カルバドックス試験法

キノキサリン-２-カルボン酸を分析対象とする。

１．装置
　紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ及び液体クロマトグラフ・質量分析計を用いる。
２．試薬・試液
　次に示すもの以外は，第２　添加物の部Ｃ　試薬・試液等の項に示すものを用いる。
　なお，「（特級）」と記載したものは，日本工業規格試薬の特級の規格に適合するものであることを示す。
オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム（500mg）　内径８〜９mmのポリエチレン製のカラム管に，オクタデシルシリル化シリカゲル500mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離特性を有するものを用いる。
強塩基性陰イオン交換体ミニカラム（360mg）　内径８〜９mmのポリエチレン製のカラム管に，トリメチルアミノアクリルアミド共重合体シリル化シリカゲル360mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離特性を有するものを用いる。
水　液体クロマトグラフ用に製造したものを用いる。
無水硫酸ナトリウム　無水硫酸ナトリウム（特級）。当該農薬等の成分である物質の分析の妨害物質を含む場合には，ｎ-ヘキサン等の溶媒で洗浄したものを用いる。
リン酸緩衝液（pＨ2.5）　リン酸一カリウム1.36ｇを水に溶かして800mlとする。これにリン酸を加えてpＨ2.5に調整し，水を加えて1,000mlとする。

３．標準品
キノキサリン-２-カルボン酸　本品はキノキサリン-２-カルボン酸99％以上を含む。
　分解点　本品の分解点は208℃である。

４．試験溶液の調製
ａ　抽出法
　検体を細切均一化した後，その5.00ｇを量り採る。なお，筋肉の場合は，可能な限り脂肪層を除いた上で細切均一化を行う。
　これにメタノール及び0.3％メタリン酸溶液の混液（３：７）100mlを加え，細砕した後，ケイソウ土を２mmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。次いでメタノール及び0.3％メタリン酸溶液の混液（３：７）10mlを用いてろ紙上の残留物を洗い，洗液を吸引ろ過し，ろ液をそのすり合わせ減圧濃縮器中に合わせ，45℃以下で30mlに濃縮した後，リン酸0.1mlを加える。
ｂ　精製法
(1)　オクタデシルシリル化シリカゲルカラムクロマトグラフィー
　オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム（500mg）に，メタノール５ml及び水10mlを順次注入し，流出液は捨てる。このカラムにａ　抽出法で得られた溶液を注入した後，リン酸緩衝液（pＨ2.5）20mlを注入し，流出液は捨てる。このカラムにメタノール10mlを注入し，溶出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り，40℃以下でメタノールを除去する。この残留物に水５mlを加えて溶かす。
(2)　強塩基性陰イオン交換体カラムクロマトグラフィー
　強塩基性陰イオン交換体ミニカラム（360mg）に，水５mlを注入し，流出液は捨てる。このカラムに(1)　オクタデシルシリル化シリカゲルカラムクロマトグラフィーで得られた溶液を注入した後，水２ml，エタノール10ml，水５mlを順次注入し，流出液は捨てる。このカラムに0.1mol／l塩酸５mlを注入し，溶出液を50mlの試験管に採り，３mol／l塩酸３ml及び酢酸エチル15mlを加え，振とう機を用いて５分間激しく振り混ぜた後，静置し，酢酸エチル層を100mlの三角フラスコ中に移す。水層に酢酸エチル15mlを加え，上記と同様に操作して，酢酸エチル層を上記の三角フラスコ中に合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え，時々振り混ぜながら15分間放置した後，すり合わせ減圧濃縮器中にろ過し，40℃以下で酢酸エチルを除去する。この残留物にアセトニトリル及びリン酸緩衝液（pＨ2.5）の混液（１：４）1.0mlを加えて溶かし，これを試験溶液とする。

５．操作法
ａ　定性試験
　次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。
操作条件
カラム充てん剤　オクタデシルシリル化シリカゲル（粒径５μm）を用いる。
カラム管　内径4.0〜6.0mm，長さ150mmのステンレス管を用いる。
カラム温度　40℃
検出器　吸光波長245nmで操作する。
移動相　アセトニトリル及びリン酸緩衝液（pＨ2.5）の混液（１：４）を用いる。キノキサリン-２-カルボン酸が約10分で流出する流速に調整する。
ｂ　定量試験
　ａ　定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。
ｃ　確認試験
　ａ　定性試験と同様の捜査条件で液体クロマトグラフィー・質量分析を行う。ただし，移動相はアセトニトリル及び水の混液（１：４）を用いる。試験結果は標準品と一致しなければならない。また，必要に応じ，ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。
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