3．1．2．1．2．　プレート情報の設定(ABI PRISM^TM7700及びABI PRISM^TM5700)

反応に際しては、プレート情報の設定を行わなければならない。設定を行う項目は、検体の配置と種類及び、プローブ特性である。具体的には新規シート上で、調製したプレートの配置に対応するように気を付けながら、検体の種類(「STND」：検量線用標準プラスミドDNA溶液^＊1、「NTC」：ブランク試料液、「UNKN」：DNA試料液)の設定を行う。この際、同一の溶液が分注された3ウェルをReplicateとして指定する^＊2。またプローブ特性に関しては、「STND」、「NTC」、「UNKN」のそれぞれについてReporterが「FAM」、Referenceが「ROX」、Quencherが「TAMRA」となるよう設定する。

^＊1　検量線用標準プラスミドDNA溶液の設定

検体の種類の設定に加えて、コピー数を設定する。同一の検量線用標準プラスミドDNA溶液を分注したウェルを選択した状態で、Quantity欄にコピー数を入力する。

^＊2　Replicateとしての指定

同一の溶液を分注したウェルに付けた名称(name欄に入力)と同一の名称を、replicate欄に入力する。

3．1．2．1．3．　PCR反応(ABI　PRISM^TM7700及びABI　PRISM^TM5700)

装置にプレートをセットし、装置の蓋の温度(Cover temperature)が105℃付近になったことを確認した後、反応とデータの取り込みを開始する。反応条件は以下のとおりである。50℃、2分間の条件で保持した後、95℃で10分間加温し、ホットスタート法で反応を開始する。その後、95℃30秒、59℃1分を1サイクルとして、40サイクルの増幅反応を行う。Remaining timeが0分となっていることを確認し、反応を終了させた後、測定結果の解析を行う。

3．1．2．1．4．　検量線の作成(ABI PRISM^TM7700及びABI PRISM^TM5700)

内在性遺伝子及び組換え遺伝子のそれぞれにつき以下の操作で検量線を作成する。サイクル数に対して蛍光シグナルの増加量(ΔRn)をプロットした増幅曲線(Amplification Plot)上で、検量線用標準プラスミドDNA溶液及びDNA試料液由来の蛍光シグナルが指数関数的に増幅しているΔRn部を選択し、Threshold line(Th)を引く。この際、ブランク試料液(NTC)で出現することのある非特異的増幅曲線と交差しないように注意する。また、Base LineはStartを3に、Endを15に設定する。Thの厳密な引き方は、独立行政法人農林水産消費技術センター作成のJAS分析試験ハンドブック「遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル　定量的PCR編」に記載されている方法を準用する。Thと、検量線用標準プラスミドDNA溶液の蛍光シグナルが交差した点をThreshold　cycle(Ct)値とする。次に各々の検量線用標準プラスミドDNA溶液のコピー数の対数値(x軸)に対するCt値(y軸)をプロットし、各Ctに対して得られた近似直線を検量線とする^＊。

^＊実際はThを引いた後、「Amplification Plot」ウインドウ上にある、「Update Calculations」ボタンを押すことで、検量線は自動作成される。この検量線は「Analysis」タブから「Standard Curve」を選択することで表示させる。検量線においては「Corr.」の値を確認し、0.990以上であった場合に以降のコピー数の算出を行う。

3．1．2．2．　ABI PRISM^TM7900HT96well及び384wellを用いた定量PCR

3．1．2．2．1．　PCR用反応液の調製(ABI PRISM^TM7900HT96well)

PCR用反応液は25μL／wellとして調製する。その組成は以下のとおりである。Universal　PCR　Master　Mix^＊112.5μL、対象プライマー対溶液(各プライマー、25μmol／L)0.5μL、対象プローブ溶液(10μmol／L)0.5μL、水9μL、20ng／μLDNA試料液2.5μL(50ng)又は検量線用標準プラスミドDNA溶液2.5μL、あるいは5ng／μLColE1／TE溶液(ブランク試料液：NTC)2.5μL。試験は、1DNA試料液当たり3ウェル並行で行うものとし、PCR用反応液は3ウェル分を同時に調製する^＊2。

調製の実際は、反応液の調製及びPCR反応で生じる誤差を減少させるため、以下の手順に従って行う。まず、あらかじめUniversal PCR Master Mixに対象プライマー対、対象プローブを加えた溶液(マスターミックス)を調製する。この際、対象プライマー対と対象プローブの混合溶液^＊3を先に調製しておき、これとUniversal PCR Master Mixを1：1.25の比率で混合させると良い。マスターミックスの調製液量は余剰分を考慮し、1DNA試料液(3ウェル分)当たり81μLが適当である。混合時にはボルテックスミキサーを用いて十分に撹拌し、撹拌後には軽く遠心する。次いで、マスターミックスを必要数^＊4の微量遠沈管に78.75μLずつ分注する。分注後、各微量遠沈管に対応するDNA溶液を8.75μL加え、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合した後、軽く遠心する。このようにして調製した混合溶液を25μL／wellとして96ウェルプレート上のウェルに分注する。分注操作終了後、真上からシールし、完全にウェルを密閉する。このとき、しわが寄らないよう注意し、専用のシーリング用アプリケーターを用いて行う^＊5。最後にウェルの底を観察し、底に気泡がある場合は、プレートの縁を軽く叩いて気泡を抜いておく。プレートの確認後、ABI PRISM Optical Cover Compression Pad^＊6を茶色の面が上になるよう、プレートの上面にセットする。

