ジノカップ試験法（農産物）

１．分析対象化合物
　ジノカップ、ジノカップ分解物（２,４-ジニトロ-６-オクチルフェノール（以下、「2,4-DNOP」という。）及び２,６-ジニトロ-４-オクチルフェノール（以下、「2,6-DNOP」という。））

２．装置
　液体クロマトグラフ・質量分析計（LC /MS）

３．試薬・試液
　次に示すもの以外は、総則の３に示すものを用いる。
　１mol/Lリン酸緩衝液（pＨ6.9）　リン酸一カリウム68.0ｇ及びリン酸二ナトリウム71.0ｇに水を加えて溶かし、1,000 mLとする。
　ジノカップ標準品　本品はジノカップ92％以上を含み、融点は138〜140℃である。

４．試験溶液の調製
１）抽出
　穀類の場合は、試料10.0ｇに水20 mLを加え、２時間放置する。果実及び野菜の場合は、試料10.0ｇを量り採る。
　これにアセトニトリル50 mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物をアセトニトリル20 mLで洗浄、ろ過し、ろ液を合わせ、アセトニトリルを加えて正確に100 mLとする。この20 mLを採り、塩化ナトリウム10ｇ及び１mol/Lリン酸緩衝液（pＨ6.9）20 mLを加え、10分間振とうする。静置した後、分離した水層を捨てる。

２）精製
　オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム（500 mg）にアセトニトリル10 mLを注入し、流出液は捨てる。これに１）で得られたアセトニトリル溶液を注入し、さらに、アセトニトリル４mLを注入して、全溶出液を採り、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。

３）加水分解
　２）で得られた残留物をメタノール２mLに溶解し、１mol/L水酸化ナトリウム溶液10 mLを加え、１分間振とうし、30分間放置する。反応液に1.2 mol/L塩酸10 mLを加え、ｎ-ヘキサン20 mLずつで２回振とう抽出する。この抽出液に、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をメタノールに溶解し、正確に10 mLとしたものを試験溶液とする。

５．検量線の作成
　ジノカップ標準品の100 mg/Lメタノール溶液を調製し、この２mLを採り、４．３）と同様の操作を行い、その残留物にメタノールを加えて溶かし、10 mLとし、ジノカップ分解物（2,4-DNOP及び2,6-DNOP）のメタノール溶液とする。これをメタノールで希釈し、ジノカップとして0.002〜0.2 mg/L の標準溶液を数点調製し、それぞれ10μLをLC/MSに注入する。各異性体の濃度（ジノカップとしての値）を横軸にとり、ピーク高法又はピーク面積法で各異性体毎に検量線を作成する。
　各異性体の濃度は、フラグメントイオンが生じないm/z 295の条件で測定して得られた４本の異性体ピークの高さ比又は面積比を各異性体の存在比として算出する。

６．定量
　 試験溶液10μLをLC/MSに注入し、各異性体ピークの高さ又は面積を用いて、５の検量線でジノカップ分解物の各異性体の含量を求め、合算してジノカップの含量を求める。

７．確認試験
　LC/MSにより確認する。

８．測定条件
　LC/MS
　カラム：オクタデシルシリル化シリカゲル（粒径５μm）、内径２mm、長さ150 mm
　カラム温度：40℃
　移動相：0.1％ギ酸及びメタノール混液（２：８）を１分間送液した後、（２：８）から（１：９）までの濃度勾配を２分間で行い、（１：９）で17分間送液する。次いで、（１：９）から（２：８）までの濃度勾配を２分間で行い、（２：８）で13分間送液する。
　イオン化モード：ESI（−）
　主なイオン（m/z）：209、295
　保持時間の目安：４本の異性体ピーク９〜11分

９．定量限界
　0.01 mg/kg

10．留意事項
１）試験法の概要
　ジノカップ及びジノカップ分解物（2,4-DNOP及び2,6-DNOP）を試料からアセトニトリルで抽出し、塩析で水を除いた後、オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムで精製後、アルカリで加水分解し、ジノカップをジノカップ分解物に変換する。酸性下でジノカップ分解物をｎ-ヘキサンで抽出し、LC/MSで測定及び確認する方法である。

２）注意点
(1) 通常、室温30分間放置の条件で、アルカリ加水分解の反応が完結するが、標準溶液等は、HPLC-UV又はGC/MSを用いて、ジノカップの未反応物が存在していないことを確認する。ジノカップはHPLC-UVで測定可能であり、ジノカップ及びジノカップ分解物はGC/MSでも測定可能であるが、いずれも感度が低いため、残留分析には使用できない。
(2) ジノカップ分解物のm/z 295での測定は、農産物の種類によっては夾雑物ピークのために定量が困難であることから、夾雑物ピークが少ないm/z 209（フラグメントイオン）で測定及び定量を行う。
(3) ジノカップは異性体（６種）の混合物である。本測定条件でジノカップ分解物として４本のピークが検出される。ジノカップ分解物の分子量は296.3であり、LC/MS（m/z 295）による測定時の異性体ピークの面積比はHPLC-UV（260 nm）による測定時とほぼ等しいが、フラグメントイオンであるm/z 209で測定した場合は、HPLC-UV（260 nm）測定による面積比とは異なる。そこで、LC/MS（m/z 209）で測定し、異性体ピーク高さ又は面積の総和で定量すると、標準品と残留物の異性体組成比が異なる場合、誤差を生じるおそれがあるため、各異性体毎に定量した値を合計して分析値とする。
(4) 夾雑物ピークによる妨害が認められた場合は、試験溶液を適宜希釈して測定を行う。

11．参考文献
１）環境省告示第20号「ジノカップ試験法」（平成９年４月30日）
２）農薬残留分析法研究班編「最新農薬の残留分析法」p.228-229、中央法規出版（1995）

12．類型
　Ｃ
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