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フェントラザミド試験法


1. 分析対象化合物
 フェントラザミド、CPT〔1−(2−クロロフェニル)−4,5−ジヒドロ−1H−テトラゾール−5−オン〕

2. 装置
 アルカリ熱イオン化検出器付きガスクロマトグラフ(GC(FTD))又は高感度窒素・リン検出器付きガスクロマトグラフ(GC(NPD))
 ガスクロマトグラフ・質量分析計(GC/MS)

3. 試薬・試液
次に示すもの以外は、総則の3に示すものを用いる。
水素化ナトリウム ヘキサンで洗浄し、同溶媒中に保存したもの
ヨウ化メチル 特級試薬
CPT標準品 本品はCPT97%以上を含み、融点は120℃である。

4. 試験溶液調製法
1)抽出
 試料10.0gを量り採り、水20 mLを加え、2時間放置する。
 これにアセトン100 mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物にアセトン50 mLを加え、ホモジナイズした後、上記と同様にろ過して、得られたろ液を合わせ、40℃以下で約30 mLに濃縮する。これに10%塩化ナトリウム溶液100 mLを加え、酢酸エチル・n−ヘキサン混液(1:1)100 mL及び50 mLで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。
 この残留物にn−ヘキサン30 mLを加え、n−ヘキサン飽和アセトニトリル30 mLずつで3回振とう抽出する。抽出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物に酢酸エチル・n−ヘキサン混液(1:9)5 mLを加えて溶かす。
2)精製(I)
 クロマトグラフ管(内径15mm)に、カラムクロマトグラフィー用シリカゲル(粒径150〜425μm)5 gをn−ヘキサンに懸濁させて充てんし、上に無水硫酸ナトリウム約5gを積層する。このカラムに1)で得られた溶液を注入し、流出液は捨てる。さらに、酢酸エチル・n−ヘキサン混液(1:9) 50 mLを注入し、流出液は捨てる。次いで、酢酸エチル・n−ヘキサン混液(1:4)80 mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。
3)加水分解
 2)で得られた残留物にエタノール4 mLを加えて溶かし、12 mol/L塩酸16 mLを加える。これに還流冷却器を取り付けて、90℃以上の水浴中で1時間加熱した後、放冷する。加水分解した溶液に10%塩化ナトリウム溶液40 mLを加え、酢酸エチル30 mLずつで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。
4)メチル化
 3)で得られた残留物にn−ヘキサン0.5 mLを加えて溶かす。これにジメチルスルホキシド0.5 mL、水素化ナトリウム約20 mg及びヨウ化メチル0.5 mLを加え、栓をして時々振り混ぜながら室温で15分間放置する。次いで、蒸留水10 mLを徐々に滴下して加え、水素ガスの発生が止まった後、反応液に蒸留水10 mLを加え、酢酸エチル20 mLずつで2回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。
5)精製(II)
 4)で得られた残留物に酢酸エチル・n−ヘキサン混液(1:9)5 mLを加えて溶かす。
 シリカゲルミニカラム(690 mg)に酢酸エチル・n−ヘキサン混液(1:9)5 mLを注入し、流出液は捨てる。このカラムに上記の溶液を注入し、流出液は捨てる。さらに、酢酸エチル・n−ヘキサン混液(1:9)10 mLを注入し、流出液は捨てる。次いで、酢酸エチル・n−ヘキサン混液(1:4) 20 mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をアセトンに溶解し、正確に2 mLとしたものを試験溶液とする。

5. 検量線の作成
 CPT標準品の500 mg/Lアセトン溶液を調製し、この1 mLを100 mLのナス型フラスコに取り、室温で窒素ガスを通じて溶媒を除去する。以下、この残留物について4の4)メチル化と同様の操作を行い、その残留物にアセトンを加えて溶かし、50 mLとする。この溶液をアセトンで希釈し、0.025〜1 mg/Lアセトン溶液を数点調製し、それぞれ2 μLをGCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

6. 定量
 試験溶液2μLをGCに注入し、5の検量線でCPTの含量を求め、次式によりフェントラザミドの含量を求める。
   フェントラザミドの含量(mg/kg)= CPTの含量(mg/kg)×1.78

7. 測定条件
GC
 検出器:FTD又はNPD
 カラム:5%フェニル−メチルシリコン 内径0.25 mm、長さ30 m、膜厚0.25 μm
 カラム温度:50℃(1分)−25℃/分−280℃(1分)
 注入口温度:250℃
 検出器温度:280℃
 キャリヤーガス:ヘリウム
 保持時間の目安:10分

8. 定量限界
 0.01 mg/kg

9. 留意事項
1) 分析値
 フェントラザミドは、フェントラザミドをCPTに変換した後、CPTについて定量を行い、その含量に係数を乗じてフェントラザミドの含量に換算し、これを分析値とすること。
2) 試験法の概要
 フェントラザミドを試料からアセトンで抽出し、酢酸エチル・n−ヘキサン混液に転溶する。アセトニトリル/ヘキサン分配で脱脂した後、シリカゲルカラムで精製する。加水分解してフェントラザミドをCPTとした後、ヨウ化メチルでメチル化する。シリカゲルミニカラムで再度精製した後、GC(FTD)又はGC(NPD)で測定し、GC/MSで確認する方法である。

10. 参考文献
 平成12年環境庁告示第80号「フェントラザミド試験法」

11. 類型
C


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