^＊1　Universal PCR Master Mix

本試薬は粘性が高いため、混合操作を行う際には、混合が確実に行われるように注意を要する。不十分な場合には、PCR反応がうまくいかない場合がある。使う直前には必ずボルテックスミキサーを用いて3秒程度混合した後、軽く遠心し、溶液を試料管の底に集めておいてから使用する。また、ウェルに分注する際は、以後攪拌、遠心が困難なことを考慮し、ウェルの底に確実に入れる。

^＊2　定量PCR反応液の調製

冷凍庫から出した試薬類は、必要なものにつき室温で融解後、氷上で保存する。氷上で保存した試薬につき、同一のチップを用い連続分注すると、ピペット内の空気が冷却されるため、2回目以降、通常のピペット操作では正確に分注されないので注意する。ピペットの説明書に書かれた、低温試料を扱う場合の操作法(通常、ふきとめと呼ばれる操作)を理解して使用すること。

^＊3　対象プライマー対と対象プローブの混合溶液

対象プライマー対濃度が1.25μmol／L、対象プローブ濃度が0.5μmol／Lとなるよう水で希釈し、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合し、調製する。また、本混合液は凍結保存が可能であるが、凍結融解を繰り返すことは避ける。

^＊4　分注必要数

検量線用標準プラスミド溶液(5点)及びブランク試料液(1点)、この計6点にDNA試料液の数を加えた数。

^＊5　96ウェルプレート、シール及びシーリングアプリケーター

MicroAmp Optical 96―Well Reaction Plate(Applied Biosystems社)及びABI PRISM Optical Adhesive Cover(Applied Biosystems社)を使用する。シーリングの詳細については製品付属のマニュアルを参考のこと。

^＊6　ABI PRISM Optical Cover Compression Pad

ABI PRISM Optical Cover Compression Pad(Applied Biosystems社)を使用する。なお、20回以上の繰り返し使用は、定量結果に影響を及ぼす可能性があるため、避けること。

3．1．2．2．2．　PCR用反応液の調製(ABI PRISM^TM7900HT384well)

PCR用反応液は20μL／wellとして調製する。その組成は以下のとおりである。Universal PCR Master Mix^＊110μL、対象プライマー対溶液(各プライマー、25μmol／L)0.4μL、対象プローブ溶液(10μmol／L)0.4μL、水7.2μL、20ng／μLDNA試料液2μL(50ng)、又は検量線用標準プラスミドDNA溶液2μL^＊2、あるいは5ng／μLColE1／TE溶液(ブランク試料液：NTC)2μL。試験は、1DNA試料液当たり3ウェル並行で行うものとし、PCR用反応液は3ウェル分を同時に調製する^＊3。

調製の実際は、反応液の調製及びPCR反応で生じる誤差を減少させるため、以下の手順に従って行う。まず、あらかじめUniversal PCR Master Mixに対象プライマー対、対象プローブを加えた溶液(マスターミックス)を調製する。この際、対象プライマー対と対象プローブの混合溶液^＊4を先に調製しておき、これとUniversal PCR Master Mixを1：1.25の比率で混合させると良い。マスターミックスの調製液量は余剰分を考慮し、1DNA試料液(3ウェル分)当たり66μLが適当である。混合時にはボルテックスミキサーを用いて十分に撹拌し、撹拌後には軽く遠心する。次いで、マスターミックスを必要数^＊5の微量遠沈管に63μLずつ分注する。分注後、各微量遠沈管に対応するDNA溶液を7μL加え、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合した後、軽く遠心する。このようにして調製した混合溶液を20μL／wellとして384ウェルプレート上のウェルに分注する。分注操作終了後、真上からシールし、完全にウェルを密閉する。この時、しわが寄らないよう注意し、専用のシーリング用アプリケーターを用いて行う^＊6。最後にウェルの底を観察し、底に気泡がある場合は、プレートの縁を軽く叩いて気泡を抜いておく。

^＊1　Universal PCR Master Mix

本試薬は粘性が高いため、混合操作を行う際には、混合が確実に行われるように注意を要する。不十分な場合には、PCR反応がうまくいかない場合がある。使う直前には必ずボルテックスミキサーを用いて3秒程度混合した後、軽く遠心し、溶液を試料管の底に集めておいてから使用する。また、ウェルに分注するときは、以後攪拌、遠心が困難なことを考慮し、ウェルの底に確実に入れる。

