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ピリダベン試験法


1. 分析対象化合物
ピリダベン

2. 装置
アルカリ熱イオン化検出器又は高感度窒素・リン検出器付きガスクロマトグラフ及びガスクロマトグラフ・質量分析計を用いる。

3. 試薬、試液
総則の3に示すものを用いる。

4. 標準品
ピリダベン 本品はピリダベン99%以上を含む。
融点 本品の融点は111〜112°である。

5. 試験溶液の調製
a 抽出法
(1) 豆類及び種実類の場合
検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後,その20.0gを量り採り,水40mlを加え,2時間放置する。
これにアセトン100mlを加え,3分間細砕した後,ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り,アセトン50mlを加え,3分間細砕した後,上記と同様に操作して,ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ,40°以下で約50mlに濃縮する。
これをあらかじめ5%塩化ナトリウム溶液200ml及びn−ヘキサン100mlを入れた500mlの分液漏斗に移す。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後,静置し,n−ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にn−ヘキサン50mlを加え,上記と同様に操作して,n−ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え,時々振り混ぜながら15分間放置した後,すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn−ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い,その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ,40°以下で約1mlに濃縮する。
この液にn−ヘキサン30mlを加え,100mlの分液漏斗に移す。これにn−ヘキサン飽和アセトニトリル30mlを加え,振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後,静置し,アセトニトリル層をすり合わせ減圧濃縮器中に移す。n−ヘキサン層にn−ヘキサン飽和アセトニトリル30mlを加え,上記と同様の操作を2回繰り返す。アセトニトリル層をその減圧濃縮器中に合わせ,40°以下で約1mlに濃縮し,更に室温で窒素を通じて乾固する。この残留物に酢酸エチル及びn−ヘキサンの混液(1:19)20mlを加えて溶かす。
(2) 果実,野菜,抹茶及びホップの場合
果実及び野菜の場合は,検体約1kgを精密に量り,必要に応じ適量の水を量つて加え,細切均一化した後,検体20.0gに相当する量を量り採る。
抹茶及びホップの場合は,検体5.00gを量り採り,水30mlを加え,2時間放置する。
これにアセトン100mlを加え,3分間細砕した後,ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り,アセトン50mlを加え,3分間細砕した後,上記と同様に操作して,ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ,40°以下で約50mlに濃縮する。
これをあらかじめ5%塩化ナトリウム溶液200ml及びn−ヘキサン100mlを入れた500mlの分液漏斗に移す。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後,静置し,n−ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にn−ヘキサン50mlを加え,上記と同様に操作して,n−ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え,時々振り混ぜながら15分間放置した後,すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn−ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い,その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ,40°以下で約1mlに濃縮し,更に室温で窒素を通じて乾固する。この残留物に酢酸エチル及びn−ヘキサンの混液(1:19)20mlを加えて溶かす。
(3) 抹茶以外の茶の場合
検体6.00gを100°の水360mlに浸し,室温で5分間放置した後,ろ過し,冷後ろ液300mlを500mlの分液漏斗に移す。これにアセトン20ml,塩化ナトリウム15g及びn−ヘキサン100mlを加え,振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後,静置し,n−ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にアセトン20ml及びn−ヘキサン50mlを加え,上記と同様に操作して,n−ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え,時々振り混ぜながら15分間放置した後,すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn−ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い,その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ,40°以下で約1mlに濃縮し,更に室温で窒素を通じて乾固する。この残留物に酢酸エチル及びn−ヘキサンの混液(1:19)20mlを加えて溶かす。
b 精製法
(1) 合成ケイ酸マグネシウムカラムクロマトグラフィー
内径15mm,長さ300mmのクロマトグラフ管に,カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム10gをn−ヘキサンに懸濁したもの,次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ,カラムの上端に少量のn−ヘキサンが残る程度までn−ヘキサンを流出させる。このカラムにa 抽出法で得られた溶液10mlを注入した後,酢酸エチル及びn−ヘキサンの混液(1:19)40mlを注入し,流出液は捨てる。次いで酢酸エチル及びn−ヘキサンの混液(3:17)70mlを注入し,流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り,40°以下で約1mlに濃縮し,更に室温で窒素を通じて乾固する。この残留物に酢酸エチル及びn−ヘキサンの混液(1:49)10mlを加えて溶かす。
(2) シリカゲルカラムクロマトグラフィー
内径15mm,長さ300mmのクロマトグラフ管に,カラムクロマトグラフィー用シリカゲル(粒径150〜425μm)10gをn−ヘキサンに懸濁したもの,次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ,カラムの上端に少量のn−ヘキサンが残る程度までn−ヘキサンを流出させる。このカラムに(1) 合成ケイ酸マグネシウムカラムクロマトグラフィーで得られた溶液を注入した後,酢酸エチル及びn−ヘキサンの混液(1:49)50mlを注入し,流出液は捨てる。次いで酢酸エチル及びn−ヘキサンの混液(1:9)70mlを注入し,流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り,40°以下で約1mlに濃縮し,更に室温で窒素を通じて乾固する。この残留物にアセトンを加えて溶かし,正確に2mlとして,これを試験溶液とする。

6. 操作法
a 定性試験
次の操作条件で試験を行う。試験結果がいずれの操作条件においても標準品と一致しなければならない。
操作条件1
カラム充てん剤 カラム担体に対してガスクロマトグラフィー用シリコンを5%含ませる。
クロマトグラフ管 内径2〜3mm,長さ1.0〜1.5mのガラス管を用いる。
カラム温度 210〜240°
試験溶液注入口温度 230〜270°
検出器 250〜280°で操作する。
ガス流量 キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。ピリダベンが約6分で流出する流速に調整する。空気及び水素の流量を至適条件に調整する。
操作条件2
カラム 内径0.53mm,長さ10〜15mのケイ酸ガラス製の細管に,ガスクロマトグラフィー用メチルシリコンを0.5〜15μmの厚さでコーティングしたもの。
カラム温度 210〜240°
試験溶液注入口温度 230〜270°
検出器 250〜280°で操作する。
ガス流量 キャリヤーガスとしてヘリウムを用いる。ピリダベンが約6分で流出する流速に調整する。空気及び水素の流量を至適条件に調整する。
b 定量試験
a 定性試験の操作条件1又は2のうちいずれかの条件で得られた試験結果に基づき,ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。
c 確認試験
b 定量試験と同様の操作条件でガスクロマトグラフィー・質量分析を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。また,必要に応じ,ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

7. 定量限界
0.01 mg/kg(ホップ及び茶にあっては0.04 mg/kg)

8. 留意事項
なし

9. 参考文献
なし

10. 類型
A


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