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ビフェナゼート試験法(農産物)

1.分析対象化合物

 ビフェナゼート
 イソプロピル=2-(4-メトキシビフェニル-3-イル)ジアゼニルホルマート(以下「ビフェナゼート酸化体」という。)

2.装置

 蛍光検出器付き高速液体クロマトグラフ(HPLC(FL))
 液体クロマトグラフ・質量分析計(LC/MS)

3.試薬、試液

 次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。
 1,5−ジフェニルカルボノヒドラジド(以下「DPH」という。)
 ビフェナゼート標準品本品はビフェナゼート99%以上を含む。

4.試験溶液の調製

  1. 1)抽出
     果実及び野菜の場合は、試料20.0gを量り採る。茶の場合は、試料4.0gを量り採り、これに水20mLを加え、2時間放置する。
     これに0.5%DPH含有アセトニトリル10mL及びアセトニトリル・水混液(3:2)100mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、アセトニトリル・水混液(3:2)50mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液にアセトニトリルを加えて正確に200mLとし、この50mLを採り、40℃以下で約20mLまで濃縮する。これに10%塩化ナトリウム溶液100mLを加え、酢酸エチル・n−ヘキサン混液(1:9)100mL及び50mLで2回振とう抽出する。抽出液を液相分離ろ紙でろ過した後、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物に2%アスコルビン酸・アセトニトリル混液(2:3)10mLを加えて溶かし、50℃で30分間加温する。放冷後、0.1%DPH含有アセトニトリル0.5mLを加える。
  2. 2)精製
     活性炭ミニカラム(500mg)に0.01%DPH含有アセトニトリル10mL及び水10mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに、1)で得られた溶液を注入した後、0.01%DPH含有アセトニトリル・水混液(3:2)5mLを注入し、流出液は捨てる。次いで、0.01%DPH含有アセトニトリル25mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物を0.02%アスコルビン酸・アセトニトリル混液(2:3)に溶解し、正確に2mLとしたものを試験溶液とする。

5.検量線の作成

 ビフェナゼート標準品の0.05〜1mg/L0.02%アスコルビン酸・アセトニトリル混液(2:3)溶液を数点調製し、それぞれ50μLをHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

6.定量

 試験溶液50μLをHPLCに注入し、5の検量線でビフェナゼートの含量を求める。

7.測定条件

  1. 1)HPLC
    検出器 : FL(励起波長266nm、蛍光波長427nm)
    カラム : オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)、内径4〜4.6mm、長さ250mm
    カラム温度 : 40℃
    移動相 : アセトニトリル・水混液(1:1)
    保持時間の目安 : 約18分
  2. 2)LC/MS
    カラム : オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)、内径2mm、長さ150mm
    移動相 : アセトニトリル・水混液(1:1)
    イオン化モード : ESI
    主なイオン(m/z) : 正イオンモード301
    注入量 : 5μL
    保持時間の目安 : 約10分

8.定量限界

 0.02mg/kg(茶の場合は0.1mg/kg)

9.留意事項

  1. 1)試験法の概要
     ビフェナゼート及びビフェナゼート酸化体を試料からDPH共存下でアセトニトリル・水混液(3:2)で抽出し、酢酸エチル・n−ヘキサン混液(1:9)に転溶する。還元処理(2%アスコルビン酸・アセトニトリル混液中、50℃で30分間反応)によりビフェナゼート酸化体をビフェナゼートに変換し、さらに、活性炭ミニカラムにより精製した後、HPLC(FL)で測定し、LC/MSで確認する方法である。
  2. 2)注意点
    1. (1) 回収が不良の場合は、以下の方法に変更することにより改善される場合がある。抽出液を濃縮せずに水で500mL定容とし、その125mLを取り、これをオクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(500mg:アセトニトリル及び水の各5mLで順次洗浄したもの)に負荷した後、2%アスコルビン酸・アセトニトリル混液(2:3)10mLで溶出し、これを50℃で30分間加温し、放冷後、0.1%DPH含有アセトニトリル0.5mLを加え、以下、4.試験溶液の調製の2)の精製と同様の操作を行う。
      (操作内容の詳細は参考文献を参照)
    2. (2) 精製が不十分な場合は、アミノプロピルシリル化シリカゲルミニカラム(360mg)による精製を追加するとよい。操作概要を以下に記す。活性炭ミニカラム精製後の残留物を0.01%DPH含有酢酸エチル・n−ヘキサン混液(1:4)5mLに溶解し、これをミニカラム(n−ヘキサン5mLで洗浄したもの)に負荷し、さらに同混液20mLを流下し、全溶出液を採る。なお、追加精製を実施しても改善が見られない場合は、(1)の方法に変更することも有効である。
    3. (3) 転溶溶媒を脱水するために、液相分離ろ紙の代わりに無水硫酸ナトリウムを使用した場合は、回収率の低下を招く。

10.参考文献

 環境省告示第53号ビフェナゼート試験法(平成12年8月17日)

11.類型

 C

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