^＊2　検量線用標準プラスミドDNA溶液

ABI PRISM^TM7900HT384wellを用いた試験においては、反応液に添加する検量線用標準プラスミドDNA溶液の液量を2μとしている。このため、対応するコピー数は、16、100、1,200、16,000、200,000となる。コピー数の設定を誤ると、正確な測定が行えないため、注意する。

^＊3　定量PCR反応液の調製

冷凍庫から出した試薬類は、必要なものにつき室温で融解後、氷上で保存する。氷上で保存した試薬につき、同一のチップを用い連続分注すると、ピペット内の空気が冷却されるため、2回目以降、通常のピペット操作では正確に分注されないので注意する。ピペットの説明書に書かれた、低温試料を扱う場合の操作法(通常、ふきとめと呼ばれる操作)を理解して使用すること。

^＊4　対象プライマー対と対象プローブの混合溶液

対象プライマー対濃度が1.25μmol／L、対象プローブ濃度が0.5μmol／Lとなるよう水で希釈し、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合し、調製する。また、本混合液は凍結保存が可能であるが、凍結融解を繰り返すことは避ける。

^＊5　分注必要数

検量線用標準プラスミド溶液(5点)及びブランク試料液(1点)、この計6点にDNA試料液の数を加えた数。

^＊6　384ウェルプレート、シール及びシーリングアプリケーター

ABI PRISM384―Well Clear Optical Reaction Plate with Barcode(Applied Biosystems社)及びABI PRISM Optical Adhesive Cover(Applied Biosystems社)を使用する。シーリングの詳細については製品付属のマニュアルを参考のこと。

3．1．2．2．3．　プレート情報の設定(ABI PRISM^TM7900HT96well及び384well)

反応に際しては、プレート情報の設定を行わなければならない。設定を行う項目は、検体の配置と種類及び、プローブ特性である。まず、プローブ特性の設定を行う。プローブ特性はDetector Manager画面上でReporterが「FAM」、Quencherが「TAMRA」となるよう設定する^＊1。設定したDetectorをSet upタブに登録した後、同じプライマーとプローブのセットを用いて測定を行うウェルすべてを指定する。次に検体の配置と種類を指定する。具体的には、調製したプレートの配置に対応するように気を付けながら、検体の種類(「Standard」:検量線用標準プラスミドDNA溶液^＊2、「NTC」:ブランク試料液、「Unknown」:DNA試料液)をTask欄において指定する。この際、同一の溶液が分注された3ウェルを選択した状態で、名称を入力しておく。またPassive Referenceを「ROX」と設定する。

^＊1　Detectorの設定

Detectorは各プライマー、プローブのセットに対して設定しておくと良い。

^＊2　検量線用標準プラスミドDNA溶液の設定

検体の種類の設定に加えて、コピー数を設定する。同一の検量線用標準プラスミドDNA溶液を分注したウェルを選択した状態で、Quantity欄にコピー数を入力する(3．1．2．2．2．項に記載したように、96ウェルを使用する場合と、384ウェルを使用する場合では、液量の違いから、コピー数が異なるため注意する。)。

3．1．2．2．4．　PCR反応(ABI PRISM^TM7900HT96well及び384well)

装置にプレートをセットし、反応とデータの取り込みを開始する。反応条件は以下のとおりである。50℃、2分間の条件で保持した後、95℃で10分間加温し、ホットスタート法で反応を開始する。その後、95℃30秒、59℃1分を1サイクルとして、45サイクルの増幅反応を行う。なお、反応条件の設定において、9,600emulationモードのチェックを入れておく。また、96ウェルと384ウェルでは反応液量が異なることから、それぞれにあった液量での設定を行う。Remaining timeが0分となっていることを確認し、反応を終了させた後、測定結果の解析を行う。

3．1．2．2．5．　検量線の作成(ABI PRISM^TM7900HT96well及び384well)

内在性遺伝子及び組換え遺伝子のそれぞれにつき以下の操作で検量線を作成する。サイクル数に対して蛍光シグナルの増加量(ΔRn)をプロットした増幅曲線(Amplification Plot)上で、検量線用標準プラスミドDNA溶液及びDNA試料液由来の蛍光シグナルが指数関数的に増幅しているΔRn部を選択し、Threshold line(Th)を引く。この際、ブランク試料液(NTC)で出現することのある非特異的増幅曲線と交差しないように注意する。また、Base LineはStartを3に、Endを15に設定する。Thの厳密な引き方は、独立行政法人農林水産消費技術センター作成のJAS分析試験ハンドブック「遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル定量的PCR編」に記載されている方法を準用する。Thと、検量線用標準プラスミドDNA溶液の蛍光シグナルが交差した点をThreshold cycle(Ct)値とする。次に各々の検量線用標準プラスミドDNA溶液のコピー数の対数値(x軸)に対するCt値(y軸)をプロットし、各Ctに対して得られた近似直線を検量線とする^＊。

