2．装置

電子捕獲型検出器付きガスクロマトグラフ及びガスクロマトグラフ・質量分析計を用いる。

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の2に示すものを用いる。

クロルフェナピル　本品はクロルフェナピル99％以上を含む。

融点　本品の融点は100～101℃である。

ビフェノックス　本品はビフェノックス99％以上を含む。

融点　本品の融点は84～86℃である。

4．試験溶液の調製

1)　抽出

①　穀類、豆類及び種実類の場合

検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後、その10.0gを量り採り、水20mLを加え、2時間放置する。

これにアセトン100mLを加え、3分間細砕した後、ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り、アセトン50mLを加え、3分間細砕した後、上記と同様に操作して、ろ液をその減圧濃縮器に合わせ、40℃以下で約30mLに濃縮する。

これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液100mLを入れた300mLの分液漏斗に移す。n―ヘキサン100mLを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い、洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、n―ヘキサン層を300mLの三角フラスコに移す。水層にn―ヘキサン50mLを加え、上記と同様に操作して、n―ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn―ヘキサン20mLを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40℃以下でn―ヘキサンを除去する。

この残留物にn―ヘキサン30mLを加え、100mLの分液漏斗に移す。これにn―ヘキサン飽和アセトニトリル30mLを加え、振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、アセトニトリル層をすり合わせ減圧濃縮器中に移す。n―ヘキサン層にn―ヘキサン飽和アセトニトリル30mLを加え、上記と同様の操作を2回繰り返し、アセトニトリル層をその減圧濃縮器中に合わせ、40℃以下でアセトニトリルを除去する。この残留物にn―ヘキサンを加えて溶かし、正確に10mLとする。

②　果実、野菜、ハーブ、抹茶及びホップの場合

果実、野菜［及びハーブ］の場合は、検体約1kgを精密に量り、必要に応じて適量の水を量って加え、細切均一化した後、検体20.0gに相当する量を量り採る。

抹茶の場合は、検体5.00gを量り採り、水20mLを加え、2時間放置する。

ホップの場合は、検体を粉砕した後、その5.00gを量り採り、水20mLを加え、2時間放置する。

これにアセトン100mLを加え、3分間細砕した後、ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り、アセトン50mLを加え、3分間細砕した後、上記と同様に操作して、ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ、40℃以下で約30mLに濃縮する。

これをあらかじめ10％塩化ナトリウム溶液100mLを入れた300mLの分液漏斗に移す。n―ヘキサン100mLを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い、洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、n―ヘキサン層を300mLの三角フラスコに移す。水層にn―ヘキサン50mLを加え、上記と同様に操作して、n―ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn―ヘキサン20mLを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40℃以下でn―ヘキサンを除去する。この残留物にn―ヘキサンを加えて溶かし、正確に10mLとする。

③　抹茶以外の茶の場合

a　クロルフェナピルの試験を行う場合

検体9.00gを100℃の水540mLに浸し、室温で5分間放置した後、ろ過し、冷後ろ液360mLを500mLの三角フラスコに移す。これにアセトン100mL及び飽和酢酸鉛溶液2mLを加え、室温で1時間静置した後、ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いて吸引ろ過し、ろ液を1,000mLの分液漏斗に移す。次いでアセトン及び水(1：1)混液50mLを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う。洗液を上記の分液漏斗に合わせる。

これに塩化ナトリウム30g及びn―ヘキサン100mLを加え、振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、n―ヘキサン層を300mLの三角フラスコに移す。水層にn―ヘキサン100mLを加え、上記と同様に操作して、n―ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn―ヘキサン20mLを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40℃以下でn―ヘキサンを除去する。この残留物にn―ヘキサンを加えて溶かし、正確に5mLとする。

2)　精製

内径15mm、長さ300mmのクロマトグラフ管に、カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム5gをn―ヘキサンに懸濁したもの、次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ、カラムの上端に少量のn―ヘキサンが残る程度までn―ヘキサンを流出させる。このカラムに1)　抽出で得られた溶液2mLを注入した後、エーテル及びn―ヘキサン(3：17)混液50mLを注入し、流出液は捨てる。次いでエーテル及びn―ヘキサン(2：3)混液100mLを注入し、溶出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り、40℃以下でエーテル及びn―ヘキサンを除去する。この残留物にn―ヘキサンを加えて溶かし、正確に2mLとして、これを試験溶液とする。

5．操作法

1)　定性試験

次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。

操作条件

カラム：内径0.25mm、長さ10～30mのケイ酸ガラス製の細管に、ガスクロマトグラフィー用メチルシリコンを0.25μmの厚さでコーティングしたもの。

カラム温度：50℃で1分間保持し、その後毎分25℃で昇温する。175℃に到達後、毎分10℃で昇温し、300℃に到達後5分間保持する。

検出器：300℃で操作する。

ガス流量：キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。クロルフェナピルが約14分で流出する流速に調整する。

2)　定量試験

1)　定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき、ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

3)　確認試験

1)　定性試験と同様の操作条件でガスクロマトグラィー・質量分析を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。また、必要に応じ、ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

6．定量限界

クロルフェナピル　0.01mg／kg

ビフェノックス　0.01mg／kg

7．留意事項

なし

8．参考文献

なし

9．類型

A

GC／MSによる農薬等の一斉試験法(農産物)

1．分析対象化合物

別表参照

2．装置

ガスクロマトグラフ・質量分析計(GC／MS)

