC―MS／MS)
3．試薬、試液
次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。
スチレンジビニルベンゼン共重合体ミニカラム(500mg) 内径10～12mmのポリエチレン製のカラム管に、スチレンジビニルベンゼン共重合体500mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離特性を有するものを用いる。
セフキノム硫酸塩標準品 本品はセフキノム硫酸塩95％以上を含む。
4．試験溶液の調製
1)抽出
① 筋肉、肝臓、腎臓、乳、卵、魚介類及びはちみつの場合
筋肉、肝臓、腎臓、乳、卵及び魚介類の場合は、試料10.0gを量り採る。はちみつの場合は、試料10.0gを量り採り、水70mLを加えて溶かす。これにアセトニトリル、ギ酸及び水(900：1：100)混液50mL及びn―ヘキサン50mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトニトリル、ギ酸及び水(900：1：100)混液30mL及びn―ヘキサン30mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせた後、下層を分取し、アセトニトリル、ギ酸及び水(900：1：100)混液を加えて正確に200mLとする。この40mLを採り、40℃以下で、はちみつ以外の場合は4mL以下まで、はちみつの場合は18mL以下まで濃縮した後、水20mLを加え超音波処理を行いよく混合する。
② 脂肪の場合
試料5.00gにアセトニトリル、ギ酸及び水(900：1：100)混液50mL及びn―ヘキサン50mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトニトリル、ギ酸及び水(900：1：100)混液30mL及びn―ヘキサン30mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせた後、下層を分取し、アセトニトリル、ギ酸及び水(900：1：100)混液を加えて正確に200mLとする。この80mLを採り、40℃以下で8mL以下まで濃縮した後、水20mLを加え超音波処理を行いよく混合する。
2)精製
スチレンジビニルベンゼン共重合体ミニカラム(500mg)にアセトニトリル及び水各10mLを順次注入し、流出液は捨てる。このカラムに1)で得られた溶液を注入した後、水10mL、アセトニトリル及び水(1：19)混液10mLを順次注入し、流出液は捨てる。次いで、アセトニトリル及び水(1：4)混液10mLを注入し、溶出液にギ酸10μLを加えた後、アセトニトリル及び水(1：4)混液で正確に10mLとしたものを試験溶液とする。
5．検量線の作成
セフキノム標準品のアセトニトリル、ギ酸及び水(200：1：800)混液の溶液を数点調製し、それぞれ5μLをLC―MS／MSに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。なお、本法に従って試験溶液を調製した場合、定量限界に相当する試験溶液中濃度は0.002mg／Lである。
6．定量
試験溶液5μLをLC―MS／MSに注入し、5の検量線でセフキノムの含量を求める。
7．確認試験
LC―MS／MSにより確認する。
8．測定条件
(例)
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル内径2.1mm、長さ150mm、粒子径3μm
カラム温度：40℃
移動相：アセトニトリル及び5mmol／L酢酸アンモニウム溶液(1：9)から(3：7)までの濃度勾配を10分間で行い、(3：7)で2分間保持する。
イオン化モード：ESI(＋)
主なイオン(m／z)：プリカーサーイオン 529、プロダクトイオン 396、134
保持時間の目安：9分
9．定量限界
0.01mg／kg
10．留意事項
1)試験法の概要
セフキノムを試料からn―ヘキサン存在下でアセトニトリル、ギ酸及び水(900：1：100)混液で抽出する。スチレンジビニルベンゼン共重合体ミニカラムで精製した後、LC―MS／MSで定量及び確認する方法である。
2)注意点
①セフキノムはメタノール溶液中で不安定なため留意すること。
②セフキノムのLC―MS／MS測定で、試験法開発時に使用したイオンを以下に示す。
定量イオン(m／z)：プリカーサーイオン 529、プロダクトイオン 134