^＊実際はThを引いた時点で検量線は自動作成される。検量線においては「Corr.」の値を確認し、0.990以上であった場合に以降のコピー数の算出を行う。

3．1．2．3．　ABI PRISM^TM7000を用いた定量PCR

3．1．2．3．1．　PCR用反応液の調製(ABI PRISM^TM7000)

PCR用反応液は25μL／wellとして調製する。その組成は以下のとおりである。Universal PCRMaster Mix^＊112.5μL、対象プライマー対溶液(各プライマー、25μmol／L)0.5μL、対象プローブ溶液(10μmol／L)0.5μL、水9μL、20ng／μL　DNA試料液2.5μL(50ng)、又は検量線用標準プラスミドDNA溶液2.5μL、あるいは5ng／μL　ColE1／TE溶液(ブランク試料液：NTC)2.5μL。試験は1DNA試料液当たり3ウェル並行で行うものとし、PCR用反応液は3ウェル分を同時に調製する^＊2。

調製の実際は、反応液の調製及びPCR反応で生じる誤差を減少させるため、以下の手順に従って行う。まず、あらかじめUniversal PCR Master Mixに対象プライマー対、対象プローブを加えた溶液(マスターミックス)を調製する。この際、対象プライマー対と対象プローブの混合溶液^＊3を先に調製しておき、これとUniversal PCR Master Mixを1：1.25の比率で混合させると良い。マスターミックスの調製液量は余剰分を考慮し、1DNA試料液(3ウェル分)当たり81μLが適当である。混合時にはボルテックスミキサーを用いて十分に撹拌し、撹拌後には軽く遠心する。次いで、マスターミックスを必要数^＊4の微量遠沈管に78.75μLずつ分注する。分注後、各微量遠沈管に対応するDNA溶液を8.75μL加え、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合した後、軽く遠心する。このようにして調製した混合溶液を25μL／wellとして96ウェルプレート上のウェルに分注する。分注操作終了後、真上からシールし、完全にウェルを密閉する。このとき、しわが寄らないよう注意し、専用のシーリング用アプリケーターを用いて行う^＊5。最後にウェルの底を観察し、底に気泡がある場合は、プレートの縁を軽く叩いて気泡を抜いておく。プレートの確認後、ABI PRISM Optical Cover Compression Pad^＊6を茶色の面が上になるよう、プレートの上面にセットする。

^＊1　Universal PCR Master Mix

本試薬は粘性が高いため、混合操作を行う際には、混合が確実に行われるように注意を要する。不十分な場合には、PCR反応がうまくいかない場合がある。使う直前には必ずボルテックスミキサーを用いて3秒程度混合した後、軽く遠心し、溶液を試料管の底に集めておいてから使用する。また、ウェルに分注するときは、以後撹拌、遠心が困難なことを考慮し、ウェルの底に確実に入れる。

^＊2　定量PCR反応液の調製

冷凍庫から出した試薬類は、必要なものにつき室温で融解後、氷上で保存する。氷上で保存した試薬につき、同一のチップを用い連続分注すると、ピペット内の空気が冷却されるため、2回目以降、通常のピペット操作では正確に分注されないので注意する。ピペットの説明書に書かれた、低温試料を扱う場合の操作法(通常、ふきとめと呼ばれる操作)を理解して使用すること。

^＊3　対象プライマー対と対象プローブの混合溶液

対象プライマー対濃度が1.25μmol／L、対象プローブ濃度が0.5μmol／Lとなるよう水で希釈し、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合し、調製する。また、本混合液は凍結保存が可能であるが、凍結融解を繰り返すことは避ける。

^＊4　分注必要数

検量線用標準プラスミド溶液(5点)及びブランク試料液(1点)、この計6点にDNA試料液の数を加えた数。

^＊5　96ウェルプレート、シール及びシーリングアプリケーター

MicroAmp Optical 96―Well Reaction Plate(Applied Biosystems社)及びABI PRISM Optical Adhesive Cover(Applied Biosystems社)を使用する。シーリングの詳細については製品付属のマニュアルを参考のこと。

^＊6　ABI PRISM Optical Cover Compression Pad

ABI PRISM Optical Cover Compression Pad(Applied Biosystems社)を使用する。なお、20回以上の繰り返し使用は、定量結果に影響を及ぼす可能性があるため、避けること。

3．1．2．3．2．　プレート情報の設定(ABI PRISM^TM7000)

