◎化合物名の五十音順に示し、異性体は保持時間順に示した。

◎相対保持時間はイソキサフルトール(保持時間15―18分)を1とした相対値であり、2機関で求めた値の平均値を示した。

◎測定イオンの太字斜字体は定量イオン、その他は定性イオンを示す。

◎測定限界は標準溶液をLC／MSまたはLC／MS／MSに注入したときのS／N＝10の値であり、LC／MSは1機関で求めた値、LC／MS／MSは1～2機関で求めた値の小さい方の値を示した。

◎本法に従って試験溶液を調製し、5μLをLC／MS(／MS)に注入した場合^＊1、0.05ngが試料中0.01ppmに相当する。

＊1　試料5g相当量を用いて試験溶液(最終液量5mL)を調製した場合。

アセタミプリド試験法(農産物)

1．分析対象化合物

アセタミプリド

2．装置

アルカリ熱イオン化検出器又は高感度窒素・リン検出器付きガスクロマトグラフ及びガスクロマトグラフ・質量分析計を用いる。

3．試薬、試液

総則の3に示すものを用いる。

4．標準品

アセタミプリド　本品はアセタミプリド99％以上を含む。

5．試験溶液の調製

a　抽出法

①　果実，野菜及び抹茶の場合

果実及び野菜の場合は，検体約1kgを精密に量り，必要に応じ適量の水を量つて加え，細切均一化した後，検体20.0gに相当する量を量り採る。

抹茶の場合は，検体5.00gを量り採り，水20mlを加え，2時間放置する。

これにアセトン100mlを加え，3分間細砕した後，ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り，アセトン50mlを加え，3分間細砕した後，上記と同様に操作してろ液をその減圧濃縮器中に合わせ，40℃以下で約30mlに濃縮する。

これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液100mlを入れた300mlの分液漏斗に移す。酢酸エチル100mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い，洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，酢酸エチル層を300mlの三角フラスコに移す。水層に酢酸エチル50mlを加え，上記と同様に操作して，酢酸エチル層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いで酢酸エチル20mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ，40℃以下で酢酸エチルを除去する。この残留物にn―ヘキサン10mlを加え，40℃以下でn―ヘキサンを除去する。この残留物にアセトン及びn―ヘキサンの混液(3：7)2mlを加えて溶かす。

②　抹茶以外の茶の場合

検体9.00gを100℃の水540mlに浸し，室温で5分間放置した後，ろ過し，冷後ろ液360mlを500mlの三角フラスコに移す。これに飽和酢酸鉛溶液2mlを加え，室温で1時間放置した後，ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いて吸引ろ過し，ろ液を1,000mlの分液漏斗に移す。次いで水50mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗い，洗液を上記の分液漏斗に合わせる。これに塩化ナトリウム25g及び酢酸エチル100mlを加え，振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後，静置し，酢酸エチル層を300mlの三角フラスコに移す。水層に酢酸エチル100mlを加え，上記と同様に操作して，酢酸エチル層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いで酢酸エチル20mlを用いて三角フラスコを洗い，その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ，40℃以下で酢酸エチルを除去する。この残留物にn―ヘキサン10mlを加え，40℃以下でn―ヘキサンを除去する。この残留物にアセトン及びn―ヘキサンの混液(3：7)2mlを加えて溶かす。

b　精製法

内径15mm，長さ300mmのクロマトグラフ管に，カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム5gをアセトン及びn―ヘキサンの混液(3：7)に懸濁したもの，次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ，カラムの上端に少量のアセトン及びn―ヘキサンの混液(3：7)が残る程度までアセトン及びn―ヘキサンの混液(3：7)を流出させる。このカラムにa　抽出法で得られた溶液を注入した後，アセトン及びn―ヘキサンの混液(3：7)50mlを注入し，流出液は捨てる。次いでアセトン及びn―ヘキサンの混液(1：1)150mlを注入し，流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40℃以下でアセトン及びn―ヘキサンを除去する。この残留物にアセトンを加えて溶かし，正確に5mlとして，これを試験溶液とする。