確認イオン(m／z)：プリカーサーイオン 529、プロダクトイオン 396
③抽出において濃縮後に水20mLを加えて溶解する操作では、食品によっては不溶物が存在するので、セフキノムの溶解を助けるために超音波処理を行いよく混合する。この場合には、スチレンジビニルベンゼン共重合体ミニカラムへの負荷は、懸濁状態で行う。
11．参考文献
なし
12．類型
C
セフチオフル試験法(畜水産物)
1．分析対象化合物
セフチオフル、デスフロイルセフチオフル
2．装置
紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフを用いる。
3．試薬・試液
次に示すもの以外は，総則の3に示すものを用いる。
ジチオエリスリトール ジチオエリスリトール(特級)
ジチオエリスリトール・ホウ酸緩衝液 塩化カリウム3.7g，ジチオエリスリトール4.0g及びホウ酸ナトリウム19.0gを水1,000mlに溶かす。
ヨウ化アセトアミド ヨウ化アセトアミド(1級)
ヨウ化アセトアミド・リン酸緩衝液 ヨウ化アセトアミド7.0gをリン酸緩衝液(pH7)50mlに溶かす。
4．標準品
セフチオフル 本品は塩酸セフチオフル99％以上を含む。
5．標準溶液の調製
a デスフロイル化法
標準品にジチオエリスリトール・ホウ酸緩衝液15mlを加え，50°の水浴中で15分間振とうする。これにヨウ化アセトアミド・リン酸緩衝液3mlを加え，振り混ぜた後，室温で30分間放置する。これに5％リン酸を加えてpH2.5に調整し，4°に冷却する。
b 精製法
オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(1,000mg)に，メタノール5ml及びリン酸緩衝液(pH7)5mlを順次注入し，流出液は捨てる。このカラムにa デスフロイル化法で得られた溶液を注入した後，リン酸緩衝液(pH7)5ml及び0.01mol／l水酸化ナトリウム溶液3mlを順次注入し，流出液は捨てる。このカラムにアセトニトリル及び水の混液(2：8)3mlを注入し，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40°以下でアセトニトリル及び水を除去する。この残留物にアセトニトリル，トリフルオロ酢酸及び水の混液(300：1：700)1.0mlを加えて溶かし，これを標準溶液とする。
6．試験溶液の調製
a 抽出法及びデスフロイル化法
(1) 筋肉，脂肪，肝臓及び腎臓の場合
筋肉の場合は，可能な限り脂肪層を除き，細切均一化した後，その5.00gを量り採る。
脂肪の場合は，可能な限り筋肉層を除き，細切均一化した後，その5.00gを量り採る。
肝臓及び腎臓の場合は，細切均一化した後，その5.00gを量り採る。
これにジチオエリスリトール・ホウ酸緩衝液70mlを加え，細砕した後，毎分3,000回転で10分間遠心分離を行う。水層15mlを採り，50°の水浴中で15分間振とうする。これにヨウ化アセトアミド・リン酸緩衝液3mlを加え，振り混ぜた後，室温で30分間放置する。これに5％リン酸を加えてpH2.5に調整し，4°に冷却した後，上記と同様の条件で遠心分離を行う。水層を採り4°に冷却する。
(2) 乳の場合
試料5.00gを量り採り，ジチオエリスリトール・ホウ酸緩衝液10mlを加え，1mol／l水酸化ナトリウム溶液を加えてpH9.0に調整する。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，毎分3,000回転で10分間遠心分離を行う。水層を採り，50°の水浴中で15分間振とうする。これにヨウ化アセトアミド・リン酸緩衝液3mlを加え，振り混ぜた後，室温で30分間放置する。これに5％リン酸を加えてpH2.5に調整し，4°に冷却した後，上記と同様の条件で遠心分離を行う。水層を採り4°に冷却する。
b 精製法
a 抽出法及びデスフロイル化法で得られた溶液に5．標準溶液の調製のb 精製法と同様の操作を行い，これを試験溶液とする。
7．操作法
a 定性試験
次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準溶液と一致しなければならない。
操作条件
カラム充てん剤 オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)を用いる。
カラム管 内径4.0～6.0mm，長さ150mmのステンレス管を用いる。
