ジクワット、パラコート及びメピコートクロリド試験法(農作物)

1.分析対象化合物
農薬等の成分である物質 分析対象化合物
ジクワット ジクワット
パラコート パラコート
メピコートクロリド メピコートクロリド

2.装置
 蛍光検出器付き高速液体クロマトグラフ(HPLC-FL)
 液体クロマトグラフ・質量分析計(LC/MS)

3.試薬、試液
 次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。
 ジピクリルアミンナトリウム ジピクリルアミンナトリウム
 プロピルスルホニルシリル化シリカゲルミニカラム(500 mg) 内径12〜13 mmのポリエチレン製のカラム管に、プロピルスルホニルシリル化シリカゲル500 mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離特性を有するもの。
 ヘプタフルオロ--ブチル酸 ヘプタフルオロ--ブチル酸
 ジクワット標準品 本品はジクワット98%以上を含む。
 パラコート標準品 本品はパラコート99%以上を含む。
 メピコートクロリド標準品 本品はメピコートクロリド99%以上を含む。

4.試験溶液の調製
1)抽出
(1) 穀類、豆類、種実類、果実、野菜、ハーブ、抹茶及びホップの場合
 穀類、豆類及び種実類の場合は試料10.0gを量り採る。抹茶及びホップの場合は試料5.00gを量り採る。果実、野菜及びハーブの場合は試料20.0gを量り採る。 これに水60 mL及び硫酸30 mLを加え、混合する。沸騰石2〜3粒及び消泡剤約1mLを加え、還流冷却器を付けて5時間加熱還流する。放冷後、ガラス繊維ろ紙(GFP)を用いて吸引ろ過し、ろ紙上の残留物に水50 mLを加えて、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせ、水を加えて正確に200 mLとする。その20 mL(試料1g相当、抹茶及びホップの場合は40 mL、果実、野菜及びハーブの場合は10 mL)を正確に取り、12 mol/L水酸化ナトリウム溶液を加えてpH7に調整する。

(2) 抹茶以外の茶の場合
 試料9.00gに100℃の水540 mLを加え、室温で5分間放置した後、ろ過する。冷後、ろ液60 mLを採り、硫酸30 mLを加え、混合する。沸騰石2〜3粒及び消泡剤約1mLを加え、還流冷却器を付けて5時間加熱還流する。放冷後、ガラス繊維ろ紙(GFP)を用いて吸引ろ過し、ろ紙上の残留物に水50 mLを加えて、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせ、水を加えて正確に200 mLとする。その20 mL(試料0.1g相当)を正確に取り、12 mol/L水酸化ナトリウム溶液を加えてpH7に調整する。

)精製
 プロピルスルホニルシリル化シリカゲルミニカラム(500 mg)にメタノール10 mL及び水10 mLを順次注入し、各流出液は捨てる。このカラムに、1)で得られた溶液を注入した後、流出液は捨てる。さらに水10 mL及びメタノール10 mLを順次注入し、流出液は捨てる。次いで、飽和塩化アンモニウム・メタノール溶液20 mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、窒素ガスを送って乾固する(I、メピコートクロリド画分)。さらに、ミニカラムに5mol/L塩化アンモニウム溶液20 mLを注入し、溶出液に5mol/L塩化アンモニウム溶液を加えて正確に20 mLとする(II、ジクワット及びパラコート画分)。

)ジクロロメタン転溶及びジクロロメタン洗浄(メピコートクロリド画分)
 (I)の残留物に0.05%ジピクリルアミンナトリウム溶液20 mLを加えて溶かし、12 mol/L水酸化ナトリウム溶液1mLを加え、pH13とする。これをジクロロメタン30 mLずつで3回振とう抽出する。ジクロロメタン層を合わせて綿栓ろ過後、40℃以下で濃縮し、窒素ガスを送って乾固する。残留物に2mol/L塩酸50 mLを加えて溶かす。これを、ジクロロメタン10 mLずつで2回洗浄した後、60℃以下で濃縮し、窒素ガスを送って乾固する。この残留物を5mmol/Lヘプタフルオロ--ブチル酸溶液に溶解し、正確に2mLとしたものをメピコートクロリド試験溶液とする。

4)蛍光誘導体化(酸化)(ジクワット及びパラコート画分)
(1) ジクワット
 (II)の溶液5mLを正確に採り、12 mol/L水酸化ナトリウム溶液25 mL及び1%フェリシアン化カリウム溶液1mLを加え、均一になるように振り混ぜた後、エーテル20 mLずつで2回振とう抽出する。エーテル層を合わせて無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、窒素ガスを送って乾固する。この残留物をアセトニトリル及び水 (1:9) 混液に溶解し、正確に2mLとしたものをジクワット試験溶液とする。
(2) パラコート
 (II)の溶液10 mLを正確に採り、12 mol/L水酸化ナトリウム溶液10 mL及び1%フェリシアン化カリウム溶液1mLを加え、均一になるように振り混ぜた後、ジクロロメタン20 mLずつで2回振とう抽出する。ジクロロメタン層を合わせ、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で減圧濃縮し、窒素ガスを送って乾固する。この残留物をアセトニトリル及び水 (1:9) 混液に溶解し、正確に2mLとしたものをパラコート試験溶液とする。