反応に際しては、プレート情報の設定を行わなければならない。設定を行う項目は、検体の配置と種類及び、プローブ特性である。まず、プローブ特性の設定を行う。プローブ特性はDetector Manager画面上でReporterが「FAM」、Quencherが「TAMRA」となるよう設定する^＊1。設定したDetectorをWell Inspectorに登録した後、同じプライマーとプローブのセットを用いて測定を行うウェルすべてを指定する。次に検体の配置と種類を指定する。具体的には、調製したプレートの配置に対応するように気を付けながら、検体の種類(「Standard」：検量線用標準プラスミドDNA溶液^＊2、「NTC」:ブランク試料液、「Unknown」:DNA試料液)をTask欄において指定する。この際、同一の溶液が分注された3ウェルを選択した状態で、名称を入力しておく。またPassive Referenceを「ROX」と設定する。

^＊1　Detectorの設定

Detectorは各プライマー、プローブのセットに対して設定しておくと良い。

^＊2　検量線用標準プラスミドDNA溶液の設定

検体の種類の設定に加えて、コピー数を設定する。同一の検量線用標準プラスミドDNA溶液を分注したウェルを選択した状態で、Quantity欄にコピー数を入力する。

3．1．2．3．3．　PCR反応(ABI PRISM^TM7000)

装置にプレートをセットし、反応とデータの取り込みを開始する。反応条件は以下のとおりである。50℃、2分間の条件で保持した後、95℃で10分間加温し、ホットスタート法で反応を開始する。その後、95℃30秒、59℃1分を1サイクルとして、45サイクルの増幅反応を行う。なお、反応条件の設定において、9,600emulationモードのチェックを入れておく。Remaining timeが0分となっていることを確認し、反応を終了させた後、測定結果の解析を行う。

3．1．2．3．4．　検量線の作成(ABI PRISM^TM7000)

内在性遺伝子及び組換え遺伝子のそれぞれにつき以下の操作で検量線を作成する。サイクル数に対して蛍光シグナルの増加量(ΔRn)をプロットした増幅曲線(Amplification Plot)上で、検量線用標準プラスミドDNA溶液及びDNA試料液由来の蛍光シグナルが指数関数的に増幅しているΔRn部を選択し、Threshold line(Th)を引く。この際、ブランク試料液(NTC)で出現することのある非特異的増幅曲線と交差しないように注意する。また、Base LineはStartを3に、Endを15に設定する。Thの厳密な引き方は、独立行政法人農林水産消費技術センター作成のJAS分析試験ハンドブック「遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル定量的PCR編」に記載されている方法を準用する。Thと、検量線用標準プラスミドDNA溶液の蛍光シグナルが交差した点をThreshold cycle(Ct)値とする。次に各々の検量線用標準プラスミドDNA溶液のコピー数の対数値(x軸)に対するCt値(y軸)をプロットし、各Ctに対して得られた近似直線を検量線とする^＊。

^＊実際はThを引き、「Analyze」ボタンを押した時点で検量線は自動作成される。検量線においては「Corr.」の値を確認し、0.990以上であった場合に以降のコピー数の算出を行う。

3．1．2．4．　Roche LightCycler Systemを用いた定量PCR

3．1．2．4．1．　PCR用反応液の調製(Roche LightCycler System)

PCR用反応液は20μL／キャピラリーとして調製する。その組成は以下のとおりである。LC―FastStart DNA Master Hybridization Probes^＊12μL、対象プライマー対溶液(各プライマー、25μmol／L)0.4μL、対象プローブ(10μmol／L)0.4μL、水9.8μL、MgCl₂溶液(25mM)2.4μL、10ng／μLDNA試料液5μL(50ng)、又は検量線用標準プラスミドDNA溶液5μL^＊2、あるいは5ng／μL　ColE1／TE溶液(ブランク試料液：NTC)5μL。試験は、検量線用標準プラスミドDNA溶液、及びNTCに対し1キャピラリー、1DNA試料液に対し2キャピラリー並行で行うものとし、DNA試料液に対するPCR用反応液は2キャピラリー分を同時に調製する^＊3。

調製の実際は、反応液の調製及びPCR反応で生じる誤差を減少させるため、以下の手順に従って行う。まず、あらかじめLC―FastStart DNA Master Hybridization ProbesにMgCl₂溶液、水並びに対象プライマー対、対象プローブを加えた溶液(マスターミックス)を調製する。この際、対象プライマー対と対象プローブの混合溶液^＊4を先に調製しておき、これとLC―FastStart DNA Master Hybridization Probes、MgCl₂溶液、水の混合液を8：7の比率で混合させると良い。マスターミックスの調製液量は余剰分を考慮し、1キャピラリー当たり19.8μLが適当である。混合時にはボルテックスミキサーを用いて十分に撹拌し、撹拌後には軽く遠心する。次いで、マスターミックスを必要数^＊5の微量遠沈管に分注する。分注の液量は検量線用標準プラスミド溶液及びNTCに対し18μL、DNA試料液に対し36μLとする。分注後、各微量遠沈管に対応するDNA溶液を6μL(検量線用標準プラスミド溶液及びNTC)あるいは12μL(DNA試料液)加え、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合した後、軽く遠心する。このようにして調製した混合溶液を20μL／キャピラリーとして分注する。分注操作終了後、真上から蓋をし、完全にキャピラリーを密閉する。最後に遠心操作^＊6を行い、混合液をキャピラリーにしっかり充填する。