6．操作法

a　定性試験

次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。

操作条件

カラム　内径0.53mm，長さ30mのケイ酸ガラス製の細管に，ガスクロマトグラフィー用5％フェニル―メチルシリコンを1.5μmの厚さでコーティングしたもの。

カラム温度　60℃で2分間保持し，その後毎分20℃で昇温し，160℃に到達後1分間保持する。次に毎分10℃で昇温し，200℃に到達後1分間保持する。さらに毎分3℃で昇温し，230℃に到達後1分間保持し，その後毎分5℃で昇温し，260℃に到達後15分間保持する。

試験溶液注入口温度　260℃

検出器　260℃で操作する。

ガス流量　キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。アセタミプリドが約33分で流出する流速に調整する。空気及び水素の流量を至適条件に調整する。

b　定量試験

a　定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

c　確認試験

a　定性試験と同様の操作条件でガスクロマトグラフィー・質量分析を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。また，必要に応じ，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

7．定量限界

0.01mg／kg

8．留意事項

なし

9．参考文献

なし

10．類型

A

ピリチオバックナトリウム塩試験法(農産物)

1．分析対象化合物

ピリチオバックナトリウム塩

2．装置

カラムスイッチングシステム及び紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ(HPLC―UV(カラムスイッチング))

液体クロマトグラフ・質量分析計(LC／MS)又は液体クロマトグラフ・タンデム型質量分析計(LC／MS／MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

0.03mol／Lリン酸緩衝液(pH3.0)　リン酸二水素カリウム7.21g、アジ化ナトリウム0.2g及びリン酸0.40mLに水を加えて2,000mLとし、リン酸又は50％水酸化ナトリウム溶液を加えてpH3.00に調整する。

水(pH2.4)　水にリン酸を加えてpH2.40(±0.05)に調整する。

オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(2,000mg)　内径12～13mmのポリエチレン製のカラム管に、オクタデシルシリル化シリカゲル2,000mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離性能を有するものを用いる。

トリメチルアミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(5,000mg)　内径19mmのポリエチレン製のカラム管に、トリメチルアミノプロピルシリル化シリカゲル5,000mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離性能を有するものを用いる。

4．試験溶液の調製

1)　抽出

試料5.00gにアセトニトリル及び0.01mol／L炭酸アンモニウム溶液(2：1)混液100mLを加え、ホモジナイズした後、3,000回転で15分間遠心分離する。

上澄液60mLを採り、これにジクロロメタン50mLを加え、振とうした後、ジクロロメタン層は捨てる。水層に塩化ナトリウム0.05g及びジクロロメタン50mLを加え、振とうした後、ジクロロメタン層は捨てる。

2)　精製

①　トリメチルアミノプロピルシリル化シリカゲルカラムクロマトグラフィー

トリメチルアミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(5,000mg)にメタノール20mL、水20mL及び0.01mol／L炭酸アンモウム溶液20mLを順次注入し、各流出液は捨てる。このカラムに1)で得られた水層を注入した後、0.01mol／L炭酸アンモニウム溶液5mLを注入し、各流出液は捨てる。

②　オクタデシルシリル化シリカゲルカラムクロマトグラフィー

オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(2,000mg)にメタノール5mL及び水10mLを順次注入し、各流出液は捨てる。次いで1mol／Lクエン酸カリウム溶液及びメタノール(3：1)混液20mLを注入し、カラムの上に同混液約10mLが残るまで流出させ、流出液は捨てる。このカラムを、①のミニカラムの下に連結し、①のミニカラムに1mol／Lクエン酸カリウム溶液及びメタノール(3：1)混液20mLを注入し、流出液を捨て、更に10分間通気して脱水する。

①のミニカラムを捨て、オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムに水10mL、水(pH2.4)10mL及び30％メタノール含有水(pH2.4)10mLを順次注入し、各流出液を捨て、更に15分間通気して脱水する。次いで、メタノール10mLを注入し、溶出液を50℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をアセトニトリル及び0.03mol／Lリン酸緩衝液(28：72)混液0.5mLに溶解したものを試験溶液とする。

