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クロフェンテジン試験法


1. 分析対象化合物
クロフェンテジン

2. 装置
紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ及び液体クロマトグラフ・質量分析計を用いる。

3. 試薬、試液
総則の3に示すものを用いる。

4. 標準品
クロフェンテジン 本品はクロフェンテジン99%以上を含む。
融点 本品の融点は38.5〜41°である。

5. 試験溶液の調製
a 抽出法
(1) 穀類、豆類、果実、野菜、種実類及びホップの場合
穀類、豆類及び種実類の場合は、検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後、その10.0gを量り採り、水20mlを加え、2時間放置する。
ホップの場合は、粉砕した後、その5.00gを量り採り、水20mlを加え、2時間放置する。
果実及び野菜の場合は、検体約1kgを精密に量り、必要に応じ適量の水を量つて加え、細切均一化した後、検体20.0gに相当する量を量り採る。
これにアセトン100mlを加え、3分間細砕した後、ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り、アセトン50mlを加え、3分間細砕した後、上記と同様に操作して、ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下で約30mlに濃縮する。
これをあらかじめ10%塩化ナトリウム溶液200mlを入れた500mlの分液漏斗に移す。n−ヘキサン100mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い、洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、n−ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にn−ヘキサン50mlを加え、上記と同様に操作して、n−ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn−ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下でn−ヘキサンを除去する。
この残留物にn−ヘキサン30mlを加え、100mlの分液漏斗に移す。これにn−ヘキサン飽和アセトニトリル30mlを加え、振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、アセトニトリル層をすり合わせ減圧濃縮器中に移す。n−ヘキサン層にn−ヘキサン飽和アセトニトリル30mlを加え、上記と同様の操作を2回繰り返し、アセトニトリル層をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下でアセトニトリルを除去する。この残留物にアセトン及びn−ヘキサンの混液(1:19)5mlを加えて溶かす。
(2) 抹茶の場合
検体5.00gを量り採り、水20mlを加え、2時間放置する。
これにアセトン100mlを加え、3分間細砕した後、ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いてすり合わせ減圧濃縮器中に吸引ろ過する。ろ紙上の残留物を採り、アセトン50mlを加え、3分間細砕した後、上記と同様に操作して、ろ液をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下で約30mlに濃縮する。
これをあらかじめ10%塩化ナトリウム溶液200mlを入れた500mlの分液漏斗に移す。n−ヘキサン100mlを用いて上記の減圧濃縮器のナス型フラスコを洗い、洗液を上記の分液漏斗に合わせる。振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、n−ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にn−ヘキサン50mlを加え、上記と同様に操作して、n−ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn−ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下でn−ヘキサンを除去する。この残留物にアセトン及びn−ヘキサンの混液(1:19)を加えて溶かし、正確に25mlとする。
この溶液を孔径0.45μmのメンブランフィルターを用いてろ過し、5mlを採る。
(3) 抹茶以外の茶の場合
検体9.00gを100°の水540mlに浸し、室温で5分間放置した後、ろ過し、冷後ろ液360mlを500mlの分液漏斗に移す。これにアセトン40ml及びn−ヘキサン100mlを加え、振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後、静置し、n−ヘキサン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にn−ヘキサン100mlを加え、上記と同様に操作して、n−ヘキサン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え、時々振り混ぜながら15分間放置した後、すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでn−ヘキサン20mlを用いて三角フラスコを洗い、その洗液でろ紙上の残留物を洗う操作を2回繰り返す。両洗液をその減圧濃縮器中に合わせ、40°以下でn−ヘキサンを除去する。この残留物にアセトン及びn−ヘキサンの混液(1:19)5mlを加えて溶かす。
b 精製法
内径15mm、長さ300mmのクロマトグラフ管に、カラムクロマトグラフィー用シリカゲル(粒径63〜200μm)10gをアセトン及びn−ヘキサンの混液(1:19)に懸濁したもの、次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ、カラムの上端に少量のアセトン及びn−ヘキサンの混液(1:19)が残る程度までアセトン及びn−ヘキサンの混液(1:19)を流出させる。このカラムにa 抽出法で得られた溶液を注入した後、アセトン及びn−ヘキサンの混液(1:19)50mlを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトン及びn−ヘキサンの混液(1:19)60mlを注入し、流出液をすり合わせ減圧濃縮器中に採り、40°以下でアセトン及びn−ヘキサンを除去する。この残留物にアセトニトリルを加えて溶かし、正確に10ml(豆類及び種実類の場合は、5ml)として、これを試験溶液とする。

6. 操作法
a 定性試験
次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。
操作条件
カラム充てん剤 オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)を用いる。
クロマトグラフ管 内径4.6mm、長さ150〜250mmのステンレス管を用いる。
カラム温度 40°
検出器 波長270nmで操作する。
移動相 A:アセトニトリル、B:水、クロフェンテジンが8〜12分で流出する流速に調整する。
濃度勾配 A60%から75%まで15分間の濃度勾配で送液する。
b 定量試験
a 定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき,ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。
c 確認試験
a 定性試験と同様の操作条件で液体クロマトグラフィー・質量分析を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。また、必要に応じ、ピーク高法又はピーク面積法により定量を行う。

7. 定量限界
0.02 mg/kg

8. 留意事項
 抽出溶媒を除去後,残さを再溶解する際に,カラムに負荷する抽出溶液に5%以上のアセトンが入っていないと,クロフェンテジンが溶解せず回収率が悪くなること。測定波長を240nm付近とした場合,トリクラミドのピークと重なる場合があること。

9. 参考文献
なし

10. 類型
A


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