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プロヘキサジオンカルシウム塩試験法


1. 分析対象化合物
プロヘキサジオンカルシウム塩、プロヘキサジオン

2. 装置
紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフを用いる。

3. 試薬、試液
総則の3に示すものを用いる。

4. 標準品
プロヘキサジオン 本品はプロヘキサジオン99%以上を含む。
融点 本品の融点は121°である。

5. 試験溶液の調製
a 抽出法
検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後,その10.0gを量り採り,0.2mol/l硫酸20mlを加え,2時間放置する。
これにアセトン100mlを加え,3分間細砕した後,ろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り,アセトン50mlを加え,3分間細砕した後,上記と同様に操作して,ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ,40°以下で約20mlに濃縮する。
これを200mlの分液漏斗に移す。n−ヘキサン50ml及び水50mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い,洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後,静置し,n−ヘキサン層を捨てる。水層にn−ヘキサン及び酢酸エチルの混液(7:3)50mlを加え,振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後,静置し,n−ヘキサン及び酢酸エチルの層を200mlの三角フラスコに移す。水層にn−ヘキサン及び酢酸エチルの混液(7:3)50mlを加え,上記と同様の操作を2回繰り返し,n−ヘキサン及び酢酸エチルの層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え,時々振り混ぜながら15分間放置した後,すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn−ヘキサン及び酢酸エチルの混液(7:3)20mlを用いて三角フラスコを洗い,その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ,40°以下でn−ヘキサン及び酢酸エチルを除去する。この残留物に1%炭酸水素ナトリウム溶液5mlを加えて溶かす。
b 精製法
オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(850mg)に,メタノール10mlを注入し,流出液は捨てる。次いで水10mlを注入し,流出液は捨てる。このカラムにa 抽出法で得られた溶液を注入し,流出液を50mlの三角フラスコに採る。上記の減圧濃縮器のナス型フラスコの残留物に1%炭酸水素ナトリウム溶液5mlを加え,上記と同様の操作を3回繰り返し,流出液を上記の三角フラスコに合わせる。これを100mlの分液漏斗に移す。水10ml及び酢酸エチル30mlを用いて上記の三角フラスコを洗い,上記の洗液を分液漏斗に合わせる。これに4mol/l塩酸3mlを加え,振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後,静置し,酢酸エチル層を100mlの三角フラスコに移す。水層に酢酸エチル30mlを加え,上記と同様に操作して,酢酸エチル層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え,時々振り混ぜながら15分間放置した後,すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いで酢酸エチル20mlを用いて三角フラスコを洗い,その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ,40°以下で酢酸エチルを除去する。
c メチル化
この残留物にメタノール4ml及び硫酸0.05mlを加えて溶かし,室温で12時間以上放置した後,100mlの分液漏斗に移す。2%炭酸水素ナトリウム溶液30ml及びn−ヘキサン30mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い,洗液を分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後,静置し,n−ヘキサン層を捨てる。水層にn−ヘキサン30mlを加え,上記と同様の操作を繰り返し,n−ヘキサン層を捨てる。水層に4mol/l塩酸5ml及びn−ヘキサン30mlを加え,振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後,静置し,n−ヘキサン層を200mlの三角フラスコに移す。水層にn−ヘキサン30mlを加え,上記と同様の操作を2回繰り返し,n−ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え,時々振り混ぜながら15分間放置した後,すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn−ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い,その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ,40°以下でヘキサンを除去する。この残留物にアセトニトリル,水及び酢酸の混液(30:70:0.5)を加えて溶かし,正確に1mlとしてこれを試験溶液とする。

6. 操作法
a 定性試験
次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品について,5.試験溶液の調製のc メチル化と同様に操作して得られたものと一致しなければならない。
操作条件
カラム充てん剤 オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)を用いる。
クロマトグラフ管 内径4.6mm,長さ150mmのステンレス管を用いる。
カラム温度 40°
検出器 波長275nmで操作する。
移動相 アセトニトリル,水及び酢酸の混液(30:70:0.5)を用いる。メチル−3,5−ジオキソ−4−プロピオニルシクロヘキサンカルボキシラートが約10分で流出する流速に調整する。
b 定量試験
a 定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき,ピーク高法又はピーク面積法によりプロヘキサジオンの定量を行い,これに係数1.18を乗じてプロヘキサジオンカルシウム塩に換算する。

7. 定量限界
0.02 mg/kg

8. 留意事項
 プロヘキサジオンカルシウム塩は、プロヘキサジオンについて定量を行い、その含量に係数を乗じてプロヘキサジオンカルシウム塩の含量に換算し、これを分析値とすること。

9. 参考文献
なし

10. 類型
A


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