LC/MS による農薬等の一斉試験法I（畜水産物）

１．分析対象化合物
　筋肉、脂肪、肝臓、腎臓及び魚介類の場合は、 別表１ 参照
　乳、卵及びはちみつの場合は、 別表２ 参照

２．装置
　液体クロマトグラフ・質量分析計（LC/MS）又は液体クロマトグラフ・タンデム型質量分析計（LC/MS/MS）

３．試薬、試液
　次に示すもの以外は、総則の３に示すものを用いる。
　各農薬等標準品　各農薬等の純度が明らかなもの。

４．試験溶液調製法
１）抽出
(1) 筋肉、脂肪、肝臓、腎臓及び魚介類の場合
　筋肉、肝臓、腎臓及び魚介類の場合は、試料20.0ｇを量り採る。脂肪の場合は、5.00ｇを量り採る。
　これに水20 mL を加え、ホモジナイズした後、アセトン及びｎ－ヘキサン（１：２）混液100 mL を加え、さらにホモジナイズした後、毎分2,500 回転で５分間遠心分離し、有機層を採る。
　残留物にｎ－ヘキサン50 mL を加え、ホモジナイズした後、毎分2,500 回転で５分間遠心分離する。得られた有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別する。ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去した後、残留物の重量を測定し、これを抽出脂肪重量とする。残留物の全量または一定量を採り、ゲル浸透クロマトグラフィー用カラム（スチレンジビニルベンゼン共重合体カラム）への負荷量が試料5.0ｇ相当量になるように（試料5.0ｇ中の抽出脂肪量が0.5ｇを超える場合には、カラムへの負荷量が抽出脂肪0.50ｇ相当量になるように）アセトン及びシクロヘキサン（１：４）混液に溶かす。

(2) 乳、卵及びはちみつの場合
　乳及び卵の場合は、試料20.0ｇを量り採る。はちみつの場合は、試料20.0ｇを量り採り、水20 mL を加えて溶かす。
　これにアセトニトリル100 mL を加えて、ホモジナイズした後、毎分2,500 回転で５分間遠心分離し、有機層を採る。残留物にアセトニトリル50 mL を加え、ホモジナイズした後、毎分2,500回転で５分間遠心分離する。得られた有機層を合わせ、塩化ナトリウム10ｇを加え、振とうする。静置した後、分離した水層を捨てる。アセトニトリル層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。乳及び卵の場合は、残留物をゲル浸透クロマトグラフィー用カラム（スチレンジビニルベンゼン共重合体カラム）への負荷量が試料5.0ｇ相当量になるようにアセトン及びシクロヘキサン（１：４）混液に溶かす。はちみつの場合は、残留物をアセトン及びｎ－ヘキサン（１：１）混液に溶かし、正確に10 mL とする。

２）精製
(1) 筋肉、脂肪、魚介類、乳及び卵の場合
ａ ゲル浸透クロマトグラフィー
　１）で得られた溶液を毎分3,000 回転で５分間遠心分離し、その上澄液５mL をゲル浸透クロマトグラフィー用カラム（スチレンジビニルベンゼン共重合体カラム）に注入し、アセトン及びシクロヘキサン（１：４）混液で溶出する。アクリナトリンの保持時間からトリシクラゾールの溶出終了までの溶出液を採り、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。残留物にアセトン及びｎ－ヘキサン（１：１）混液２mL を加えて溶かす。

ｂ エチレンジアミン－ N －プロピルシリル化シリカゲルカラムクロマトグラフィー
　エチレンジアミン－ N －プロピルシリル化シリカゲルミニカラム（500 mg）にアセトン及びｎ -ヘキサン（１：１）混液10 mL を注入し、流出液は捨てる。このカラムにａで得られた溶液を注入し、さらに、アセトン及びｎ－ヘキサン（１：１）混液20 mL を注入して、全溶出液を採り、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。残留物をメタノールに溶かし、正確に５mL（脂肪の場合は2.5 mL）としたものを試験溶液とする。