カラム温度 40°
検出器 吸光波長266nmで操作する。
移動相 アセトニトリル，トリフルオロ酢酸及び水の混液(300：1：700)を用いる。デスフロイルセフチオフルが約7分で流出する流速に調整する。
b 定量試験
a 定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。
8．定量限界
0.05mg／kg(デスフロイルセフチオフルとして)
9．留意事項
(1) 試験溶液の調製
(1) 精製法において用いるオクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムは，予めデスフロイル化したセフチオフル標準品を用いて，その保持，溶出性能及び精製効果を確認すると伴に，定量限界が0.05mg／kg以下であることを確認すること。
また，セフチオフル標準品を用いて添加・回収試験を行い，オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムの精製効果，回収率(80～110％)を確認すること。
(2) (1)の性能を有するミニカラムが入手困難な場合は，「〇セフチオフル試験法の別法(250ページ参照)」を用いること。
(2) 標準溶液の調製
(1) セフチオフル12.2mgに相当する標準品をメタノールに溶解して100mlとし，セフチオフル標準原液とすること(デスフロイルセフチオフル100mg／l)。本標準原液は，0～4°保存で3か月間安定であること。
(2) セフチオフル各標準原液を水で逓減希釈した後，デスフロイル化法及び精製法により得られた溶液を検量線作成用標準溶液とすること。
10．参考文献
なし
11．類型
A
○セフチオフル試験法の別法
1．～4． (セフチオフル試験法の1．～4．を参照)
5．標準溶液の調製
a デスフロイル化法
標準品にジチオエリスリトール・ホウ酸緩衝液15mlを加え，50°の水浴中で15分間振とうする。これにヨウ化アセトアミド・リン酸緩衝液3mlを加え，振り混ぜた後，室温で30分間放置する。これを，4°に冷却する。
b 精製法
オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(350mg)に，メタノール5ml及びリン酸緩衝液(pH7)5mlを順次注入し，流出液は捨てる。このカラムにa デスフロイル化法で得られた溶液を注入した後，リン酸緩衝液(pH7)5mlを注入し，流出液は捨てる。このカラムにメタノール及び水の混液(2：8)5mlを注入し，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40°以下でメタノール及び水を除去する。この残留物にメタノール及び水の混液(2：8)1.0mlを加えて溶かし，これを標準溶液とする。
6．試験溶液の調製
a 抽出法及びデスフロイル化法
(1) 筋肉，脂肪，肝臓及び腎臓の場合
筋肉の場合は，可能な限り脂肪層を除き，細切均一化した後，その5.00gを量り採る。
脂肪の場合は，可能な限り筋肉層を除き，細切均一化した後，その5.00gを量り採る。
肝臓及び腎臓の場合は，細切均一化した後，その5.00gを量り採る。
これにジチオエリスリトール・ホウ酸緩衝液70mlを加え，細砕した後，毎分3,000回転で10分間遠心分離を行う。水層15mlを採り，50°の水浴中で15分間振とうする。これにヨウ化アセトアミド・リン酸緩衝液3mlを加え，振り混ぜた後，室温で30分間放置する。これを4°に冷却した後，上記と同様の条件で遠心分離を行う。水層を採り4°に冷却する。
(2) 乳の場合
試料5.00gを量り採り，ジチオエリスリトール・ホウ酸緩衝液10mlを加え，1mol／l水酸化ナトリウム溶液を加えてpH9.0に調整する。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，毎分3,000回転で10分間遠心分離を行う。水層を採り，50°の水浴中で15分間振とうする。これにヨウ化アセトアミド・リン酸緩衝液3mlを加え，振り混ぜた後，室温で30分間放置する。これを4°に冷却した後，上記と同様の条件で遠心分離を行う。水層を採り4°に冷却する。
b 精製法
a 抽出法及びデスフロイル化法で得られた溶液に5．標準溶液の調製のb 精製法と同様の操作を行い，これを試験溶液とする。
7．(セフチオフル試験法の7．を参照)
ゼラノール試験法(畜水産物)