5.検量線の作成
)ジクワット
 ジクワット標準品の4mg/L 0.01 mol/L塩酸溶液を調製し、その0.5 mLに5mol/L塩化アンモニウム溶液5mLを加え、以下4の4)「蛍光誘導体化(酸化)」(1)に従って操作する。濃縮残留物をアセトニトリル及び水 (1:9) 混液に溶解し、正確に20 mLとする(0.1 mg/L)。これを適宜希釈して、0.00125〜0.05 mg/Lの溶液を調製し、それぞれ40μLをHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。
)パラコート
 パラコート標準品の4mg/L 0.01 mol/L塩酸溶液を調製し、その0.5 mLに5mol/L塩化アンモニウム溶液10 mLを加え、以下4の4)「蛍光誘導体化(酸化)」(2)に従って操作する。濃縮残留物をアセトニトリル及び水(1:9)混液に溶解し、正確に20 mLとする(0.1 mg/L)。これを適宜希釈して、0.0025〜0.1 mg/Lの溶液を調製し、それぞれ20μLをHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。
)メピコートクロリド
 メピコートクロリド標準品の0.005〜0.2 mg/L 5mmol/Lヘプタフルオロ--ブチル酸溶液を数点調製し、それぞれ10μLをLC/MSに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

6.定量
)ジクワット
試験溶液40μLをHPLCに注入し、5.1)の検量線でジクワットの含量を求める。
)パラコート
試験溶液20μLをHPLCに注入し、5.2)の検量線でパラコートの含量を求める。
)メピコートクロリド
試験溶液10μLをLC/MSに注入し、5.3)の検量線でメピコートクロリドの含量を求める。

7.確認試験
 LC/MSにより確認する。

8. 測定条件
1)HPLC(ジクワット及びパラコートの場合)
カラム:トリアコンチルシリル化シリカゲル(粒径5μm)、内径 4.6 mm、長さ 250 mm
カラム温度:40℃
移動相:アセトニトリル及び水 (8:92) 混液
測定波長:励起波長 368 nm、蛍光波長 430 nm(ジクワット)
励起波長 330 nm、蛍光波長 436 nm(パラコート)
保持時間の目安:18.5分(ジクワット)、20分(パラコート)

2)LC/MS(メピコートクロリドの場合)
カラム:オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)、内径2〜3mm、長さ150 mm
カラム温度:40℃
移動相:5mmol/Lヘプタフルオロ--ブチル酸及びメタノール混液(95:5)から(1:1)までの濃度勾配を5分間で行う。
イオン化モード:ESI(+)
主なイオン(m/z): 114
保持時間の目安:9分

3)LC/MS(ジクワット及びパラコートの場合)
カラム:オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)、内径2〜3mm、長さ150 mm
カラム温度:40℃
移動相:アセトニトリル及び0.1%酢酸(1:9)混液
イオン化モード:ESI(+)
主なイオン(m/z):ジクワット;215、パラコート;217
注入量:ジクワット10μL、パラコート 5μL
保持時間の目安:ジクワット 5.7分、パラコート 5.4〜5.6分

9. 定量限界
 各農薬 0.01 mg/kg(抹茶以外の茶の場合は0.1 mg/kg)

10. 留意事項
)試験法の概要
 ジクワット、パラコート及びメピコートクロリドを試料から6mol/L硫酸で加熱還流抽出し、プロピルスルホニルシリル化シリカゲルミニカラムによる精製でメピコートクロリド画分(I)とジクワット及びパラコート画分(II)に分ける。メピコートクロリド画分(I)についてはジクロロメタン転溶、次いで塩酸酸性下ジクロロメタン洗浄を行った後、LC/MSで測定する。ジクワット及びパラコート画分(II)については蛍光誘導体化(酸化)後、HPLCで測定し、LC/MSで確認する方法である。

ジクワットの蛍光誘導体化
図

パラコートの蛍光誘導体化
図

)注意点
 (1) 0.05%ジピクリルアミンナトリウム溶液は、調製後時間が経過したものを使用すると、メピコートクロリドの転溶率が低下する。
 (2) ジクワット及びパラコートの蛍光誘導体のLC/MSにおける感度は、HPLC-FL法の1/4である。基準値と比較して定量限界が高い場合は、蛍光誘導化に供する溶液量を適宜増加して定量限界を下げる。

11.参考文献
1)環境省告示第20号「ジクアトジブロミド試験法」(昭和61年4月14日)
2)環境省告示第40号「パラクアトジクロリド試験法」(昭和51年6月11日)
3)環境省告示第21号「メピコートクロリド試験法」(平成3年4月1日)
4)飼料分析基準研究会編著「飼料分析法・解説」 p.6-148〜6-152(社)日本科学飼料協会
5)赤木浩一、食品衛生学雑誌、45、197-200、2004
6)大倉ら、平成元年度愛媛衛研年報、51、27-32、1990

12.類型
  C

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