LC/MS による農薬等の一斉試験法（畜水産物）
１．分析対象化合物
筋肉、脂肪、肝臓、腎臓及び魚介類の場合は、別表１参照
乳、卵及びはちみつの場合は、別表２参照
２．装置
液体クロマトグラフ・質量分析計（LC/MS）又は液体クロマトグラフ・タンデム型質量分析計（LC/MS/MS）
３．試薬、試液
次に示すもの以外は、総則の３に示すものを用いる。
各農薬等標準品 各農薬等の純度が明らかなもの。
４．試験溶液調製法
１）抽出
(1) 筋肉、脂肪、肝臓、腎臓及び魚介類の場合
筋肉、肝臓、腎臓及び魚介類の場合は、試料20.0ｇを量り採る。脂肪の場合は、5.00ｇを量り採る。
これに水20 mL を加え、ホモジナイズした後、アセトン及びｎ−ヘキサン（１：２）混液100 mL を加え、さらにホモジナイズした後、毎分2,500 回転で５分間遠心分離し、有機層を採る。
残留物にｎ−ヘキサン50 mL を加え、ホモジナイズした後、毎分2,500 回転で５分間遠心分離する。得られた有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別する。ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去した後、残留物の重量を測定し、これを抽出脂肪重量とする。残留物の全量または一定量を採り、ゲル浸透クロマトグラフィー用カラム（スチレンジビニルベンゼン共重合体カラム）への負荷量が試料5.0ｇ相当量になるように（試料5.0ｇ中の抽出脂肪量が0.5ｇを超える場合には、カラムへの負荷量が抽出脂肪0.50ｇ相当量になるように）アセトン及びシクロヘキサン（１：４）混液に溶かす。
(2) 乳、卵及びはちみつの場合
乳及び卵の場合は、試料20.0ｇを量り採る。はちみつの場合は、試料20.0ｇを量り採り、水20 mL を加えて溶かす。
これにアセトニトリル100 mL を加えて、ホモジナイズした後、毎分2,500 回転で５分間遠心分離し、有機層を採る。残留物にアセトニトリル50 mL を加え、ホモジナイズした後、毎分2,500回転で５分間遠心分離する。得られた有機層を合わせ、塩化ナトリウム10ｇを加え、振とうする。静置した後、分離した水層を捨てる。アセトニトリル層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。乳及び卵の場合は、残留物をゲル浸透クロマトグラフィー用カラム（スチレンジビニルベンゼン共重合体カラム）への負荷量が試料5.0ｇ相当量になるようにアセトン及びシクロヘキサン（１：４）混液に溶かす。はちみつの場合は、残留物をアセトン及びｎ−ヘキサン（１：１）混液に溶かし、正確に10 mL とする。
２）精製
(1) 筋肉、脂肪、魚介類、乳及び卵の場合
ａ ゲル浸透クロマトグラフィー
１）で得られた溶液を毎分3,000 回転で５分間遠心分離し、その上澄液５mL をゲル浸透クロマトグラフィー用カラム（スチレンジビニルベンゼン共重合体カラム）に注入し、アセトン及びシクロヘキサン（１：４）混液で溶出する。アクリナトリンの保持時間からトリシクラゾールの溶出終了までの溶出液を採り、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。残留物にアセトン及びｎ−ヘキサン（１：１）混液２mL を加えて溶かす。
ｂ エチレンジアミン−N−プロピルシリル化シリカゲルカラムクロマトグラフィー
エチレンジアミン−N−プロピルシリル化シリカゲルミニカラム（500 mg）にアセトン及びｎ-ヘキサン（１：１）混液10 mL を注入し、流出液は捨てる。このカラムにａで得られた溶液を注入し、さらに、アセトン及びｎ−ヘキサン（１：１）混液20 mL を注入して、全溶出液を採り、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。残留物をメタノールに溶かし、正確に５mL（脂肪の場合は2.5 mL）としたものを試験溶液とする。
(2) 肝臓及び腎臓の場合
ａ ゲル浸透クロマトグラフィー
１）で得られた溶液を毎分3,000 回転で５分間遠心分離し、その上澄液５mL をゲル浸透クロマトグラフィー用カラム（スチレンジビニルベンゼン共重合体カラム）に注入し、アセトン及びシクロヘキサン（１：４）混液で溶出する。アクリナトリンの保持時間からアクリナトリンの溶出終了までの画分（画分I）及び画分Iの分取終了からトリシクラゾールの溶出終了までの画分（画分II）を採る。
ｂ エチレンジアミン−N−プロピルシリル化シリカゲルカラムクロマトグラフィー
エチレンジアミン−N−プロピルシリル化シリカゲルミニカラム（500 mg）にアセトン及びシクロヘキサン（１：４）混液10 mL を注入し、流出液は捨てる。このカラムに画分Iを注入し、さらに、アセトン及びシクロヘキサン（１：４）混液５mL を注入して、全溶出液を採り、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。残留物にｎ−ヘキサン１mL を加えて溶かす。
ｃ シリカゲルカラムクロマトグラフィー
シリカゲルミニカラム（690 mg）にｎ−ヘキサン10 mL を注入し、流出液は捨てる。このカラムにｂで得られた溶液を注入し、さらに、ｎ−ヘキサン10 mL を注入し、流出液は捨てる。
次いで、カラムにエーテル及びｎ−ヘキサン（１：19）混液15 mL を注入し、溶出液をａで得られた画分IIに合わせ、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。残留物をメタノールに溶かし、正確に５mL としたものを試験溶液とする。