(2) 肝臓及び腎臓の場合
ａ ゲル浸透クロマトグラフィー
　１）で得られた溶液を毎分3,000 回転で５分間遠心分離し、その上澄液５mL をゲル浸透クロマトグラフィー用カラム（スチレンジビニルベンゼン共重合体カラム）に注入し、アセトン及びシクロヘキサン（１：４）混液で溶出する。アクリナトリンの保持時間からアクリナトリンの溶出終了までの画分（画分I）及び画分Iの分取終了からトリシクラゾールの溶出終了までの画分（画分II）を採る。

ｂ エチレンジアミン－ N －プロピルシリル化シリカゲルカラムクロマトグラフィー
　エチレンジアミン－ N －プロピルシリル化シリカゲルミニカラム（500 mg）にアセトン及びシクロヘキサン（１：４）混液10 mL を注入し、流出液は捨てる。このカラムに画分Iを注入し、さらに、アセトン及びシクロヘキサン（１：４）混液５mL を注入して、全溶出液を採り、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。残留物にｎ－ヘキサン１mL を加えて溶かす。

ｃ シリカゲルカラムクロマトグラフィー
　シリカゲルミニカラム（690 mg）にｎ－ヘキサン10 mL を注入し、流出液は捨てる。このカラムにｂで得られた溶液を注入し、さらに、ｎ－ヘキサン10 mL を注入し、流出液は捨てる。
　次いで、カラムにエーテル及びｎ－ヘキサン（１：19）混液15 mL を注入し、溶出液をａで得られた画分IIに合わせ、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。残留物をメタノールに溶かし、正確に５mL としたものを試験溶液とする。

(3) はちみつの場合
　エチレンジアミン－ N －プロピルシリル化シリカゲルミニカラム（500 mg）にアセトン及びｎ－ヘキサン（１：１）混液10 mL を注入し、流出液は捨てる。このカラムに１）で得られたアセトン及びｎ－ヘキサン（１：１）混液溶液2.5 mL を注入し、さらに、アセトン及びｎ－ヘキサン（１：１）混液20 mL を注入して、全溶出液を採り、40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。残留物をメタノールに溶解し、正確に５mL としたものを試験溶液とする。

５．検量線の作成
　各農薬等の標準品について、それぞれのアセトニトリル溶液を調製し、それらを混合した後、適切な濃度範囲の各農薬等を含むメタノール溶液を数点調製する。それぞれ５μL をLC/MS又はLC/MS/MS に注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

６．定量　試験溶液５μL をLC/MS 又はLC/MS/MS に注入し、５の検量線で各農薬等の含量を求める。

７．確認試験　LC/MS 又はLC/MS/MSにより確認する。

８．測定条件
LC/MS(/MS)

　カラム温度：40℃
　移動相：A 液及びB 液について下の表の濃度勾配で送液する。
　移動相流量：0.20 mL/分

　イオン化モード：ESI
　主なイオン（ m/z ）： 別表１ 及び 別表２ 参照
　保持時間の目安： 別表１ 及び 別表２ 参照

９．定量限界
別表１ 及び 別表２ 参照
　ただし、 別表１ 及び 別表２ は測定限界（ng）の例を示したものである。

10．留意事項
１）試験法の概要
　各農薬等を試料からアセトン及びｎ－ヘキサン（１：２）混液で抽出（乳、卵及びはちみつの場合はアセトニトリルで抽出）し、ゲル浸透クロマトグラフィー及びエチレンジアミン－ N －プロピルシリル化シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（肝臓及び腎臓の場合はシリカゲルカラムクロマトグラフィーを追加し、はちみつの場合はゲル浸透クロマトグラフィーを省略する）、LC/MS又はLC/MS/MS で測定及び確認する方法である。

２）注意点

11．参考文献
　　なし

12．類型
　　C