オルトフェニルフェノール及びジフェニル試験法(農産物)


1. 分析対象化合物
農薬等の成分である物質 分析対象化合物
オルトフェニルフェノール オルトフェニルフェノール
  オルトフェニルフェノールナトリウム塩
ジフェニル ジフェニル

2.装置
  蛍光検出器付き高速液体クロマトグラフ(HPLC-FL)
  液体クロマトグラフ・質量分析計(LC/MS)

3.試薬、試液
  次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。
  オルトフェニルフェノール標準品 本品はオルトフェニルフェノール 99%以上を含む。
  ジフェニル標準品 本品はジフェニル 99%以上を含む。

4.試験溶液の調製
  穀類の場合は、試料10.0gを量り採り、水20 mLを加えて2時間放置する。
  果実、野菜及びハーブの場合は、試料20.0gを量り採る。
  これに無水酢酸ナトリウム2g及び無水硫酸ナトリウム30gを加えてよく混和した後、酢酸エチル80 mLを加え、 ホモジナイズする。これを遠心分離し、酢酸エチル層を採り、残留物に酢酸エチル80 mLを加えて、同様に操作する。得られた酢酸エチル層を合わせ、−ブタノール5mLを加えて、40℃以下で濃縮し、酢酸エチルを除去する。残留物をHPLC用移動相に溶かし、正確に20 mLとし、0.45μmのメンブランフィルターでろ過したものを試験溶液とする。

5.検量線の作成
  オルトフェニルフェノール標準品及びジフェニル標準品各100 mgを量り、それぞれメタノール50 mLに溶解した後、HPLC用移動相を加えて100 mLとしたものを標準溶液とする。各標準溶液10 mLを採り、−ブタノール25 mLを加え、HPLC用移動相を加えて100 mLとしたものを混合標準溶液とする。混合標準溶液をHPLC用移動相で希釈し、オルトフェニルフェノール及びジフェニルの 0.1〜8μg/mL溶液を数点調製する。それぞれ 10μLをHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

6.定量
  試験溶液 10μLをHPLCに注入し、5の検量線でオルトフェニルフェノール及びジフェニルの含量を求める。

7.確認試験
  LC/MSにより確認する。

8.測定条件
  HPLC
  検出器:FL(励起波長285 nm、蛍光波長325 nm)
  カラム:オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm) 内径4.6〜6.0 mm、 長さ150〜250 mm
  カラム温度:40℃
  移動相:アセトニトリル、水及びメタノール(1:7:12)混液に10 mmol/Lになるようにドデシル硫酸ナトリウムを加えた後、リン酸でpHを2.3〜2.5とする。
  注入量:10μL
  保持時間の目安:オルトフェニルフェノール、ジフェニルの順に溶出する。

  LC/MS
  カラム:オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm) 内径3.0 mm、 長さ150 mm
  カラム温度:40℃
  移動相:水及びメタノール混液(2:3)から(0:1)までの濃度勾配を10分間で行った後、2分間保持する。
  イオン化モード:オルトフェニルフェノール APPI(−)、ジフェニル APPI(+)
  主なイオン(m/z):オルトフェニルフェノール 169、141、ジフェニル 154、153
  保持時間の目安:オルトフェニルフェノール 7分、ジフェニル 10分

9.定量限界
  オルトフェニルフェノール:0.1 mg/kg
  ジフェニル:0.2 mg/kg

10.留意事項
1)試験法の概要
  オルトフェニルフェノール及びジフェニルを試料から酢酸エチルで抽出し、HPLC-FLで測定し、LC/MSで確認する方法である。

2)注意点
(1)   無水酢酸ナトリウムはpHを調整するために加える。グレープフルーツ、オレンジなどでは1gの添加でpH調整できる。
(2)   無水硫酸ナトリウムの量は試料により、適宜増量する。
(3)   −ブタノールは、減圧濃縮中にジフェニルが損失するのを防ぐために加える。
(4)   妨害が多く測定が困難な場合は、酢酸エチル層をろ紙でろ過すること、酢酸エチル層を水及び0.025 mol/L硫酸各50 mLで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで脱水して濃縮すること、HPLCの移動相の混合比を変えることなどにより改善できる。
(5)   オルトフェニルフェノール及びジフェニルの励起極大波長は、それぞれ290、254 nmであり、蛍光極大波長はそれぞれ315、345 nmである。

11.参考文献
  日本薬学会編「衛生試験法・注解2005」p.307-309、金原出版株式会社

12.類型
  D (厚生労働省監修「食品衛生検査指針 食品添加物編」p.117-122、p.123-124 (2003)日本食品衛生協会。LC/MS測定条件については、N. Yoshioka, et.al., Rapid simultaneous determination of o-phenylphenol, diphenyl, thiabendazole, imazalil and its major metabolite in citrus fruits by liquid chromatography-mass spectrometry using atmosphericpressure photoionization, Journal of Chromatography A, 1022,145-150,2004)

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