(3) はちみつの場合
エチレンジアミン−N−プロピルシリル化シリカゲルミニカラム（500 mg）にアセトン及びｎ−ヘキサン（１：１）混液10 mL を注入し、流出液は捨てる。このカラムに１）で得られたアセトン及びｎ−ヘキサン（１：１）混液溶液2.5 mL を注入し、さらに、アセトン及びｎ−ヘキサン（１：１）混液20 mL を注入して、全溶出液を採り、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。残留物をメタノールに溶解し、正確に５mL としたものを試験溶液とする。
５．検量線の作成
各農薬等の標準品について、それぞれのアセトニトリル溶液を調製し、それらを混合した後、適切な濃度範囲の各農薬等を含むメタノール溶液を数点調製する。それぞれ５μL をLC/MS又はLC/MS/MS に注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。
６．定量 試験溶液５μL をLC/MS 又はLC/MS/MS に注入し、５の検量線で各農薬等の含量を求める。
７．確認試験 LC/MS 又はLC/MS/MSにより確認する。
８．測定条件
LC/MS(/MS)
| カ | ラム：オクタデシルシリル化シリカゲル（粒径３〜3.5μm） 内径２〜2.1 mm、長さ150 mm |
移動相：A 液及びB 液について下の表の濃度勾配で送液する。
移動相流量：0.20 mL/分
| A 液： | ５mmol/L 酢酸アンモニウム水溶液 | |||||||||||||||||||||||||||
| B 液： | ５mmol/L 酢酸アンモニウムメタノール溶液
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主なイオン（m/z）：別表１及び別表２参照
保持時間の目安：別表１及び別表２参照
９．定量限界
別表１及び別表２参照
ただし、別表１及び別表２は測定限界（ng）の例を示したものである。
10．留意事項
１）試験法の概要
各農薬等を試料からアセトン及びｎ−ヘキサン（１：２）混液で抽出（乳、卵及びはちみつの場合はアセトニトリルで抽出）し、ゲル浸透クロマトグラフィー及びエチレンジアミン−N−プロピルシリル化シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（肝臓及び腎臓の場合はシリカゲルカラムクロマトグラフィーを追加し、はちみつの場合はゲル浸透クロマトグラフィーを省略する）、LC/MS又はLC/MS/MS で測定及び確認する方法である。
２）注意点
| (1) | 別表１及び別表２は本法を適用できる化合物を五十音順に示したものであるが、規制対象となる品目には本法を適用できない代謝物等の化合物が含まれる場合があるので留意すること。また、保持時間の異なる異性体は、化合物名欄に個別に示した。 | ||||||||
| (2) | 本試験法は別表１及び別表２に示した全ての化合物の同時分析を保証したものではない。化合物同士の相互作用による分解等及び測定への干渉等のおそれがあるため、分析対象とする化合物の組み合わせにおいてあらかじめこれらの点を検証する必要がある。 | ||||||||
| (3) | アセトニトリル抽出液に添加する塩化ナトリウム（10ｇ）が多すぎる場合は、減らしてもよいが、十分に飽和する量を加える。 | ||||||||
| (4) | 濃縮し、溶媒を完全に除去する操作は、窒素気流を用いて穏やかに行う。 | ||||||||
| (5) | ゲル浸透クロマトグラフィー条件の例を以下に示す。 カラム：スチレンジビニルベンゼン共重合体カラム（内径20 mm、長さ300 mm）にガードカラムとしてスチレンジビニルベンゼン共重合体カラム（内径20 mm、長さ100 mm）を接続したもの、又は同等品 移動相：アセトン及びシクロヘキサン（１：４）混液 流速：５mL/min カラム温度：40℃ 注入量：５mL モニター波長：254 nm 分取範囲：次の方法によりあらかじめ決定しておく。 アクリナトリン及びトリシクラゾールの５mg/L 混合溶液を移動相で調製し、その５mL をゲル浸透クロマトグラフィー用カラムに注入して254 nm でモニターし、溶出位置を確認する。溶出液を適当な間隔で分取してLC/MS で測定するなど他の適切な方法を用いてもよい。
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| (6) | ミニカラムは使用条件で各農薬等の溶出調査を事前に行い、溶出位置を確認してから使用する。 | ||||||||
| (7) | 脂肪含有量が高い試料では、試験溶液の濃縮倍率が低くなる。その際、目標の測定感度が得られない場合には、抽出脂肪を用いてゲル浸透クロマトグラフィー以降の操作を複数回行い、検液を合わせて試験溶液とする。 | ||||||||
| (8) | LC/MS 又はLC/MS/MS の感度によっては、試験溶液をさらにメタノールで希釈する。 | ||||||||
| (9) | 特にメタノール溶液中では不安定な農薬等があるため、測定は試験溶液の調製後速やかに行う。検量線用溶液は用時調製する。常温のオートサンプラーラック中に試験溶液を長時間置かない。 | ||||||||
| (10) | 正確な測定値を得るためには、マトリックス添加標準溶液又は標準添加法を用いることが必要な場合がある。 | ||||||||
| (11) | 定量限界は、使用する機器、試験溶液の濃縮倍率及び試験溶液注入量により異なるので、必要に応じて最適条件を検討する。 |
11．参考文献
なし
12．類型
C