^＊1　LC―FastStart DNA Master Hybridization Probes

LC―FastStart Enzyme(la red cap)とLC―FastStart Reaction Mix Hybridization Probes(lb colorless cap)とを混合し、調製する。調製したLC―FastStart DNA Master Hybridization Probesは、4℃で一週間の保存が可能である。また、本試薬は粘性が高いため、混合操作を行う際には、混合が確実に行われるように注意を要する。不十分な場合には、PCR反応がうまくいかない場合がある。

^＊2　検量線用標準プラスミドDNA溶液

Roche LightCycler Systemを用いた試験においては、反応液に添加する検量線標準プラスミドDNA溶液の液量を5μLとしている。このため、対応するコピー数は、40、250、3,000、40,000、500,000となる。コピー数の設定を誤ると、正確な測定が行えないため、注意する。

^＊3　定量PCR反応液の調製

冷凍庫から出した試薬類は、必要なものにつき室温で融解後、氷上で保存する。氷上で保存した試薬につき、同一のチップを用い連続分注すると、ピペット内の空気が冷却されるため、2回目以降、通常のピペット操作では正確に分注されないので注意する。ピペットの説明書に書かれた、低温試料を扱う場合の操作法(通常、ふきとめと呼ばれる操作)を理解して使用すること。

また、Roche LightCycler Systemを用いた定量PCRにおいては、試験を検量線用標準プラスミドDNA溶液、及びNTCに対し1キャピラリー、1DNA試料液当たり2キャピラリー並行で行う。装置にかけられるキャピラリーの総数、及び1度の反応につき内在性遺伝子ならびに組換え遺伝子の両方を測定することから、1回の測定当たり測定可能なDNA試料液の最大数は5となる。

^＊4　対象プライマー対と対象プローブの混合溶液

対象プライマー対濃度が1.25μmol／L、対象プローブ濃度が0.5μmol／Lとなるよう水で希釈し、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合し、調製する。また、本混合液は凍結保存が可能であるが、凍結融解を繰り返すことは避ける。

^＊5　分注必要数

検量線用標準プラスミド溶液(5点)及びブランク試料液(1点)、この計6点にDNA試料液の数を加えた数。

^＊6　遠心操作

遠心操作は、キャピラリーの破損を避けるため、専用のカローセル遠心機を使用し行うか、あるいは汎用の遠心機を使用する場合には700×g以下、フラッシュの条件で行う。なお、遠心操作の如何に関わらず、装置本体にセットする前にはキャピラリーをカローセルに装填する。この際も、キャピラリーの破損に十分注意しつつ、しっかりとセットすること。

3．1．2．4．2．　キャピラリー情報の設定(Roche LightCycler System)

反応に際しては、キャピラリー情報の設定を行わなければならない。具体的にはサンプルリスト作成画面上で、調製したキャピラリーの配置(カローセル上の配置)に対応するように気を付けながら、検体の種類(「Standard」:検量線用標準プラスミドDNA溶液^＊1、「Negative」:ブランク試料液、「Unknown」:DNA試料液)をType欄において指定する。この際、同一の溶液が分注された2キャピラリーについてはReplicateであることを指定する^＊2。また、Seek Temperatureを30℃と設定し、Maximum Positionにはカローセルに装填したキャピラリーの最大位置番号を入力する。

^＊1　検量線用標準プラスミドDNA溶液の設定

検体の種類の設定に加えて、コピー数を設定する。各検量線用標準プラスミドDNA溶液を分注したキャピラリーに対し、Concentration欄にコピー数を入力する。

^＊2　Replicateの指定

例えば、キャピラリー位置番号の7と8に同一の溶液を分注した場合、まず番号7に関する情報を設定し、その後、番号8は番号7のReplicateであることを指示する。具体的には番号8のReplicate欄において「7」を入力することで指示を行う。

3．1．2．4．3．　PCR反応(Roche LightCycler System)

装置にカローセルをセットし、反応とデータの取り込みを開始する。反応条件は以下のとおりである。95℃、10分間の条件で加温したホットスタート法により反応を開始した後、95℃15秒、59℃30秒(1℃／秒)^＊1を1サイクルとして、50サイクルの増幅反応を行う。増幅反応終了後、40℃30秒の条件で保つ。データの取り込みは、増幅反応の各サイクル終了時に行わせるよう設定する^＊2。

^＊1　加温、冷却速度

ここに示している以外、加温、冷却の速度は20℃／秒とする。

^＊2　データの取り込み設定

データの取り込み設定の実際は、サイクルプログラムデータ画面において、59℃30秒と設定したカラムについて「Acquisition Mode」を「Single」と設定する。

3．1．2．4．4．　検量線の作成(Roche LightCycler System)

