これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液200mlを入れた500mlの分液漏斗に移す。n―ヘキサン100mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い、洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、n―ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にn―ヘキサン50mlを加え、上記と同様に操作して、n―ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn―ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下でn―ヘキサンを除去する。この残留物にn―ヘキサンを加えて溶かし、正確に10mlとする。

(3)　抹茶及びホップの場合

抹茶の場合は、検体5.00gを量り採り、水20mlを加え、2時間放置する。

ホップの場合は、検体を粉砕した後、その5.00gを量り採り、水20mlを加え、2時間放置する。

これにアセトン及び酢酸の混液(99：1)100mlを加え、3分間細砕した後、ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り、アセトン及び酢酸の混液(99：1)50mlを加え、3分間細砕した後、上記と同様に操作して、ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下で約30mlに濃縮する。

これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液200mlを入れた500mlの分液漏斗に移す。n―ヘキサン100mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い、洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、n―ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にn―ヘキサン50mlを加え、上記と同様に操作して、n―ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn―ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下で約5mlに濃縮し、これにn―ヘキサンを加えて正確に10mlとする。

(4)　抹茶以外の茶の場合

検体9.00gを100°の水540mlに浸し、室温で5分間放置した後、ろ過し、冷後ろ液360mlを500mlの分液漏斗に移す。

これに塩化ナトリウム30g、2％ドデシル硫酸ナトリウム溶液2ml及びn―ヘキサン100mlを加え、振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、n―ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にn―ヘキサン100mlを加え、上記と同様に操作して、n―ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn―ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下でn―ヘキサンを除去する。この残留物にn―ヘキサンを加えて溶かし、正確に6mlとする。

b　エチル化

a　抽出法で得られた溶液1ml(穀類、茶及びホップの場合は、2ml)を50mlの共栓付き試験管に採り、3mol／lエチルマグネシウムブロミド・エーテル溶液1ml(穀類、抹茶、ホップ及び抹茶以外の茶の場合は、2ml)を加え、室温で20分間放置する。

これに0.5mol／l硫酸10mlを徐々に加え、次いで水10mlを加えて混和する。これにn―ヘキサン10mlを加え、1分間激しく振とうする。静置した後、n―ヘキサン層を50mlの三角フラスコに移す。水層にn―ヘキサン5mlを加え、上記と同様の操作を2回繰り返し、n―ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn―ヘキサン5mlを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下で2mlに濃縮する。

c　精製法

内径15mm、長さ300mmのクロマトグラフ管に、カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム5gをn―ヘキサンに懸濁したもの、次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ、カラムの上端に少量のn―ヘキサンが残る程度までn―ヘキサンを流出させる。このカラムにb　エチル化で得られた溶液を注入した後、n―ヘキサン15mlで減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い、洗液をカラムに注入し、流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採る。次いでエーテル及びn―ヘキサンの混液(1：99)50mlを注入し、流出液を上記の減圧濃縮器中に採り、40°以下でエーテル及びn―ヘキサンを除去する。この残留物にn―ヘキサンを加えて溶かし、正確に2mlとして、これを試験溶液とする。

6．操作法

a　定性試験

次の操作条件で試験を行う。試験結果は酸化フェンブタスズ標準溶液について5．試験溶液の調製のb　エチル化と同様に操作して得られたものと一致しなければならない。

操作条件

カラム　内径0.32～0.53mm、長さ30mのケイ酸ガラス製の細管に、ガスクロマトグラフィー用5％フェニル―メチルシリコンを1.5μmの厚さでコーティングしたもの。

カラム温度　120°で2分間保持し、その後毎分10°で昇温する。200°に到達後、毎分20°で昇温し、300°に到達後5分間保持する。

試験溶液注入口温度　280°

検出器　300°で操作する。

ガス流量　キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。酸化フェンブタスズが17～20分で流出する流速に調整する。空気及び水素の流量を至適条件に調整する。

b　定量試験

a　定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき、ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

c　確認試験

a　定性試験と同様の操作条件でガスクロマトグラフィー・質量分析を行う。試験結果は標準品について5．試験溶液の調製のb　エチル化と同様に操作して得られたものと一致しなければならない。また、必要に応じ、ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

7．定量限界

0.05mg／kg

8．留意事項

なし

9．参考文献

なし

10．類型

A

酸化プロピレン試験法(農産物)

1．分析対象化合物

酸化プロピレン

2．装置

パージ・トラップ装置付きガスクロマトグラフ・質量分析計(パージ・トラップGC／MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

サロゲート溶液　メタノールを50～90mL入れた100mL容のメスフラスコに、酸化プロピレン―d610mgを量り採り、メタノールを加えて100mLとしたものをサロゲート原液とする。メタノールを50～80mL入れた100mL容のメスフラスコにサロゲート原液1mLを入れ、メタノールを加えて100mLとしたものをサロゲート溶液(1μg／mL)とする。

酸化プロピレン標準品　本品は酸化プロピレン99％以上を含む。

4．試験溶液の調製

検体を包丁で細切した後、その20.0gを量り採り、サロゲート溶液及び冷却メタノール20mLを加え、容器を氷冷しながらホモジナイズする。毎分3,000回転で10分間遠心分離し、上澄液を50mL容のメスフラスコに採る。沈殿に冷却メタノール20mLを加え、5分間振とうした後、同様に遠心分離し、上澄液を上記のメスフラスコに合わせる。これにメタノールを加えて50mLとする。

パージ容器に水9.8mLに対して抽出液0.2mLの割合になるように、水4.9～49mL及び抽出液0.1～1.0mLを静かに泡立てないように入れ、試験溶液とする。

5．検量線の作成

メタノール30～50mLを入れた100mL容のメスフラスコに、標準品100mgを量り採り、メタノールを加えて100mLとしたものを標準原液とする。標準原液を適宜メタノールで希釈し、試料に添加した量と同量のサロゲート溶液を加えて50mLとしたものを検量線溶液とする。パージ容器に水9.8mLに対して検量線溶液0.2mLの割合になるように水4.9～49mL及び検量線溶液0.1～1.0mLを静かに泡立てないように入れる。パージ容器をパージ・トラップ装置のトラップ部に接続する。パージガスを一定量通気して対象物質を気相中に移動させてトラップ管に捕集する。次にトラップ管を加熱し、対象物質を脱着して冷却凝縮装置で再凝縮させ、GC／MSに導入する。GC／MSによりサロゲート物質と酸化プロピレンの面積比を求め、検量線を作成する。

6．定量

試験溶液(パージ容器)をパージ・トラップ装置のトラップ部に接続する。パージガスを一定量通気して対象物質を気相中に移動させてトラップ管に捕集する。次にトラップ管を加熱し、対象物質を脱着して冷却凝縮装置で再凝縮させ、GC／MSに導入する。GC／MSによりサロゲート物質と酸化プロピレンの面積比を求め、5の検量線で酸化プロピレンの含量を求める。

7．確認試験

GC／MSにより確認する。

8．測定条件

1)　パージ・トラップ装置

パージ時間：4分

パージ温度：室温

ドライパージ時間：3分

トラップ温度：－150℃

トラップ管加熱時間：2分

注入時間：3分

注入温度：180℃

トラップ管焼きだし時間：20分

トラップ管焼きだし温度：200℃

2)　GC／MS

カラム：5％フェニルメチルシリコン、内径0.25mm、長さ30m、膜厚0.25μm

カラム温度：40℃(1分)―3℃／分―80℃―10℃／分―200℃(15分)