3．試薬、試液

次に示すもの以外は、総則の2に示すものを用いる。

0.5mol／Lリン酸緩衝液(pH7.0)　リン酸水素二カリウム(K₂HPO₄)52.7g及びリン酸二水素カリウム(KH₂PO₄)30.2gを量り採り、水約500mLに溶解し、1mol／L水酸化ナトリウム又は1mol／L塩酸を用いてpHを7.0に調整した後、水を加えて1Lとする。

各農薬等標準品　各農薬等の純度が明らかなもの。

4．試験溶液調製法

1)　抽出

①　穀類、豆類及び種実類の場合

試料10.0gに水20mLを加え、15分間放置する。

これにアセトニトリル50mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトニトリル20mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。得られたろ液を合わせ、アセトニトリルを加えて正確に100mLとする。

抽出液20mLを採り、塩化ナトリウム10g及び0.5mol／Lリン酸緩衝液(pH7.0)20mLを加え、10分間振とうする。静置した後、分離した水層を捨てる。

オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(1,000mg)にアセトニトリル10mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに上記のアセトニトリル層を注入し、さらに、アセトニトリル2mLを注入して、全溶出液を採り、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。残留物にアセトニトリル及びトルエン(3：1)混液2mLを加えて溶かす。

②　果実、野菜、ハーブ、茶及びホップの場合

果実、野菜及びハーブの場合は、試料20.0gを量り採る。茶及びホップの場合は、試料5.00gに水20mLを加え、15分間放置する。

これにアセトニトリル50mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトニトリル20mL加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。得られたろ液を合わせ、アセトニトリルを加えて正確に100mLとする。

抽出液20mLを採り、塩化ナトリウム10g及び0.5mol／Lリン酸緩衝液(pH7.0)20mLを加え、振とうする。静置した後、分離した水層を捨てる。アセトニトリル層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。残留物にアセトニトリル及びトルエン(3：1)混液2mLを加えて溶かす。

2)　精製

グラファイトカーボン／アミノプロピルシリル化シリカゲル積層ミニカラム(500mg／500mg)に、アセトニトリル及びトルエン(3：1)混液10mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに1)で得られた溶液を注入した後、アセトニトリル及びトルエン(3：1)混液20mLを注入し、全溶出液を40℃以下で1mL以下に濃縮する。これにアセトン10mLを加えて40℃以下で1mL以下に濃縮し、再度アセトン5mLを加えて濃縮し、溶媒を除去する。残留物をアセトン及びn―ヘキサン(1：1)混液に溶かして、正確に1mLとしたものを試験溶液とする。

5．検量線の作成

各農薬等の標準品について、それぞれのアセトン溶液を調製し、それらを混合した後、適切な濃度範囲の各農薬等を含むアセトン及びn―ヘキサン(1：1)混液溶液を数点調製する。それぞれ2μLをGC／MSに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

6．定量

試験溶液2μLをGC／MSに注入し、5の検量線で各農薬等の含量を求める。

7．確認試験

GC／MSにより確認する。

8．測定条件

GC／MS

カラム：5％フェニル―メチルシリコン　内径0.25mm、長さ30m、膜厚0.25μm

カラム温度：50℃(1分)－25℃／分－125℃(0分)－10℃／分－300℃(10分)

注入口温度：250℃

キャリヤーガス：ヘリウム

イオン化モード(電圧)：EI(70eV)

主なイオン(m／z)：別表参照

保持時間の目安：別表参照

9．定量限界

別表参照

ただし、別表は測定限界(ng)の例を示したものである。

10．留意事項

1)　試験法の概要

各農薬等を試料からアセトニトリルで抽出し、塩析で水を除いた後、果実、野菜等についてはそのまま、穀類、豆類及び種実類についてはオクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムで精製後、いずれもグラファイトカーボン／アミノプロピルシリル化シリカゲル積層ミニカラムで精製し、GC／MSで測定及び確認する方法である。

2)　注意点

①　別表は本法を適用できる化合物を五十音順に示したものであるが、規制対象となる品目には本法を適用できない代謝物等の化合物が含まれる場合があるので留意すること。また、保持時間の異なる異性体は、化合物名欄に個別に示した。また、分析中に生成する分解物を測定している場合は、「分解物」と表記した。

②　本試験法は別表に示した全ての化合物の同時分析を保証したものではない。化合物同士の相互作用による分解等及び測定への干渉等のおそれがあるため、分析対象とする化合物の組み合わせにおいてあらかじめこれらの点を検証する必要がある。

③　装置にはガスクロマトグラフ・タンデム型質量分析計(GC／MS／MS)の使用も可能である。

④　リン酸緩衝液の調製には、ナトリウム塩を使用してもよい。

⑤　アセトニトリル抽出液に添加する塩化ナトリウム(10g)が多すぎる場合は、減らしてもよいが、十分に飽和する量を加える。

⑥　濃縮し、溶媒を完全に除去する操作は、窒素気流を用いて穏やかに行う。

⑦　正確な測定値を得るためには、マトリックス添加標準溶液又は標準添加法を用いることが必要な場合がある。

⑧　定量限界は、使用する装置、試験溶液の濃縮倍率及び試験溶液注入量により異なるので、必要に応じて最適条件を検討する。

⑨　抹茶以外の茶について、次の表の第1欄に掲げる農薬を試験する場合は、同表第2欄に掲げる個別試験法により分析すること。

(注)　イソキサチオンについてはEPN等試験法の分析対象化合物には含まれないが、抹茶以外の茶については、当該試験法中a法により分析すること。

11．参考文献

1)　Fillion,J.ら，J.AOAC Int，83，698～713(2000)

12．類型

C