反応が終了していることを確認した後に、解析を行う。解析は「Fit Point法」を用いて行う。内在性遺伝子及び組換え遺伝子のそれぞれにつき以下の操作で検量線を作成する。Base LineはProportionalとし、Number of Pointsは2とする。解析する検体のみを選択した状態にし、Noise Bandを0.1に設定する。上記条件にて検量線を作成させ、Error値^＊が0.2以下であった場合には、その際に得られた数値を解析値とする。

^＊検量線のError値が0.2以上になる場合には以下の検討を行う。Crossing Lineの調整幅(Crossing Lineを移動させる範囲)を0.1から0.2の間とし、手動でCrossing Lineを移動させる。移動させながら検量線のError値が最小となるようなCrossing Lineを設定し、その時点で得られる数値を解析値とする。上記解析を行ってなお検量線のError値が0.2以上になる場合には、検量線から大きく外れている検量線用標準DNA溶液1点を解析対象から外し、同様の解析を行う。以上の解析を行ってもError値が0.2以上になる場合にはその解析条件下での最小Error値を示した時点の数値を解析値とする。

3．1．3．　試料の組換えDNA技術応用食品含有率の計算

未知DNA試料液につき検量線作成で用いたThを使用してCt値を求め、内標遺伝子及び組換え遺伝子につき、それぞれの検量線から各3ウェル^＊とも内在性遺伝子のコピー数を内挿し、それにより得られる値の平均を内在性遺伝子のコピー数及び組換え遺伝子のコピー数とする。次に次式に従って、対象組換えDNA技術応用食品含有率を求める。

対象組換えDNA技術応用食品含有率(％)＝［組換え遺伝子のコピー数／(内在性遺伝子のコピー数×内標比)］×100

大豆の場合、現在のところ市場に流通している遺伝子組換え大豆はRoundup Ready Soybeanのみであり、Le―1とRRS遺伝子のコピー数から算出された値は、遺伝子組換え大豆の含有率を示している。

^＊Roche LightCycler Systemを用いた場合には、1DNA試料液当たり各3ウェルではなく、2キャピラリーで実施するので、3．1．2．4．3．記載の解析の結果得られた2キャピラリー分のデータの平均値を内在性遺伝子のコピー数及び組換え遺伝子のコピー数とする。

3．1．4．　結果の判定

3試料につき各1回の抽出を行い、ELISA法又は定量PCR法により得られた値の平均が5％を越えた試料については、不適切な分別生産流通管理が行われていた可能性がある。

3．2．　トウモロコシ

トウモロコシでは、異なった発現タンパク質をもつ組換え系統が存在する上、同一の発現タンパク質が発現する組換え系統であっても、組換え系統毎にタンパク質の発現量が異なるため、多種の遺伝子組換えトウモロコシが混入している穀粒では、遺伝子組換えトウモロコシの含有率を求める目的でELISA法を用いることはできない。したがって、定量PCR法でのみ分析が可能である。

3．2．1．　定量PCR法

上述のように、トウモロコシでは分析対象が複数系統存在するため、まず一次スクリーニングを実施し、得られた結果に基づき、さらに系統毎の分別定量を行い、組換え系統毎の定量値を合計して、結果の判定を行う。なお、トウモロコシの場合、トウモロコシに普遍的に存在する内在性遺伝子として、スターチシンターゼIIb(SSIIb)遺伝子を用い、同遺伝子を標的とするプライマー対SSIIb―3とプローブSSIIb―Taqを使用して得られた同遺伝子のコピー数と、分析対象となる組換え遺伝子を標的とするプライマー対とプローブを使用して得られた対象遺伝子のコピー数を大豆の場合と同様に算出し、3．1．3．で示した式に基づき対象遺伝子組換えトウモロコシの含有率を求める。

3．2．1．1．　スクリーニング

3．2．1．1．1．　Cauliflower mosaic virus由来の35Spromoterが組み込まれた組換え系統の定量

組換えトウモロコシ系統Event176、Bt11、T25及びMon810には、共通してCauliflower mosaic virus由来の35Spromoter(CaM)配列が組み込まれているため、同配列含量を指標として、これらの系統の混合物については、大まかな含量を推定することが可能である。分析方法は、用いるプライマー対、プローブを除き大豆の定量PCR法で示された方法と同一である。内在性遺伝子として、スターチシンターゼIIb(SSIIb)遺伝子を用い、同遺伝子を標的とするプライマー対SSIIb―3とプローブSSIIb―Taqを使用する。対象遺伝子のプライマー対とプローブはP35S―1とP35S―Taq^＊であり、別紙に規定された内標比を用いて、最終的にCaM配列が組み込まれた遺伝子組換えトウモロコシの含有率を算出する。