注入口温度：120℃

キャリヤーガス：ヘリウム

キャリヤーガス流速：約10分で流出するように流速を調整する。

イオン化モード(電圧)：EI(70eV)

イオン源温度：210℃

主なイオン(m／z)：

酸化プロピレン　57、58

酸化プロピレン―d₆　64

保持時間の目安：10分

9．定量限界

0.02mg／kg

10．留意事項

1)　試験法の概要

細切した試料にサロゲート物質を加え、メタノールで抽出する。抽出液の一部を採り、パージ・トラップGC／MSで測定及び確認する方法である。定量にはサロゲート物質と酸化プロピレンの面積比を用いる。

2)　注意点

(1)　標準溶液は使用時に調製する。ただし、液体窒素あるいはメタノール・ドライアイス等の冷媒で冷却しながらアンプルに移し、冷暗所に保存すれば1～3ヶ月間使用できる。

(2)　抽出時に用いるメタノールはあらかじめ冷蔵しておく。

(3)　パージ・トラップ装置の取扱い説明書に従って操作する。

(4)　冷却凝縮装置で再凝縮を行わない場合は、酸化プロピレンをトラップ管に捕集後、トラップ管を加熱してそのままGC／MSに導入する。

(5)　パージ・トラップの最適条件は使用する吸着剤の種類、量などによって異なるため、あらかじめ充分な回収結果が得られるか確認しておく。また、パージ条件はトラップ管の破過容量を超えないように注意する。

11．参考文献

なし

12．類型

D〔要調査項目等調査マニュアル(平成12年12月　環境庁水質保全局水質管理課)

ii．揮発性有機物質の分析法　p．35～46〕

シアゾファミド試験法(農産物)

1．分析対象化合物

シアゾファミド

2．装置

紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ(HPLC―UV)

液体クロマトグラフ・質量分析計(LC／MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

シアゾファミド標準品　本品はシアゾファミド99％以上を含み、融点は152～153℃である。

4．試験溶液の調製

1)　抽出

穀類及び豆類の場合は、試料10.0gに水20mLを加え、2時間放置する。種実類及び茶の場合は、試料5.00gに水20mLを加え、2時間放置する。果実及び野菜の場合は、試料20.0gを量り採る。その他のハーブの場合は、試料5.00gを量り採る。

これにアセトニトリル100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトニトリル50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、40℃以下で約30mLまで濃縮する。これに10％塩化ナトリウム溶液100mLを加え、n―ヘキサン100mL及び50mLで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にn―ヘキサン5mLを加えて溶かす。

2)　精製

(1)　合成ケイ酸マグネシウムカラムクロマトグラフィー

クロマトグラフ管(内径15mm)に、カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム5gをn―ヘキサンに懸濁させて充てんし、無水硫酸ナトリウム約5gを積層する。このカラムに1)で得られた溶液を注入した後、アセトン及びn―ヘキサン(1：19)混液50mLを注入し、流出液は捨てる。次いで、アセトン及びn―ヘキサン(3：17)混液50mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン5mLを加えて溶かす。

(2)　グラファイトカーボンカラムクロマトグラフィー

グラファイトカーボンミニカラム(500mg)にアセトン10mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに(1)で得られた溶液を注入した後、アセトン5mLを注入する。全溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にエーテル及びn―ヘキサン(3：17)混液5mLを加えて溶かす。

(3)　シリカゲルカラムクロマトグラフィー

シリカゲルミニカラム(690mg)にエーテル及びn―ヘキサン(3：17)混液10mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに(2)で得られた溶液を注入した後、さらに、エーテル及びn―ヘキサン(3：17)混液10mLを注入し、流出液は捨てる。次いで、エーテル及びn―ヘキサン(3：7)混液20mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をアセトニトリルに溶解し、種実類、茶及びその他のハーブの場合は正確に1mL、穀類及び豆類の場合は正確に2mL、果実及び野菜の場合は正確に4mLとしたものを試験溶液とする。

5．検量線の作成

シアゾファミド標準品の0.05～1mg／Lアセトニトリル溶液を数点調製し、それぞれ20μLをHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

6．定量

試験溶液20μLをHPLCに注入し、5の検量線でシアゾファミドの含量を求める。

7．確認試験

LC／MSにより確認する。

8．測定条件

1)　HPLC

検出器：UV(波長280nm)

カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)、内径4.6mm、長さ250mm

カラム温度：40℃

移動相：アセトニトリル及び水(3：2)混液

保持時間の目安：12分

2)　LC／MS

カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)、内径2～2.1mm、長さ150mm

カラム温度：40℃

移動相：0.002mol／L酢酸アンモニウム溶液及びメタノール混液(7：3)から(1：9)までの濃度勾配を8分間で行い、(1：9)で6分間保持する。

イオン化モード：ESI

主なイオン(m／z)：正イオンモード325、負イオンモード216

注入量：1μL

保持時間の目安：14分

9．定量限界

0.01mg／kg

10．留意事項

1)　試験法の概要

シアゾファミドを試料からアセトニトリルで抽出し、n―ヘキサンに転溶する。合成ケイ酸マグネシウムカラム、グラファイトカーボンミニカラム及びシリカゲルミニカラムにより精製し、HPLC―UVで測定し、LC／MSで確認する方法である。

2)　注意点

(1)　標準溶液及び試料溶液中のシアゾファミドは、室温で徐々に分解するため、冷蔵で保存する。

(2)　HPLC測定時において試料由来の夾雑成分のピークが、シアゾファミドの溶出位置に認められた場合、HPLCのカラムを変更することにより、シアゾファミドを試料由来の夾雑成分のピークから分離することができる。通常用いているオクタデシルシリル化シリカゲルからトリアコンチルシリル化シリカゲル(C₃₀)あるいはフェニルシリル化シリカゲル(Ph)などの充てん剤を用いたカラムに変更することが有効である。

(3)　グラファイトカーボンミニカラムクロマトグラフィーは、夾雑物の少ない試料では、省略することもできる。

(4)　精製が不十分な場合、アミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(360mg)による追加精製が可能である。

酢酸及びn―ヘキサン(0.1：100)混液10mLで予備洗浄を行う。試料溶液を酢酸及びn―ヘキサン混液(0.1：100)10mLで負荷し、流出液を捨てた後、エーテル、酢酸及びn―ヘキサン(10：0.1：90)混液30mLで溶出させる。

(5)　シアゾファミドはLC／MSでの測定において正イオンm／z：325［M＋H］^＋または負イオンm／z：216［M－SO₂N(CH₃)₂］^－で測定が可能であるが、後者の方が感度も良く、選択性に優れている。

(6)　HPLC分析において、試料由来の妨害成分の影響等で定量が困難な場合はLC／MSを用いて測定を行う。

11．参考文献

平成13年環境省告示第31号「シアゾファミド試験法」

12．類型

A

シアナジン試験法(農産物)

1．分析対象化合物

シアナジン

2．装置

アルカリ熱イオン化検出器又は高感度窒素・リン検出器付きガスクロマトグラフ及びガスクロマトグラフ・質量分析計を用いる。

3．試薬、試液

総則の3に示すものを用いる。

4．標準品

シアナジン　本品はシアナジン97％以上を含む。

融点　本品の融点は168～169°である。

5．試験溶液の調製

a　抽出法

(1)　穀類及び豆類の場合

検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後、その10.0gを量り採り、水20mlを加え、2時間放置する。

これにアセトン100mlを加え、3分間細砕した後、ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り、アセトン50mlを加え、3分間細砕した後、上記と同様に操作して、ろ液をそのすり合わせ減圧濃縮器中に合わせ、40°以下で約30mlに濃縮する。

これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液100mlを入れた300mlの分液漏斗に移す。酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(1：4)100mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い、洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、酢酸エチル及びn―ヘキサンの層を300mlの三角フラスコに移す。水層に酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(1：4)50mlを加え、上記と同様に操作して、酢酸エチル及びn―ヘキサンの層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いで酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(1：4)20mlを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下で酢酸エチル及びn―ヘキサンを除去する。

この残留物にn―ヘキサン30mlを加え、100mlの分液漏斗に移す。これにn―ヘキサン飽和アセトニトリル30mlを加え、振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、アセトニトリル層をすり合わせ減圧濃縮器中に移す。n―ヘキサン層にn―ヘキサン飽和アセトニトリル30mlを加え、上記と同様の操作を2回繰り返し、アセトニトリル層をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下でアセトニトリルを除去する。この残留物にn―ヘキサン5mlを加えて溶かす。

(2)　野菜の場合

検体約1kgを精密に量り、必要に応じ適量の水を量つて加え、細切均一化した後、検体20.0gに相当する量を量り採る。

これにアセトン100mlを加え、3分間細砕した後、ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り、アセトン50mlを加え、3分間細砕した後、上記と同様に操作して、ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下で約30mlに濃縮する。

これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液100mlを入れた300mlの分液漏斗に移す。酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(1：4)100mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い、洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、酢酸エチル及びn―ヘキサンの層を300mlの三角フラスコに移す。水層に酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(1：4)50mlを加え、上記と同様に操作して、酢酸エチル及びn―ヘキサンの層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いで酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(1：4)20mlを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下で酢酸エチル及びn―ヘキサンを除去する。この残留物にn―ヘキサン5mlを加えて溶かす。

b　精製法

内径15mm、長さ300mmのクロマトグラフ管に、カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム5gをn―ヘキサンに懸濁したもの、次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ、カラムの上端に少量のn―ヘキサンが残る程度までn―ヘキサンを流出させる。このカラムにa　抽出法で得られた溶液を注入した後、アセトン及びn―ヘキサンの混液(1：19)100mlを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトン及びn―ヘキサンの混液(3：7)100mlを注入し、流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り、40°以下でアセトン及びn―ヘキサンを除去する。この残留物にアセトンを加えて溶かし、正確に4mlとして、これを試験溶液とする。

6．操作法

a　定性試験

次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。

操作条件

カラム　内径0.25mm、長さ30mのケイ酸ガラス製の細管に、ガスクロマトグラフィー用50％フェニル―メチルシリコンを0.25μmの厚さでコーティングしたもの。

カラム温度　50°で2分間保持し、その後毎分15°で昇温し、220°に到達後2分間保持する。次に毎分4°で昇温し、240°に到達後2分間保持し、さらに毎分20°で昇温し、280°に到達後10分間保持する。

試験溶液注入口温度　180°

検出器　280°で操作する。

ガス流量　キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。シアナジンが約20分で流出する流速に調整する。空気及び水素の流量を至適条件に調整する。

b　定量試験

a　定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき、ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

c　確認試験

a　定性試験と同様の操作条件でガスクロマトグラフ・質量分析を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。また、必要に応じ、ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

7．定量限界

0.01mg／kg

8．留意事項

試験溶液注入口温度が高いとシアナジンが分解し，複数のピークを与えるため，試験溶液注入口温度を180°とすること。

9．参考文献

なし

10．類型

A

ジアフェンチウロン試験法(農産物)

1．分析対象化合物

ジアフェンチウロン，ジアフェンチウロン尿素体〔1―tert―ブチル―3―(2，6―ジイソプロピル―4―フェノキシフェニル)尿素〕，ジアフェンチウロンメタンイミドアミド体〔1―tert―ブチル―3―(2，6―ジイソプロピル―4―フェノキシフェニル)メタンイミドアミド〕

2．装置

アルカリ熱イオン化検出器又は高感度窒素・リン検出器付きガスクロマトグラフ、紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ、ガスクロマトグラフ・質量分析計及び液体クロマトグラフ・質量分析計を用いる。

3．試薬、試液

次に示すもの以外は，総則の3に示すものを用いる。

0.1mol／l酢酸緩衝液(pH5.0)0.1mol／l酢酸ナトリウム溶液に0.1mol／l酢酸を加えてpH5.0に調整したもの。

ジアフェンチウロン標準溶液　ジアフェンチウロン10.0mgにアセトニトリルを加えて200mlとし、この10mlを採り、アセトニトリル及び水の混液(9：1)を加えて100mlとする。

4．標準品

ジアフェンチウロン標準品　本品はジアフェンチウロン99％以上を含む。

融点　本品の融点は145～148°である。

1―tert―ブチル―3―(2，6―ジイソプロピル―4―フェノキシフェニル)尿素(以下「尿素体」という。)標準品　本品は尿素体97％以上を含む。

融点　本品の融点は180～181°である。

1―tert―ブチル―3―(2，6―ジイソプロピル―4―フェノキシフェニル)メタンイミドアミド(以下「メタンイミドアミド体」という。)標準品　本品はメタンイミドアミド体97％以上を含む。

融点　本品の融点は126～127°である。

5．試験溶液の調製

a　ジアフェンチウロン試験溶液

(1)　抽出法

イ　種実類の場合

検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後、その8.00gを300mlの共栓付き褐色三角フラスコに量り採り、30％L―システイン塩酸塩溶液15ml及び1mol／l炭酸カリウム溶液15mlを加え、2時間放置する。

これにアセトニトリル80mlを加え、30分間振とうした後、ガラス繊維ろ紙を用いて200mlの褐色三角フラスコ中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物をアセトニトリル30mlで洗い、洗液をその褐色三角フラスコ中に合わせ、200mlの共栓付き褐色メスシリンダーに移し、水を加えて200mlとする。この100mlを採り、水40mlを加える。

ロ　果実及び野菜の場合

検体を細切した後、その20.0gを300mlの共栓付き褐色三角フラスコに量り採り、30％L―システイン塩酸塩溶液10ml、1mol／l炭酸カリウム溶液10ml及びアセトニトリル80mlを加え、1分間細砕した後、30分間振とうし、ガラス繊維ろ紙を用いて褐色三角フラスコ中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物をアセトニトリル30mlで洗い、洗液をその褐色三角フラスコ中に合わせ、200mlの共栓付き褐色メスシリンダーに移し、水を加えて200mlとする。この100mlを採り、水40mlを加える。

ハ　茶の場合

検体を粉枠した後、その5.00gを300mlの共栓付き褐色三角フラスコに量り採り、30％L―システイン塩酸塩溶液10ml及び1mol／l炭酸カリウム溶液10mlを加え、2時間放置する。

これにアセトニトリル80mlを加え、30分間振とうした後、ガラス繊維ろ紙を用いて褐色三角フラスコ中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物をアセトニトリル30mlで洗い、洗液をその褐色三角フラスコ中に合わせ、200mlの共栓付き褐色メスシリンダーに移し、水を加えて200mlとする。この80mlを採り、水30mlを加える。

(2)　精製法

イ　種実類、果実及び野菜の場合

シクロヘキシルシリル化シリカゲルミニカラム(1,000mg)をアルミホイルで包み遮光したものに、アセトニトリル10mlを注入し、流出液は捨てる。次いで水10mlを注入し、流出液は捨てる。このカラムに(1)　抽出法で得られた溶液を注入し、流出液は捨てる。アセトニトリル及び水の混液(2：3)10mlを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトニトリル4mlを注入し、流出液を目盛り付き褐色試験管中に採る。これにアセトニトリルを加え、正確に4mlとして、これを試験溶液とする。