5．検量線の作成

ピリチオバックナトリウム塩標準品をメタノールに溶解して標準原液を調製し、アセトニトリル及び0.03mol／Lリン酸緩衝液(28：72)混液で希釈して、0.03～0.8mg／Lの標準溶液を数点調製し、それぞれ100μLをHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法により検量線を作成する。

6．定量

試験溶液100μLをHPLC又はLC／MS(LC／MS／MS)に注入し、5の検量線でピリチオバックナトリウム塩の含量を求める。

7．確認試験

LC／MS(LC／MS／MS)により確認する。

8．測定条件

HPLC(カラムスイッチング方式)

検出器：UV(波長254nm)

カラム①：シアノプロピルシリル化シリカゲル(粒径5μm)　内径4.0mm、長さ150mm

カラム②：オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)、内径4.6mm、長さ250mm

カラム温度：40℃

移動相：

A：アセトニトリル、B：0.03mol／Lリン酸緩衝液(pH3.0)、C：水

カラム①とカラム②を離した状態で、試験溶液を注入後、A28％、B72％、流速1mL／分で操作し、ピリチオバックナトリウム塩の保持時間直前(注入から8～10分後)にカラム①とカラム②をつなぎ、ピリチオバックナトリウム塩をカラム①からカラム②に移す。

ピリチオバックナトリウム塩がカラム②に移動した後、カラム①とカラム②を切り離し、カラム①をA75％、C25％、流速2mL／分で5分間洗浄する。次いで、A43％、B57％、流速2mL／分で10分間調整した後、同移動相、流速1mL／分で1分間調整する。

再びカラム①とカラム②をつなぎ、A43％、B57％、流速1mL／分で操作し、ピリチオバックナトリウム塩を溶出させる。

次いで、両カラムをA75％、C25％、流速1mL／分で15分間洗浄した後、A43％、B57％、流速1mL／分で調整する。

カラム①とカラム②を離し、カラム①をA28％、B72％、流速2mL／分で5分間調整した後、流速1mL／分で1分間調整する。

注入量：100μL

保持時間の目安：37分

LC／MS／MS

カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)　内径4.6mm、長さ150mm

カラム温度：30℃

移動相：A液及びB液について下の表の濃度勾配で送液する。

A液：1％酢酸

B液：アセトニトリル

流量：1.0mL／分

イオン化モード：APCI

主なイオン(m／z)：ESI(＋)　プリカーサーイオン327、プロダクトイオン309

注入量：100μL

保持時間の目安：15分

9．定量限界

0.01mg／kg

10．留意事項

1)　試験法の概要

試料からピリチオバックナトリウム塩をアセトニトリル及び0.01mol／L炭酸アンモニウム溶液(2：1)混液で抽出し、ジクロロメタンで洗浄した後、トリメチルアミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラム及びオクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムで精製し、カラムスイッチングシステム付きHPLC―UV又はLC／MS(LC／MS／MS)で測定し、LC／MS(LC／MS／MS)で確認する方法である。

2)　注意点

①　本法はDuPont社が開発した、綿実を対象とした試験法である。Sumpter，S．R．らの方法ではカラムスイッチングシステム付きHPLCで測定している。LC／MS／MSの条件は、Bramble，F．Q．らの報告を引用した。

②　0.03mol／Lリン酸緩衝液(pH3.0)は毎日使用前に0.45μmのフィルターでろ過する

③　試験溶液の調製時は、アセトニトリル及び0.03mol／Lリン酸緩衝液(28：72)混液に溶解する前の状態で冷蔵保存可能である。

11．参考文献

Bramble,F.Q.ら，Analytical method for the determination of pyrithiobac sodium in cotton gin trash using ASE extraction and LC／MS／MS analysis,DuPont社報告、

http://www.epa.gov/oppbead1/methods/rammethods/2001_035M.tif

12．類型

D(Sumpter,S.R.ら，Improved analytical enforcement method for the determination of KIH―2031(DPX―PE350) residues in cottonseed using column－switching liquid chromatography、DuPont社報告、

http://www.epa.gov/oppbead1/methods/rammethods/1994_001M.tif)

