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クロチアニジン試験法(農産物)

1.分析対象化合物

 クロチアニジン

2.装置

 紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ(HPLC(UV))
 液体クロマトグラフ・質量分析計(LC/MS)

3.試薬、試液

 次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。
 クロチアニジン標準品 本品はクロチアニジン99%以上を含み、融点は176.8℃である。
 ベンゼンスルホニルプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(1,000mg) 内径8〜9mmのポリエチレン製のカラム管に,ベンゼンスルホニルプロピルシリル化シリカゲル1,000mgを充てんしたもの又はこれと同等の分離特性を有するものを用いる。

4.試験溶液の調製

  1. 1)抽出
    1. (1) 穀類、豆類及び種実類の場合
       試料10.0gを量り採り、水20mLを加え、2時間放置する。これにアセトン100mLを加え、3分間ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトン50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、40℃以下で約30mLに濃縮する。これに10%塩化ナトリウム溶液100mLを加え、n−ヘキサン100mLで洗浄した後、酢酸エチル100mLずつで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。
       この残留物にn−ヘキサン30mLを加え、n−ヘキサン飽和アセトニトリル30mLずつで3回振とう抽出する。アセトニトリル層を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン3mLを加え、完全に溶かした後、n−ヘキサン7mLを加えて混合する。
    2. (2) 果実及び野菜の場合
       試料20.0gを量り採り、アセトン100mLを加え、3分間ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトン50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、40℃以下で約30mLに濃縮する。これに10%塩化ナトリウム溶液100mLを加え、n−ヘキサン100mLで洗浄した後、酢酸エチル100mLずつで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン3mLを加え、完全に溶かした後、n−ヘキサン7mLを加えて混合する。
    3. (3) 茶の場合
       試料5.00gを量り採り、水20mLを加え、2時間放置する。これにアセトン100mLを加え、3分間ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトン50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、40℃以下で約30mLに濃縮する。これに10%塩化ナトリウム溶液100mLを加え、n−ヘキサン100mLで洗浄した後、酢酸エチル100mLずつで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液に酢酸エチルを加えて正確に250mLとする。この50mLを40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン3mLを加え、完全に溶かした後、n−ヘキサン7mLを加えて混合する。
  2. 2)精製
    1. (1) シリカゲルカラムクロマトグラフィー
       クロマトグラフ管(内径15mm)に、カラムクロマトグラフィー用シリカゲル(粒径63〜200μm)10gをn−ヘキサンに懸濁させて充てんし、無水硫酸ナトリウム5gを積層する。このカラムに、1)で得られた溶液を注入した後、アセトン・n−ヘキサン混液(3:7)50mLを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトン・n−ヘキサン混液(1:1)100mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物に酢酸エチル5mLを加えて溶かす。
    2. (2)  ベンゼンスルホニルプロピルシリル化シリカゲルクロマトグラフィー
       ベンゼンスルホニルプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(1,000mg)にメタノール及び酢酸エチル各5mLを順次注入し、流出液は捨てる。このカラムに(1)で得られた溶液を注入した後、さらにアセトン5mLを注入し、流出液は捨てる。次いでメタノール10mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物に酢酸エチル5mLを加えて溶かす。
    3. (3) 中性アルミナカラムクロマトグラフィー
       中性アルミナミニカラム(1,710mg)に酢酸エチル5mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに(2)で得られた溶液を注入した後、酢酸エチル10mLを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトン20mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物を水・メタノール混液(7:3)に溶解し、穀類、豆類及び種実類の場合は正確に2mL、果実及び野菜の場合は正確に4mL、茶の場合は正確に2mLとしたものを試験溶液とする。

5.検量線の作成

 クロチアニジン標準品の0.025〜0.5mg/L水・メタノール混液(7:3)溶液を数点調製し、それぞれ20μLをHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

6.定量

 試験溶液20μLをHPLCに注入し、5の検量線でクロチアニジンの含量を求める。

7.測定条件

  1. 1)HPLC
     検出器:UV(波長265nm)
     カラム:オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)、内径4.6mm、長さ250mm
     カラム温度:40℃
     移動相:水・メタノール混液(7:3)
     保持時間の目安:約15分
  2. 2)LC/MS
     カラム:オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)、内径2.1mm、長さ150mm
     カラム温度:40℃
     移動相:アセトニトリル・0.01%ギ酸溶液混液(1:9)から(1:1)までの濃度勾配を5分間で行い、(1:1)で5分間保持した後、さらに(9:1)で5分間保持する。
     イオン化モード:ESI
     主なイオン(m/z):正イオンモード250
     注入量:4μL
     保持時間の目安:約11分

8.定量限界

 0.005mg/kg(茶:0.05mg/kg)

9.留意事項

  1. 1)試験法の概要
     クロチアニジンを試料からアセトンで抽出し、n−ヘキサンで洗浄後、酢酸エチルに転溶する。果実、野菜、茶はそのまま、穀類、豆類、種実類はアセトニトリル/n−ヘキサン分配で脱脂した後、シリカゲルカラム、ベンゼンスルホニルプロピルシリル化シリカゲルミニカラム及び中性アルミナミニカラムにより精製し、HPLC(UV)で定量、LC/MSで確認する方法である。
  2. 2)注意点
    1. (1) 豆類等はn−ヘキサンでの洗浄時、酢酸エチルへの転溶時及びアセトニトリル/n−ヘキサン分配時にエマルジョンを形成しやすく、回収率の低下を招くので激しい振とうは避ける。
    2. (2) シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行う際、試料によってはミニカラム注入前の残留物がアセトン・n−ヘキサン混液(3:7)に溶解しないことがあるので、アセトンに完全に溶解した後に、n−ヘキサンを加える必要がある。
    3. (3) シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、夾雑物の少ない試料では省略可能である。
    4. (4) LC/MS分析では、クロチアニジン溶出後に移動相のアセトニトリルの比率を上げてカラム内に残存する夾雑物を溶出させることで、イオン化阻害を回避できる。

10.参考文献

 平成14年環境省告示第35号「クロチアニジン試験法」

11.類型

C

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