ロ　茶の場合

シクロヘキシルシリル化シリカゲルミニカラム(2,000mg)をアルミホイルで包み遮光したものに、アセトニトリル10mlを注入し、流出液は捨てる。次いで水10mlを注入し、流出液は捨てる。このカラムに(1)　抽出法で得られた溶液を注入し、流出液は捨てる。アセトニトリル及び水の混液(2：3)10mlを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトニトリル及び水の混液(4：1)15mlを注入し、流出液を採る。これに水15mlを加える。

アミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(1,000mg)の下にシクロヘキシルシリル化シリカゲルミニカラム(1,000mg)を連結する。これにアセトニトリル10mlを注入し、流出液は捨てる。次いで水10mlを注入し、流出液は捨てる。このカラムに上記溶液を注入し、流出液は捨てる。アセトニトリル及び水の混液(2：3)10mlを注入し、流出液を捨てた後、アミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラムを分離して捨てる。シクロヘキシルシリル化シリカゲルミニカラムにアセトニトリル及び水の混液(1：1)10mlを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトニトリル4mlを注入し、流出液は目盛り付き褐色試験管中に採る。これにアセトニトリルを加え、正確に4mlとして、これを試験溶液とする。

b　尿素体試験溶液

(1)　抽出法

イ　種実類の場合

検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後、その8.00gを300mlの共栓付き褐色三角フラスコに量り採り、30％L―システイン塩酸塩溶液15ml及び1mol／l炭酸カリウム溶液15mlを加え、2時間放置する。

これにアセトニトリル80mlを加え、30分間振とうした後、ガラス繊維ろ紙を用いて褐色三角フラスコ中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物をアセトニトリル30mlで洗い、洗液をその褐色三角フラスコ中に合わせ、200mlの共栓付き褐色メスシリンダーに移し、水を加えて200mlとする。この100mlを採り、水40mlを加える。

ロ　果実及び野菜の場合

検体を細切した後、その20.0gを300mlの共栓付き褐色三角フラスコに量り採り、30％L―システイン塩酸塩溶液10ml、1mol／l炭酸カリウム溶液10ml及びアセトニトリル80mlを加え、1分間細砕した後、30分間振とうし、ガラス繊維ろ紙を用いて褐色三角フラスコ中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物をアセトニトリル30mlで洗い、洗液をその褐色三角フラスコ中に合わせ、200mlの共栓付き褐色メスシリンダーに移し、水を加えて200mlとする。この100mlを採り、水40mlを加える。

ハ　茶の場合

検体を粉砕した後、その5.00gを300mlの共栓付き褐色三角フラスコに量り採り、30％L―システイン塩酸塩溶液10ml及び1mol／l炭酸カリウム溶液10mlを加え、2時間放置する。

これにアセトニトリル80mlを加え、30分間振とうした後、ガラス繊維ろ紙を用いて褐色三角フラスコ中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物をアセトニトリル30mlで洗い、洗液をその褐色三角フラスコ中に合わせ、200mlの共栓付き褐色メスシリンダーに移し、水を加えて200mlとする。この80mlを採り、水30mlを加える。

(2)　精製法

イ　種実類の場合

シクロヘキシルシリル化シリカゲルミニカラム(1,000mg)をアルミホイルで包み遮光したものに、アセトニトリル10mlを注入し、流出液は捨てる。次いで水10mlを注入し、流出液は捨てる。このカラムに(1)　抽出法で得られた溶液を注入し、流出液は捨てる。アセトニトリル及び水の混液(2：3)10mlを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトニトリル4mlを注入し、流出液を目盛り付き褐色試験管中に採る。これにアセトニトリルを加え、4mlとする。この溶液の3mlを褐色すり合わせ減圧濃縮器中に採り、2％ジエチレングリコールのアセトン溶液0.5mlを加え、40°以下でアセトニトリルを除去する。この残留物にエーテル及びn―ヘキサンの混液(3：17)2mlを加えて溶かす。

シリカゲルミニカラム(遮光、690mg)に、n―ヘキサン5mlを注入し、流出液は捨てる。このカラムに上記溶液を注入し、流出液は捨てる。エーテル及びn―ヘキサンの混液(3：17)8mlを注入し、流出液は捨てる。このカラムの下にあらかじめn―ヘキサン5mlを注入し、流出液を捨てたアミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(360mg)を連結する。次いでエーテル及びn―ヘキサンの混液(2：3)20mlをシリカゲルミニカラムに注入し、流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り、40°以下でエーテル及びn―ヘキサンを除去する。この残留物にアセトニトリルを加えて溶かし、正確に2mlとして、試験溶液とする。試験溶液調製後は速やかに測定する。

ロ　果実及び野菜の場合

シクロヘキシルシリル化シリカゲルミニカラム(遮光、1,000mg)にアセトニトリル10mlを注入し、流出液は捨てる。次いで水10mlを注入し、流出液は捨てる。このカラムに(1)　抽出法で得られた溶液を注入し、流出液は捨てる。アセトニトリル及び水の混液(2：3)10mlを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトニトリル4mlを注入し、流出液を目盛り付き褐色試験管中に採る。これにアセトニトリルを加え、4mlとする。この溶液の2mlを褐色すり合わせ減圧濃縮器中に採り、2％ジエチレングリコールのアセトン溶液0.5mlを加え、40°以下でアセトニトリルを除去する。この残留物にエーテル及びn―ヘキサンの混液(3：17)2mlを加えて溶かす。

シリカゲルミニカラム(遮光、690mg)に、n―ヘキサン5mlを注入し、流出液は捨てる。このカラムに上記溶液を注入し、流出液は捨てる。エーテル及びn―ヘキサンの混液(3：17)8mlを注入し、流出液は捨てる。このカラムの下に、あらかじめn―ヘキサン5mlを注入し、流出液を捨てたアミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(360mg)を連結する。次いでエーテル及びn―ヘキサンの混液(2：3)20mlをシリカゲルミニカラムに注入し、流出液を褐色すり合わせ減圧濃縮器中に採り、40°以下でエーテル及びn―ヘキサンを除去する。この残留物にアセトニトリルを加えて溶かし、正確に2mlとして、試験溶液とする。試験溶液調製後は速やかに測定する。

ハ　茶の場合

シクロヘキシルシリル化シリカゲルミニカラム(遮光、2,000mg)にアセトニトリル10mlを注入し、流出液は捨てる。次いで水10mlを注入し、流出液は捨てる。このカラムに(1)　抽出法で得られた溶液を注入し、流出液は捨てる。アセトニトリル及び水の混液(2：3)10mlを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトニトリル及び水の混液(4：1)15mlを注入し、流出液を採る。これに水15mlを加える。

アミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(遮光、1,000mg)の下にシクロヘキシルシリル化シリカゲルミニカラム(遮光、1,000mg)を連結する。これにアセトニトリル10mlを注入し、流出液は捨てる。次いで水10mlを注入し、流出液は捨てる。このカラムに上記溶液を注入し、流出液は捨てる。アセトニトリル及び水の混液(2：3)10mlを注入し、流出液を捨てた後、アミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラムを分離して捨てる。シクロヘキシルシリル化シリカゲルミニカラムにアセトニトリル及び水の混液(1：1)10mlを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトニトリル4mlを注入し、流出液を目盛り付き褐色試験管中に採る。これにアセトニトリルを加え、正確に4mlとする。この溶液の2mlを褐色すり合わせ減圧濃縮器中に採り、2％ジエチレングリコールのアセトン溶液0.5mlを加え、40°以下でアセトニトリルを除去する。この残留物にエーテル及びn―ヘキサンの混液(3：17)2mlを加えて溶かす。

