文献番号：197
タイトル：Control of Listeria monocytogenes by bacteriocins and monitoring ofbacteriocin-producing lactic acid bacteria by colony hybridization insemi-hard raw milk cheese.
邦訳タイトル：未殺菌乳から造ったセミ-ハードチーズ中における、バクテリオシンによる L.monocytogenesのコントロール、およびコロニ-ハイブリダイゼーションによるバクテリオシン産生乳酸菌のモニタリング
著者：Rodriguez E, Arques J L, Gaya P, Nunez M, Medina M
誌名､発行年、巻号頁：The Journal of Dairy Research (2001), 68, (1), 131-137

※このＣＤ-ＲＯＭでは、べき乗を右記の例のように表します。（例）10の9乗 → 10E9

<ITEM1> \n調査の目的\n　
　
未殺菌乳から造ったセミーハードチーズにおける、3種のバクテリオシン産生乳酸菌の抗リステリア活性を評価する。
　
<ITEM2> \n検体名\n　
　
L.monocytogenesを接種した乳に、3種のバクテリオシン産生乳酸菌スターターを添加した乳から作ったセミ-ハードチーズ
　
<ITEM3> \nサンプルサイズ\n及び採集方法\n　
　
-
 
　
<ITEM4> \n検査項目\n　
　
リステリア菌数、pH、バクテリオシン活性
　
<ITEM5> \n検査法\n(増殖の有無､培地､培地の温度)\n　
　
使用菌株の培養条件
ナイシン産生株L.lactis subsp. Lactis TAB 50、ラクチシン481産生株L.lactis subsp. Cremoris TAB 24およびエンテロシンAS-48産生株E.faecalis TAB 28　は、MRSブロスで30℃18時間増殖後、チーズ製造に使用前に滅菌還元脱脂乳で30℃16時間継代培養。市販中温性乳酸菌スターターLDタイプCH-N 01は、チーズ製造に使用前滅菌還元脱脂乳で2度、30℃16時間継代培養。 L.monocytogenes Ohio 45226は、all purpose Tween ブロスで2度、37℃16時間増殖。バクテリオシン活性測定の指標菌としてのL.buchneri St2Aは、2度MRSブロスで30℃18時間増殖。
 
チーズの製造
未殺菌牛乳に32℃で L.monocytogenesを〜E+5cfu/mlに接種し、5つの10Lバットに分配した。バット1にはL.lactis subsp. Lactis TAB 50、バット2にはL.lactis subsp. Cremoris TAB 24、バット3にはE.faecalis TAB 28、バット4には市販スターターCH-N 01を各々10ｍｌ/Lの割で加える。バット5には乳酸菌スターターを加えず。スターター接種15分後にレンネット(0.133ml/L)とCaCl2(0.1g/L)を加えた。レンネット添加後40分にカッティングし、37℃15分間攪拌後モールドに充填。20℃20時間プレスし、ブライン(140g NaCl/L)中で加塩後12℃で60日間熟成。
 
菌の分析
チーズサンプルはホモゲナイズし10倍希釈系列を調製。リステリア菌数はPalcamリステリア選択寒天平板で37℃48時間培養して計数。E.faecalis TAB 28を添加して造ったチーズでは、チーズサンプル(10g)を90mlのリステリア増菌ブロスでホモゲナイズし30℃24時間増菌。培養後増菌ブロスはPalcam寒天に蒔き,37℃48時間培養。
 
バクテリオシンの検出
チーズサンプル(5g)を200mlの滅菌0.02M-HClと70℃でホモゲナイズ後,遠心分離(20,000×g、 4℃、15分)し、上清をエッペンドルドルフチュ−ブ中で-40℃で凍結。解凍後上清20μlを、カタラーゼ(150i.u./ml)と指標菌L.buchneri St2Aの16時間培養物20μｌを含むall porpose Tween寒天20ｍｌの混釈平板に作られたウェルに3連で入れる。37℃20時間培養後、増殖阻害ゾーンの直径を測り、バクテリオシン活性をmmであらわした。
 
バクテリオシン産生コロニーの計数
60日熟成後のチーズ菌叢中に、接種されたバクテリオシン産生乳酸菌が存在するか否かを確認するために、コロニーハイブリダイゼーション法を用いた。
　
<ITEM6> \n結果\n(汚染実態、汚染菌の性状、防除対策等)\n　
　
・接種乳中の L.monocytogenesの菌数はlog cfu/mlで表すと4.64であった。8時間後には市販スターター、ナイシン産生、ラクチシン産生スターターで造ったチーズ中の方が、乳酸菌スターターなしのチーズより、各々、0.76、1.51、1.60　log単位ずつ低かった。エンテロシンAS-48を産生するE.faecalis TAB 28で造ったチーズでは、増菌処理後も L.monocytogenesは検出されなかった。
 
・60日後、市販スターター、ナイシン産生、ラクチシン481産生スターターを加えたチーズ中の L.monocytogenes菌数は、乳酸菌スターターなしのチーズより、各々、0.23、2.64、2.79 log単位ずつ低かった。
 
・8時間後チーズのpHは、ナイシン産生スターターや市販スターターを加えた方が有意(P<0.01)に低かったが、7日と15日の熟成後には有意な違いは認められなかった。また、E.faecalis TAB 28を添加して造ったチーズは、30日と60日にpHが高かった。
 
・コロニーハイブリダイゼーションテストの結果、ナイシン、ラクチシン481、エンテロシンAS-48をエンコードした乳酸菌は、各々60日後のチーズ中の全生菌数の54.4%、3.5%、72.2%を占めていた。
　
・バクテリオシン活性は、バクテリオシン産生カルチャーを用いたチーズで検出されたが、スターター無添加や市販スターターを加えて造ったチーズでは検出されなかった。このバクテリオシンの存在は、その産生菌が乳のネイティブな菌叢と競合して増殖できることを示す。
 
・エンテロシンAS-48産生E.faecalis TAB48は強い抗リステリア活性を示したが、出来たチーズは通常のものより高いpHを有し、強い蛋白分解性のために柔らかい組織を有していた。但し、この欠点は接種量を低めるなどすれば改良できる。一方、ナイシン産生株L.lactis subsp. Lactis TAB 50、ラクチシン481産生株L.lactis subsp. Cremoris TAB 24で造ったチーズは、受容可能な官能品質を有していた。
　
<ITEM7> \nPubMed\n
　
The Journal of Dairy Research, 68, 131
 
<PUBMED>

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=search&term=The+Journal+of+Dairy+Research,+68,+131