ベンチアバリカルブイソプロピル試験法(農産物)

1．分析対象化合物

ベンチアバリカルブイソプロピル

2．装置

液体クロマトグラフ・質量分析計(LC／MS)又は液体クロマトグラフ・タンデム型質量分析計(LC／MS／MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。

ベンチアバリカルブイソプロピル標準品　本品はベンチアバリカルブイソプロピル98％以上を含み、融点は152℃である。

4．試験溶液の調製

1)　抽出

①　穀類、豆類及び種実類の場合

試料10.0gに水20mLを加え、2時間放置する。これにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトン50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、アセトンを加え正確に200mLとする。この20mLを40℃以下で約1mLまで濃縮する。

②　果実及び野菜の場合

試料20.0gにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトン50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、アセトンを加え正確に200mLとする。この10mLを40℃以下で約1mLまで濃縮する。

③　茶の場合

試料5.00gに水20mLを加え、2時間放置する。これにアセトン100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトン50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、アセトンを加え正確に200mLとする。この40mLを40℃以下で約1mLまで濃縮する。

2)　精製

オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(1,000mg)にアセトニトリル及び水各10mLを順次注入し、各流出液は捨てる。このカラムに1)で得られた濃縮液に水10mLを加えたものを注入した後、容器をアセトニトリル及び水(3：7)混液10mLで洗い、洗液をカラムに注入し、流出液は捨てる。次いでアセトニトリル及び水(1：1)混液10mLを注入し、溶出液にアセトニトリル及び水(1：1)混液を加えて正確に10mLとしたものを試験溶液とする。

5．検量線の作成

ベンチアバリカルブイソプロピル標準品の0.001～0.02mg／Lを含むアセトニトリル及び水(1：1)混液の標準溶液を数点調製し、それぞれ5μLをLC／MSに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

6．定量

試験溶液5μLをLC／MSに注入し、5の検量線でベンチアバリカルブイソプロピルの含量を求める。

7．確認試験

LC／MS又はLC／MS／MSにより確認する。

8．測定条件

1)　LC／MS

カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)、内径2.1mm、長さ150mm

カラム温度：40℃

移動相：アセトニトリル及び水(9：11)混液

移動相流量：0.2mL／分

イオン化モード：ESI(＋)又はESI(－)

主なイオン(m／z)：382(＋)又は380(－)

注入量：5μL

保持時間の目安：10分

2)　LC／MS／MS

カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)、内径2.1mm、長さ150mm

カラム温度：40℃

移動相：アセトニトリル及び水(1：1)混液

移動相流量：0.2mL／分

イオン化モード：ESI(＋)

主なイオン(m／z)：プリカーサーイオン382、プロダクトイオン180、72

注入量：1μL

保持時間の目安：7分

9．定量限界

0.01mg／kg

10．留意事項

1)　試験法の概要

ベンチアバリカルブイソプロピルを試料からアセトンで抽出し、オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムで精製した後、LC／MSで定量し、LC／MS又はLC／MS／MSで確認する方法である。

2)　注意点

①　精製が不十分な場合は、グラファイトカーボンミニカラム(500mg)による精製をオクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムの前に追加するとよい。

操作概要：抽出液を10mL(穀類の場合は20mL、茶の場合は40mL)分取し、これを予めアセトンで洗浄したグラファイトカーボンミニカラムに負荷し、アセトン10mLを注入する。全溶出液を濃縮し、水10mLを加え、オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムに負荷する。

②　LC／MS／MSで測定する場合はプロダクトイオンについてm／z：180を定量イオン、m／z：72を確認イオンとする。

11．参考文献

なし

12．類型

C