シリカゲルミニカラム(遮光、690mg)に、n―ヘキサン5mlを注入し、流出液は捨てる。このカラムに上記溶液を注入し、流出液は捨てる。エーテル及びn―ヘキサンの混液(3：17)8mlを注入し、流出液は捨てる。このカラムの下に、あらかじめn―ヘキサン5mlを注入し、流出液を捨てたアミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(360mg)を連結する。次いでエーテル及びn―ヘキサンの混液(2：3)20mlをシリカゲルミニカラムに注入し、流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り、40°以下でエーテル及びn―ヘキサンを除去する。この残留物にアセトニトリルを加えて溶かし、正確に2mlとして、試験溶液とする。試験溶液調製後は速やかに測定する。

c　メタンイミドアミド体試験溶液

(1)　抽出法

イ　種実類の場合

検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後、その8.00gを300mlの共栓付き褐色三角フラスコに量り採り、30％L―システイン塩酸塩溶液15ml及び1mol／l炭酸カリウム溶液15mlを加え、2時間放置する。

これにアセトニトリル80mlを加え、30分間振とうした後、ガラス繊維ろ紙を用いて褐色三角フラスコ中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物をアセトニトリル30mlで洗い、洗液をその褐色三角フラスコ中に合わせ、200mlの共栓付き褐色メスシリンダーに移し、水を加えて200mlとする。この100mlを採り、水40mlを加える。

ロ　果実及び野菜の場合

検体を細切した後、その20.0gを300mlの共栓付き褐色三角フラスコに量り採り、30％L―システイン塩酸塩溶液10ml、1mol／l炭酸カリウム溶液10ml及びアセトニトリル80mlを加え、1分間細砕した後、30分間振とうし、ガラス繊維ろ紙を用いて褐色三角フラスコ中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物をアセトニトリル30mlで洗い、ろ液をその褐色三角フラスコ中に合わせ、200mlの共栓付き褐色メスシリンダーに移し、水を加えて200mlとする。この100mlを採り、水40mlを加える。

ハ　茶の場合

検体を粉砕した後、その5.00gを300mlの共栓付き褐色三角フラスコに量り採り、30％L―システイン塩酸塩溶液10ml及び1mol／l炭酸カリウム溶液10mlを加え、2時間放置する。

これにアセトニトリル80mlを加え、30分間振とうした後、ガラス繊維ろ紙を用いて褐色三角フラスコ中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物をアセトニトリル30mlで洗い、洗液をその褐色三角フラスコ中に合わせ、200mlの共栓付き褐色メスシリンダーに移し、水を加えて200mlとする。この80mlを採り、水30mlを加える。

(2)　精製法

オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(遮光、1,000mg)に、アセトニトリル10mlを注入し、流出液は捨てる。次いで水10mlを注入し、流出液は捨てる。このカラムに(1)　抽出法で得られた溶液を注入し、流出液は捨てる。水30mlを注入し、流出液は捨てる。アセトニトリル10mlを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトニトリル及び0.1mol／l酢酸緩衝液(pH5.0)の混液(4：1)20mlを注入し、流出液を100mlの三角フラスコに採る。

この流出液を5％塩化ナトリウム溶液100ml、次いで酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(1：1)50mlで300mlの分液漏斗に移し、振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、酢酸エチル及びn―ヘキサンの層を200mlの三角フラスコに移す。水層に酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(1：1)50mlを加え、上記と同様に操作して、酢酸エチル及びn―ヘキサンの層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いで酢酸エチル及びn―ヘキサンの混液(1：1)20mlを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、2％ジエチレングリコールのアセトン溶液0.5mlを加え、40°以下で酢酸エチル及びn―ヘキサンを除去する。この残留物にアセトンを加えて溶かし、正確に3mlとする。

6．操作法

a　定性試験

(1)　ジアフェンチウロンの試験を行う場合

紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフを用いて、次の操作条件で試験を行う。試験結果はジアフェンチウロン標準溶液と一致しなければならない。

操作条件

カラム充てん剤　オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm、細孔径30nm)を用いる。

クロマトグラフ管　内径6mm、長さ150mmのステンレス管を用いる。

カラム温度　40°

検出器　波長256nmで操作する。

移動相　アセトニトリル、水及びメタノールの混液(2：2：1)を用いる。ジアフェンチウロンが約32分で流出する流速に調整する。

(2)　尿素体の試験を行う場合

紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフを用いて、次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。

操作条件

カラム充てん剤　オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)を用いる。

クロマトグラフ管　内径6mm、長さ150mmのステンレス管を用いる。

カラム温度　40°

検出器　波長235nmで操作する。

移動相　アセトニトリル、水及びメタノールの混液(2：2：1)を用いる。尿素体が約20分で流出する流速に調整する。

(3)　メタンイミドアミド体の試験を行う場合

アルカリ熱イオン化検出器又は高感度窒素・リン検出器付きガスクロマトグラフを用いて、次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。

操作条件

カラム　内径0.25mm、長さ30mのケイ酸ガラス製の細管に、ガスクロマトグラフィー用50％フェニル―メチルシリコンを0.25mmの厚さでコーティングしたもの。

カラム温度　100°で1分間保持し、その後毎分30°で昇温し、280°に到達後4分間保持する。

試験溶液注入口温度　250°

検出器　280°で操作する。

ガス流量　キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。メタンイミドアミド体が約10分で流出する流速に調整する。空気及び水素の流量を至適条件に調整する。

b　定量試験

a　定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき、ジアフェンチウロン、尿素体及びメタンイミドアミド体についてピーク高法又はピーク面積法により定量を行い、それぞれの含量を求め、次式により尿素体及びメタンイミドアミド体を含むジアフェンチウロンの含量を求める。

ジアフェンチウロンの含量(尿素体及びメタンイミドアミド体を含む。)＝A＋B×1.04＋C×1.09

A：ジアフェンチウロンの含量(ppm)

B：尿素体の含量(ppm)

C：メタンイミドアミド体の含量(ppm)

c　確認試験

ジアフェンチウロン及び尿素体の試験溶液について、a　定性試験と同様の操作条件で液体クロマトグラフィー・質量分析を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。また、必要に応じ、ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

メタンイミドアミド体の試験溶液について、a　定性試験と同様の操作条件でガスクロマトグラフィー・質量分析を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。また、必要に応じ、ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

7．定量限界

野菜・果実0.02mg／kg、種実0.04mg／kg、茶0.2mg／kg

8．留意事項

1)　分析値

ジアフェンチウロンは、ジアフェンチウロン並びに尿素体及びメタンイミドアミド体のそれぞれについて定量を行い、尿素体及びメタンイミドアミド体についてはその含量に係数を乗じてジアフェンチウロンの含量に換算し、これらの和を分析値とすること。

2)　ジアフェンチウロンは光及び水中で非常に不安定であり，試験は一部遮光条件下で行うとともに，ロータリーエバポレーターの使用は厳禁であること。また磨砕，細切に関わらず冷凍保存した試料を解凍した後は，再度試験試料に供することはできないこと。磨砕試料中の本薬は経時的に分解が進むため，抽出直前にホモジナイズを行うこと。尿素体及びメタンイミドアミド体の試験溶液は安定であるが，作物によっては本薬の試験溶液は不安定であり，調製後は冷蔵庫に保存し，速やかに測定することが望ましいこと。