^＊P35S―1とP35S―Taqを用いた際の内標比はMon810を対象として算出されたものを用いる。同系統は米国で最も作付け面積が広い組換え系統であること、組換え遺伝子中に35Spromoterが1コピーしか存在しないことから、遺伝子組換えトウモロコシの含有率を過小評価する可能性が低い。なお、P35S―Taqは、他のプローブの半分の濃度(終濃度：0.1μmol／L)で使用するため、反応液の調製の際には留意する(定量機器にRoche LightCycler Systemを用いる場合には、これに当たらず、他のプローブと同濃度で使用する。)。

3．2．1．1．2．　GA21の定量

組換え系統GA21は、CaM配列が組み込まれていない。したがって、本系統の含有率を確認するため、CaM配列を分析するものと同一のDNA試料液について、別にGA21に特異的なプライマー対GA21―3とプローブGA21―Taqを用い、3．2．1．1．1．と同様の方法でGA21遺伝子のコピー数を算出し、GA21の含有率を求める。

3．2．1．1．3．　結果の判定

3試料につき、各1回の抽出を行い、得られたDNA試料液について定量PCRを行った結果、CaM配列が組み込まれた遺伝子組換えトウモロコシの含有率にGA21の含有率を加えた値が4.5％を越える場合、さらに、別に2回の抽出を行い、計3回の抽出より得られたDNA試料液について、それぞれトウモロコシ組換え系統特異的定量を行う。

3．2．1．2．　トウモロコシ組換え系統特異的定量

3．2．1．2．1．　Event176、Bt11、T25及びMon810の定量

GA21については、3．2．1．1．2．と同様の方法で行う。組換え系統Event176、Bt11、T25及びMon810については、定量用プライマー対とプローブとして、それぞれE176―2とE176―Taq、Bt11―3とBt11―Taq、T25―1とT25―Taq及びM810―2とM810―Taqを用い、3．2．1．1．1．と同様の方法^＊でEvent176、Bt11、T25、Mon810の各遺伝子のコピー数を算出し、Event176、Bt11、T25、Mon810の系統別含有率を求める。

^＊Roche LightCycler Systemを用いてBt11を対象とする測定を行う場合は、反応液組成(MgCl₂濃度)が異なるため、注意する。組成を以下に示す。LC―FastStart DNA Master Hybridization Probes2μL、対象プライマー対溶液(25μmol／L)0.4μL、対象プローブ溶液(10μmol／L)0.4μL、水11.4μL、MgCl₂溶液(25mM)0.8μL、10ng／μL　DNA試料液5μL(50ng)、又は検量線用標準プラスミドDNA溶液5μL、あるいは5ng／μLColE1／TE溶液(ブランク試料液：NTC)5μL。

3．2．2．　結果の判定

3．2．1．1．2．で得られたGA21、Event176、Bt11、T25及びMon810の含有率について、1DNA試料液ずつ総和を算出し、それらの平均が5％を越えた試料については、不適切な分別生産流通管理が行われていた可能性がある。

ABI　PRISM^TM7700及びABI　PRISM^TM5700

ABI　PRISM^TM7900HT96well

ABI　PRISM^TM7900HT384well

ABI　PRISM^TM7000

LightCycler System

(参考)

(1)　2．2．DNA抽出精製法のうち、2．2．1．2．のシリカゲル膜タイプキット法に用いられるAP1及びAP2緩衝液及びRNaseAは、キットに含まれるものとは別にキアゲン(〒104―0054　東京都中央区勝どき3―13―1Forefront Tower II.　Tel.03―5547―0811　Fax.03―5547―0818)から購入可能である。

(2)　3．安全性審査済の組換えDNA技術応用食品の検査方法のうち、3．1．2．記載の検量線の作成に用いられる標準プラスミドDNA溶液(GMダイズ(RRS)プラスミドセット―ColE1／TE―；GM Soybean(RRS)Detection Plasmid Set―ColE1／TE―、GMトウモロコシプラスミドセット―ColE1／TE―；GM Maize Detection Plasmid Set―ColE1／TE―)は、ニッポンジーン(〒930―0982　富山市問屋町1―29．Tel.076―451―6548　Fax.076―451―6547)、ファスマック(〒243―0041　厚木市緑ケ丘5―1―3．Tel.046―295―8787　Fax.046―294―3738)から購入可能である。

(3)　3．安全性審査済の組換えDNA技術応用食品の検査方法のうち、3．1．2．1．1．記載のPCR用反応液の調製に用いられる対象プライマー対、対象プローブは、ニッポンジーン、ファスマックから購入可能である。

(4)　3．安全性審査済の組換えDNA技術応用食品の検査方法のうち、3．1．2．4．1．記載のLight Cycler Systemを用いた定量PCRにおいて使用する試薬類はロシュ・ダイアグノスティック(〒105―0014　東京都港区芝2―6―1．Tel.03―5443―5287　Fax.03―5443―7098)から購入可能である。

(5)　独立行政法人農林水産消費技術センター作成のJAS分析試験ハンドブック「遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル」は下記ホームページから入手可能である。

http://www.maff.go.jp/sogo_shokuryo/jas/manual00.htm