HPLCによる動物用医薬品等の一斉試験法I（畜水産物）
１．分析対象化合物
別表参照
２．装置
多波長検出器付き高速液体クロマトグラフ（HPLC-DAD）又は蛍光検出器付き高速液体クロマトグラフ（HPLC-FL）又は液体クロマトグラフ・質量分析計（LC/MS）
３．試薬、試液
次に示すもの以外は、総則の３に示すものを用いる。
| ア | セトニトリル 高速液体クロマトグラフ用に製造されたもの。 |
| 水 | 高速液体クロマトグラフ用に製造されたもの。 |
| 各 | 動物用医薬品等標準品 各動物用医薬品等の純度が明らかなもの。 |
４．試験溶液調製法
試料5.00ｇを量り採り、アセトニトリル30 mL、アセトニトリル飽和ｎ-ヘキサン20 mL及び無水硫酸ナトリウム10ｇを加え、ホモジナイズした後、毎分3,000回転で５分間遠心分離し、有機層を採る。得られた有機層からアセトニトリル層を分取し、残ったｎ-ヘキサン層を遠心分離した残留物に加え、さらにアセトニトリル20 mLを加えて激しく振り混ぜた後、毎分3,000回転で５分間遠心分離する。ｎ-ヘキサン層を捨て、得られたアセトニトリル層を合わせ、ｎ-プロパノール10 mLを加えて、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。残留物にアセトニトリル及び水（４：６）混液1.0 mLを加えて溶かし、アセトニトリル飽和ヘキサン0.5 mLを積層して、毎分3,000回転で５分間遠心分離し、アセトニトリル-水層を試験溶液とする。
５．検量線の作成
各動物用医薬品等の標準品について、それぞれメタノール溶液を調製し、適切な濃度範囲の各動物用医薬品等を含むアセトニトリル及び水（４：６）混液溶液を数点調製する。それぞれ10μLをHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。
６．定量
試験溶液10μLをHPLCに注入し、５の検量線で各動物用医薬品等の含量を求める。
７．確認試験
LC/MS又はLC/MS/MSにより確認する。
８．測定条件
| 検 | 出器：別表参照 |
| カ | ラム：オクタデシルシリル化シリカゲル 内径3.0 mm、長さ150 mm、粒子径３μm |
| カ | ラム温度：40℃ |
| 移 | 動相：アセトニトリル及び0.05%トリフルオロ酢酸溶液混液（１：99）から（１：０）までの濃度勾配を35分間で行い、（１：０）で５分間保持する。LC/MSにおいてESI（-）で測定する際には、0.05%トリフルオロ酢酸溶液を0.1%ギ酸溶液に置き換える。 |
| 検 | 出条件：別表参照 |
９．定量限界
別表参照
10．留意事項
１）試験法の概要
各動物用医薬品等を試料からアセトニトリルで抽出し、脂質及び脂溶性夾雑物はｎ-ヘキサンで除き、水及び水溶性夾雑物は無水硫酸ナトリウムで除いた後、HPLC-DAD、HPLC-FL又はLC/MSで測定する方法である。
２）注意点
| (1) | 別表は本法を適用できる化合物を五十音順に示したものであるが、規制対象となる品目には本法を適用できない代謝物等の化合物が含まれる場合があるので留意すること。 |
| (2) | 本試験法は別表に示した全ての化合物の同時分析を保証したものではない。化合物同士の相互作用による分解等及び測定への干渉等のおそれがあるため、分析対象とする化合物の組み合わせにおいてあらかじめこれらの点を検証する必要がある。 |
| (3) | 空気酸化、光分解を起こしやすい動物用医薬品等があるので、全操作は遮光下で迅速に行う。 |
| (4) | 標準品がメタノールに溶けにくい場合は、少量のN,N-ジメチルホルムアミドに溶解後、メタノールで希釈する。 |
| (5) | 濃縮し、溶媒を完全に除去する操作は、窒素気流を用いて穏やかに行う。 |
| (6) | LC/MS又はLC/MS/MSの感度によっては、試験溶液をさらにHPLCの移動相で希釈する。 |
| (7) | 絶対検量線法により一定の真度及び精度が得られなくても、安定同位体を用いた内標準法、標準添加法により補正できる場合がある。 |
| (8) | 定量限界は、使用する機器、試験溶液の濃縮倍率及び試験溶液注入量により異なるので、必要に応じて最適条件を検討する。 |
11．参考文献
| １ | ）村山三徳ら，食衛誌，32，155-160（1991） |
| ２ | ）厚生労働省監修「食品衛生検査指針（動物用医薬品・飼料添加物編）」p.26-43，（社）日本食品衛生協会（2003） |
12．類型
C