9．参考文献

なし

10．類型

A

シアン化水素試験法(農産物)

1．分析対象化合物

シアン化水素

2．装置

シアン化水素水蒸気蒸留装置　図に示すものを用いる。

図

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

塩化ナトリウム　塩化ナトリウム(容量分析用標準試薬)

0.02mol／L硝酸銀標準液　硝酸銀16.99gを水に溶かして1Lとし、0.1mol／L塩化ナトリウム溶液を用いて標定し、これを希釈したもの

炭酸ナトリウム・酢酸鉛試液　炭酸ナトリウム200gと酢酸鉛20gを別々に水に溶かし、混合して1Lとしたもの

4．試験溶液の調製

試料100gをシアン化水素水蒸気蒸留装置の蒸留フラスコ(容量1L)に量り採り、水を加えて約250mLとし、10％酒石酸溶液50mLを加える。冷却器の下端を2.5％水酸化ナトリウム溶液250mLを入れた受器の液中に浸し、蒸留フラスコに水蒸気を送り込み、留出液が400～500mLになるまで蒸留する。受器中の溶液を採り、n―ヘキサン20mLを加え、1分間振とうした後、水層を分取する。更にn―ヘキサン層に水50mLを加え、上記と同様に振とう及び分取を行う。水層を合わせ、これによく振り混ぜた炭酸ナトリウム・酢酸鉛試液を加え、沈殿が生じない場合はそのままこれを試験溶液とする。

沈殿が生じた場合は、ろ紙を用いて吸引ろ過し、必要があれば更に毎分3,000回転で約30分間遠心分離し、上澄み液をろ紙を用いて吸引ろ過し、遠心管内の残留物を蒸留水30mLで洗う。その洗液で、ろ紙上の残留物を洗い、洗液とろ液を合わせてこれを試験溶液とする。

5．定量

4で得られた試験溶液にアンモニア水10mL及び2％ヨウ化カリウム溶液10mLを加えて、0.02mol／L硝酸銀標準液で滴定し、かすかながら消えない濁りが生ずるまでに要した0.02mol／L硝酸銀標準液の量をAmLとする。別に空試験を行い、滴定に要した0.02mol／L硝酸銀標準液の量をBmLとする。シアン化水素の濃度(mg／kg)を次式により算出する。

試料中のシアン化水素の濃度(mg／kg)＝(A－B)(mL)×1.08×1,000／試料重量(g)

6．定量限界

1mg／kg

7．留意事項

1)　試験法の概要

酸性下で水蒸気蒸留し、発生したシアン化水素を水酸化ナトリウム溶液で捕集する。留出液中のシアンイオンを硝酸銀で滴定し、白沈が生じた時点を終点とする。

硝酸銀の添加により、CN－は可溶性のAg(CN)₂－となるが、CN－が消費されるとAgIの沈殿が生じる。

2CN－＋Ag＋→Ag(CN)₂－

8．類型

A(環境省告示「シアン化水素試験法」)

シエノピラフェン試験法(農産物)

1．分析対象化合物

シエノピラフェン

2．装置

液体クロマトグラフ・質量分析計(LC―MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

シエノピラフェン標準品　本品はシエノピラフェン98％以上を含み、融点は107～108℃である。

4．試験溶液の調製

1)　抽出

果実及び野菜の場合は試料20.0gを量り採る。穀類、豆類及び種実類の場合は試料10.0g、茶の場合は試料5.00gにそれぞれ水20mLを加え、30分間放置する。

これにアセトニトリル及び水(4：1)混液100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトニトリル及び水(4：1)混液50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせ、アセトニトリルを加えて正確に200mLとする。この2mL(茶の場合は4mL)を採り、これに水10mLを加えて、40℃以下で約10mLまで濃縮する。

2)　精製

①オクタデシルシリル化シリカゲルカラムクロマトグラフィー及びグラファイトカーボンカラムクロマトグラフィー

オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(1,000mg)にアセトニトリル及び水各5mLを順次注入し、流出液は捨てる。グラファイトカーボンミニカラム(500mg)にアセトニトリル及び水(4：1)混液5mLを注入し、流出液は捨てる。オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムに、1)で得られた溶液を注入した後、さらにアセトニトリル及び水(3：2)混液10mLを注入し、流出液は捨てる。次いでこのカラムの下部にグラファイトカーボンミニカラムを接続し、アセトニトリル及び水(4：1)混液15mLを注入する。溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物に酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：19)混液5mLを加えて溶かす。

②シリカゲルカラムクロマトグラフィー

シリカゲルミニカラム(690mg)に酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：19)混液5mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに①で得られた溶液を注入した後、さらに酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：19)混液5mLを注入し、流出液は捨てる。次いで酢酸エチル及びn―ヘキサン(1：4)混液10mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をアセトニトリル及び水(3：1)混液に溶解し、果実及び野菜の場合は正確に4mL、穀類、豆類、種実類及び茶の場合は正確に2mLとしたものを試験溶液とする。

5．検量線の作成

シエノピラフェン標準品の0.0005～0.01mg／L溶液(アセトニトリル及び水(3：1)混液)を数点調製し、それぞれ5μLをLC―MSに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

6．定量

試験溶液5μLをLC―MSに注入し、5の検量線でシエノピラフェンの含量を求める。

7．確認試験

LC―MSにより確認する。

8．測定条件

(例)

カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル　内径2.1mm、長さ150mm、粒子径5μm

カラム温度：40℃

移動相：A液及びB液の混液(1：3)で15分間保持した後、(1：19)までの濃度勾配を0.5分間で行い、(1：19)で8分間保持する。

A液：0.1vol％ギ酸

B液：0.1vol％ギ酸・アセトニトリル溶液

イオン化モード：ESI(＋)

主なイオン(m／z)：395、394

保持時間の目安：11分

9．定量限界

0.01mg／kg

10．留意事項

1)　試験法の概要

シエノピラフェンを試料からアセトニトリル及び水(4：1)混液で抽出し、オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム、グラファイトカーボンミニカラム及びシリカゲルミニカラムで精製した後、LC―MSで定量及び確認する方法である。

2)　注意点

①みかんの果皮を試験する場合は、試料10.0gを用いて抽出し、試験溶液量を2mLとする。

②シエノピラフェンのLC―MS測定で、試験法開発時に使用したイオンを以下に示す。

定量イオン(m／z)：394

定性イオン(m／z)：395

11．参考文献

なし

12．類型

C

ジクラズリル及びナイカルバジン試験法(畜水産物)