1．分析対象化合物
ゼラノール
2．装置
紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ(HPLC―UV)
3．試薬、試液
次に示すもの以外は，総則の3に示すものを用いる。
弱塩基性陰イオン交換樹脂ミニカラム(500mg) 内径8～9mmのポリエチレン製のカラム管に，カラムクロマトグラフィー用に製造したジエチルアミノプロピル化弱塩基性陰イオン交換樹脂500mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離特性を有するものを用いる。
カラムクロマトグラフィー用ヒドロキシプロピル化デキストラン カラムクロマトグラフィー用に製造したヒドロキシプロピル基を化学結合したデキストラン(粒径25～100μm)を用いる。
4．標準品
ゼラノール 本品はゼラノール99％以上を含む。
融点 本品の融点は178～180℃である。
5．試験溶液調製法
1) 抽出
試料5.00gを量り採り、これにアセトニトリル及びメタノール(4：1)混液20mLを加え、ホモジナイズした後、毎分2,600回転で5分間遠心分離し、有機層を採る。残留物にアセトニトリル及びメタノール(4：1)混液20mLを加え、上記と同様の条件で遠心分離を行い、有機層を合わせる。これに水飽和n―ヘキサン20mLを加え、5分間激しく振り混ぜた後、静置し、アセトニトリル層を採る。これに5％硫酸ナトリウム溶液40mL及びジクロロメタン(特級)40mLを加え、5分間激しく振り混ぜた後、静置し、ジクロロメタン層を採る。水層にジクロロメタン(特級)15mLを加え、上記と同様に操作して、ジクロロメタン層を合わせ、40℃以下でジクロロメタンを除去する。この残留物をn―ヘキサン及びベンゼン(3：1)混液1mLに溶かす。
2) 精製
(1) 弱塩基性陰イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー
弱塩基性陰イオン交換樹脂ミニカラム(500mg)に、n―ヘキサン及びベンゼン(3：1)混液6mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに1)で得られた溶液を注入した後、n―ヘキサン及びベンゼン(3：1)2mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムにジクロロメタン(特級)及びメタノール(9：1)混液3mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にベンゼン及びメタノール(17：3)混液0.5mLを加えて溶かす。
(2) ヒドロキシプロピル化デキストランカラムクロマトグラフィー
内径6mmのガラス製カラム管に、カラムクロマトグラフィー用ヒドロキシプロピル化デキストランをベンゼン及びメタノール(17：3)混液に懸濁し、12時間放置したものをカラムクロマトグラフィー用ヒドロキシプロピル化デキストラン層の長さが120mmになるように充てんする。カラムの上端に少量のベンゼン及びメタノール(17：3)混液が残る程度までベンゼン及びメタノール(17：3)混液を流出させる。このカラムに(1)で得られた溶液を注入した後、ベンゼン及びメタノール(17：3)混10mLを注入する。最初の流出液2.0mLを捨て、残りの溶出液を採り、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトニトリル及び水(1：1)混液0.5mLを加えて溶かし、これを試験溶液とする。
6．検量線の作成
ゼラノール標準品の0.01～1mg／Lアセトニトリル及び水(1：1)混液溶液を数点調製し、それぞれ20μLをHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。
7．定量
試験溶液20μLをHPLCに注入し、6の検量線でゼラノールの含量を求める。
8．確認試験
LC／MS又はLC／MS／MSにより確認する。
9．測定条件
カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル 内径4.0～6.0mm、長さ150mm、粒径5μm
カラム温度：40℃
移動相：アセトニトル及び水(5：6)混液 ゼラノールが約10分で流出する流速に調整する。
検出条件：吸光波長230nm
10．定量限界
筋肉 0.002ppm