1．分析対象化合物

2．装置

紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフを用いる。

3．試薬・試液

総則の3に示すものを用いる。

4．標準品

ジクラズリル　本品はジクラズリル99％以上を含む。

分解点　本品の分解点は295°である。

ナイカルバジン　本品はN，N’―ビス―(4―ニトロフェニル)ウレア70～72％を含む。

分解点　本品の分解点は265～275°である。

5．試験溶液の調製

a　抽出法

筋肉の場合は，可能な限り脂肪層を除き，細切均一化した後，その5.00gを量り採る。

脂肪の場合は，可能な限り筋肉層を除き，細切均一化した後，その5.00gを量り採る。

肝臓及び腎臓の場合は，細切均一化した後，その5.00gを量り採る。

これにアセトニトリル30ml，アセトニトリル飽和n―ヘキサン20ml及び無水硫酸ナトリウム10gを加え，細砕した後，毎分3,000回転で5分間遠心分離を行い，アセトニトリル層をすり合わせ減圧濃縮器中に移す。遠心分離管のn―ヘキサン層及び残留物にアセトニトリル20mlを加え，振とう機を用いて1分間激しく振り混ぜた後，上記と同様の条件で遠心分離を行い，アセトニトリル層をそのすり合わせ減圧濃縮器中に合わせる。n―プロパノール10mlを加え，40°以下でアセトニトリル及びn―プロパノールを除去する。残留物にメタノール3mlを加えて溶かし，0.05mol／lリン酸一ナトリウム7mlを加えて溶かす。

b　精製法

オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(500mg)に，メタノール10ml及び0.05mol／lリン酸一ナトリウム10mlを順次注入し，流出液は捨てる。このカラムにa　抽出法で得られた溶液を注入した後，メタノール及び0.05mol／lリン酸一ナトリウムの混液(3：7)10mlを注入し，流出液は捨てる。このカラムに水及びメタノールの混液(1：4)10mlを注入し，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40°以下でメタノールを除去する。この残留物にメタノール1.0mlを加えて溶かし，これを試験溶液とする。

6．操作法

a　定性試験

次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。

操作条件

カラム充てん剤　オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)を用いる。

カラム管　内径4.0～6.0mm，長さ150mmのステンレス管を用いる。

カラム温度　40°

検出器　ジクラズリルの試験を行う場合は，吸光波長275nmで操作する。ナイカルバジンの試験を行う場合は，吸光波長350nmで操作する。

移動相　アセトニトリル及び0.025mol／lリン酸一ナトリウム溶液の混液(1：1)を用いる。ジクラズリルの試験を行う場合は，ジクラズリルが約8分で流出する流速に調整する。ナイカルバジンの試験を行う場合は，N，N’―ビス―(4―ニトロフェニル)ウレアが約6分で流出する流速に調整する。

b　定量試験

a　定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

7．定量限界

ジクラズリル　0.1mg／kg

ナイカルバジン　0.02mg／kg(N，N’―ビス―(4―ニトロフェニル)ウレアとして)

8．留意事項

(1)　試験溶液の調製

精製法において用いるオクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムは，予めジクラズリル及びナイカルバジン標準品を用いて，その保持及び溶出性能を確認すること。

(2)　標準溶液の調製

(1)　ジクラズリル10.0mgに相当する標準品をN，N―ジメチルホルムアミド　10mlに溶解後，メタノールを加えて100mlとし，ジクラズリル標準原液とすること(ジクラズリル100mg／l)。本標準原液は，0～4°保存で3ヶ月間安定であること。

(2)　N，N―ビス―(4―ニトロフェニル)ウレア10.0mgに相当するナイカルバジン標準品をN，N―ジメチルホルムアミド10mlに溶解後，アセトニトリルを加えて200mlとし，ナイカルバジン標準原液とすること(N，N―ビス―(4―ニトロフェニル)ウレア50mg／l)。本標準原液は，0～4°保存で1ヶ月間安定であること。

(3)　ジクラズリル及びナイカルバジン各標準原液をメタノールで逓減希釈し，検量線作成用標準溶液とすること。

(3)　その他

本試験法によりジクラズリル及びナイカルバジンが検出された場合には，紫外可視多波長検出器及び質量検出器付き高速液体クロマトグラフを用いて確認することが望ましいこと。

9．参考文献

なし

10．類型

A

シクロキシジム試験法(農産物)

1．分析対象化合物

シクロキシジム

2．装置

炎光光度型検出器(硫黄用干渉フィルター、波長394nm)付きガスクロマトグラフ及びガスクロマトグラフ・質量分析計を用いる。

3．試薬、試液

総則の3に示すものを用いる。

4．標準品

シクロキシジム　本品はシクロキシジム99％以上を含む。

融点　本品の融点は37°である。

5．試験溶液の調製

a　抽出法

豆類及び種実類の場合は、検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後、その10.0gを量り採り、水20mlを加え、2時間放置する。

果実及び野菜の場合は、検体約1kgを精密に量り、必要に応じ適量の水を量つて加え、細切均一化した後、検体20.0gに相当する量を量り採る。

これにイソプロパノール100mlを加え、3分間細砕した後、ろ紙を用いて共栓付き三角フラスコ中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り、イソプロパノール及び水の混液(7：3)50mlを加え、3分間細砕した後、上記と同様に操作して、ろ液をその共栓付き三角フラスコ中に合わせる。

これに水酸化カルシウム5gを加え、振とう機を用いて10分間激しく振りまぜた後、10分間静置し、ろ紙を用いてナス型フラスコ中に吸引ろ過する。次いで、イソプロパノール及び水の混液(7：3)10mlを用いて、共栓付き三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を3回繰り返す。洗液をナス型フラスコ中に合わせる。

b　酸化

これに20％水酸化カリウム溶液30mlを加え、還流冷却器を付け、ホットプレート上で加熱還流する。10分間沸騰後、過酸化水素4mlを還流冷却器上から加える操作を3回繰り返し、沸騰させる。10分間沸騰後、ナス型フラスコを還流冷却器からはずし、ナス型フラスコ中の溶液のpHが12以上であることを確認する。pHが12以下の場合は、20％水酸化カリウム溶液を加え、pH12以上とする。次いで、ヨウ化カリウム・デンプン紙に6mol／l塩酸1滴を滴下し、ナス型フラスコ中の溶液1滴を滴下するとき、ヨウ化カリウム・デンプン紙が直ちに深青色になることを確認する。深青色とならない場合は、ナス型フラスコを還流冷却器につけ、過酸化水素5mlを還流冷却器上から加え、ホットプレート上で10分間沸騰させ、上記と同様の操作を行い、ヨウ化カリウム・デンプン紙が深青色となることを確認する。

pH及びヨウ化カリウム・デンプン紙の反応を確認後、ナス型フラスコを再び還流冷却器に付け、ホットプレート上で更に50分間沸騰させる。

c　活性炭への吸着

放冷後、6mol／l塩酸を用いてナス型フラスコ中の溶液をpH7付近にし、次いで亜硫酸カリウム4gを加え、振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、20％水酸化カリウム溶液を用いてpH12以上にする。これを、あらかじめ塩化ナトリウム35gを入れた500mlの分液漏斗に移す。水20mlを用いて上記のナス型フラスコを洗い、洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて、5分間激しく振り混ぜた後、静置し、水層を500mlのナス型フラスコに移す。イソプロパノール層に飽和塩化ナトリウム溶液30mlを加え、上記と同様に操作して水層をナス型フラスコ中に合わせる。6mol／l塩酸を用いて上記のナス型フラスコ中の溶液をpH1付近にし、70°で濃縮してイソプロパノールを完全に除去する。放冷後、ナス型フラスコ中の溶液に不溶の塩がある場合は、適量の水を加え、完全に溶解する。これに活性炭5gを加え、振とう機を用いて10分間激しく振り混ぜた後、ろ紙を用いて吸引ろ過する。水40mlを用いてナス型フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を3回繰り返した後、5分間強く吸引する。次いでn―ヘキサン100mlでろ紙上の残留物を洗つた後、5分間強く吸引する。

d　メチル化

ろ紙上の残留物を200mlのナス型フラスコに移し、メタノール40ml、硫酸10ml、オルトギ酸トリメチル13ml、ペルオキソ二硫酸カリウム1gを加える。これに、還流冷却器を付け、ホットプレート上で加熱還流し、沸騰させる。1時間沸騰後、熱時にろ紙を用いて三角フラスコ中に吸引ろ過する。次いで、メタノール25mlを用いて、ナス型フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。更に、ギ酸及びメタノールの混液(1：9)50mlを用いて、ナス型フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液を上記の三角フラスコに合わせ、これをあらかじめ水300mlを入れた1,000mlの分液漏斗に移す。クロロホルム100mlを用いて、上記の三角フラスコを洗い、洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、クロロホルム層をあらかじめ飽和炭酸水素ナトリウム溶液50mlを入れた300mlの分液漏斗に移す。水層にクロロホルム50mlを加え、上記と同様に操作して、クロロホルム層を上記の分液漏斗に合わせる。この分液漏斗を振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、クロロホルム層を、グラスウールをつめ、無水硫酸ナトリウム約50gを充てんした直径9cmの漏斗に注入し、流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採る。分液漏斗の水層にクロロホルム30mlを加え、上記と同様に操作して、クロロホルム層を漏斗に注入して流出液を上記のすり合わせ減圧濃縮器中に合わせ、40°以下でクロロホルムを除去する。この残留物にアセトン及びヘキサンの混液(1：3)10mlを加えて溶かす。

e　精製法

内径15mm、長さ300mmのクロマトグラフ管にカラムクロマトグラフィー用シリカゲル(粒径63～200μm)10gをアセトン及びn―ヘキサンの混液(1：3)に懸濁したもの、次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ、カラムの上端に少量のアセトン及びn―ヘキサンの混液(1：3)が残る程度までアセトン及びn―ヘキサンの混液(1：3)を流出させる。このカラムにd　メチル化で得られた溶液を注入した後、アセトン及びn―ヘキサンの混液(1：3)200mlを注入し、最初の80mlは捨てる。次の流出液120mlをすり合わせ減圧濃縮器中に採り、40°以下でアセトン及びn―ヘキサンを除去する。この残留物にアセトンを加えて溶かし、正確に0.5mlとして、これを試験溶液とする。

f　検量線

シクロキシジム2～16μgを採り、これにイソプロパノール及び水の混液(7：3)180mlを加え、b　酸化、c　活性炭への吸着、d　メチル化及びe　精製法と同様に操作する。

6．操作法

a　定性試験

次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品について5．試験溶液の調製b　酸化、c　活性炭への吸着、d　メチル化及びe　精製法と同様に操作して得られたものと一致しなければならない。

操作条件

カラム　内径0.25mm、長さ30mのケイ酸ガラス製の細管に、ガスクロマトグラフィー用メチルシリコンを0.25μmの厚さでコーティングしたもの。

カラム温度　60°で3分間保持し、その後毎分20°で昇温し、260°に到達後5分間保持する。

試験溶液注入口温度　260°

検出器　280°で操作する。

ガス流量　キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。シクロキシジムの分解・酸化・メチル化体が約15分で流出する流速に調整する。空気及び水素の流量を至適条件に調整する。

b　定量試験

a　定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき、ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

c　確認試験

a　定性試験と同様の操作条件でガスクロマトグラフィー・質量分析を行う。試験結果は標準品について5．試験溶液の調製b　酸化、c　活性炭への吸着、d　メチル化及びe　精製法と同様に操作して得られたものと一致しなければならない。また、必要に応じ、ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

7．定量限界

0.05mg／kg

8．留意事項

活性炭に吸着させる際には，イソプロパノールを完全に除去すること。また，メチル化は水を完全に除去して実施すること。

9．参考文献

なし

10．類型

A

ジクロシメット試験法(農産物)

1．分析対象化合物

ジクロシメット〔(R)―2―シアノ―N―［(R)―1―(2，4―ジクロロフェニル)エチル］―3，3―ジメチルブチラミド及び(S)―2―シアノ―N―［(R)―1―(2，4―ジクロロフェニル)エチル］―3，3―ジメチルブチラミド〕

2．装置

アルカリ熱イオン化検出器付きガスクロマトグラフ(GC(FTD))又は高感度窒素・リン検出器付きガスクロマトグラフ(GC(NPD))

ガスクロマトグラフ・質量分析計(GC／MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

ジクロシメット標準品　本品はジクロシメット99％以上を含む。

4．試験溶液調製法

1)　抽出

試料10.0gを量り採り、水20mLを加え、2時間放置する。

これにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトン50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過を行う。得られたろ液を合わせ、40℃以下で約30mLに濃縮する。これに10％塩化ナトリウム溶液100mLを加え、n―ヘキサン100mL及び50mLで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。

この残留物にn―ヘキサン30mLを加え、n―ヘキサン飽和アセトニトリル30mLずつで3回振とう抽出する。抽出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン・n―ヘキサン混液(1：19)5mLを加えて溶かす。

2)　精製

クロマトグラフ管(内径15mm)にカラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム5gをn―ヘキサンに懸濁させて充てんし、上に無水硫酸ナトリウム約5gを積層する。このカラムに1)で得られた溶液を注入し、流出液は捨てる。さらに、アセトン・n―ヘキサン混液(1：19)40mLを注入し、流出液は捨てる。次いで、アセトン・n―ヘキサン混液(3：17)40mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をアセトンに溶解し、正確に2mLとしたものを試験溶液とする。

5．検量線の作成

ジクロシメット標準品の0.05～2mg／Lアセトン溶液を数点調製し、それぞれ1μLをGCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

6．定量

試験溶液1μLをGCに注入し、5の検量線でジクロシメットの含量を求める。

7．測定条件

1)　GC

検出器：FTD又はNPD

カラム：5％フェニル―メチルシリコン　内径0.53mm、長さ15m、膜厚1.5μm

カラム温度：60℃(2分)―10℃／分―280℃(10分)

注入口温度：250℃

検出器温度：250℃

キャリヤーガス：ヘリウム

保持時間の目安：

ジクロシメット(RR)20.4分

ジクロシメット(SR)20.7分

2)　GC／MS

カラム：5％フェニル―メチルシリコン　内径0.32mm、長さ30m、膜厚0.25μm

カラム温度：60℃(2分)―10℃／分―300℃(10分)

注入口温度：320℃

キャリヤーガス：ヘリウム

イオン化電圧：EI(70eV)

主なイオン：m／z　173、277、221、175、102、174

保持時間の目安：

ジクロシメット(RR)13.9分

ジクロシメット(SR)14.1分

8．定量限界

0.01mg／kg

9．留意事項

1)　試験法の概要

ジクロシメットを試料からアセトンで抽出し、n―ヘキサンに転溶する。

アセトニトリル／ヘキサン分配で脱脂した後、合成ケイ酸マグネシウムカラムで精製し、GC(FTD)又はGC(NPD)で測定し、GC／MSで確認する方法である。

2)　注意点

(1)　ジクロシメットには2つの不斉炭素があり4種の光学異性体が存在する。そのうち有効成分はRR体及びSR体であり、市販されている標準品及び農薬市場流通品は、ほとんどこの2種により構成されている。

(2)　和光純薬、林純薬及び関東化学から販売されているジクロシメット標準品は、いずれも2種(RR及びSR)の立体異性混合物であり、それらの比はほぼ1：1である。

10．参考文献

平成12年環境庁告示第32号「ジクロシメット試験法」

11．類型

C

シクロスルファムロン試験法(農産物)

1．分析対象化合物

シクロスルファムロン

2．装置

紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ及び液体クロマトグラフ・質量分析計を用いる。

3．試薬、試液

総則の3に示すものを用いる。

4．標準品

シクロスルファムロン　本品はシクロスルファムロン99％以上を含む。