2.1.4. トウモロコシ（DAS59132）の検査
トウモロコシ穀粒について、DNA抽出精製はシリカゲル膜タイプキット法（QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit: トウモロコシに適用）（2.2.1.2.）に従って、一試料につき２回並行で抽出を行い、得られたDNA溶液を用いて以下のリアルタイムPCRを用いた定性PCR法を実施する。
2.1.4.1. リアルタイムPCRを用いた定性PCR法
トウモロコシ陽性対照用プライマー対及びプローブは、トウモロコシ（3.2.）定量PCR法（3.2.1.）と同様に、トウモロコシに普遍的に存在する内在性遺伝子として、スターチシンターゼIIb（SSIIb）遺伝子を用い、同遺伝子を標的とするプライマー対SSIIb-3とプローブSSIIb-Taqを用いる。
2.1.4.1.1. リアルタイムPCRを用いた定性PCR法（ABI PRISMTM 7900）
2.1.4.1.1.1. PCR用反応液の調製
PCR用反応液は25 μL/wellとして調製する。その組成は以下のとおりである。Universal PCR Master Mix＊1 12.5 μL、対象プライマー対溶液（各プライマー、10 μmol/L）1.0 μL＊2、対象プローブ溶液（10 μmol/L）0.5 μL＊3を混合し、水で全量20 μLに調製後、10 ng/μL DNA試料液5.0 μL（50 ng）を添加する。PCRのブランク反応液として、必ずDNA試料液を加えないものについても同時に調製する。分注操作終了後、真上からシール＊4し、完全にウェルを密閉する。このとき、しわが寄らないよう注意し、専用のシーリング用アプリケーターを用いて行う。最後にウェルの底を観察し、底に気泡がある場合は、プレートの縁を軽く叩いて気泡を抜いておく。プレートの確認後、ABI PRISM Optical Cover Compression Pad＊5を茶色の面が上になるよう、プレートの上面にセットする。試験は、1DNA試料液当たり2ウェル並行で行うものとし、PCR用反応試薬は2ウェル分を同時に調製する。
＊1 Universal PCR Master Mix
本試薬は粘性が高いため、混合操作を行う際には、混合が確実に行われるように注意する。不十分な場合には、PCRがうまくいかない場合がある。使う直前には必ずボルテックスミキサーを用いて3秒程度混合した後、軽く遠心し、溶液を試料管の底に集めておいてから使用する。また、ウェルに分注する際は、以後撹拌、遠心が困難なことを考慮し、ウェルの底に確実に入れる。
＊2 対象プライマー対
DAS59132検出用プライマー対は以下のとおりである。（各プライマーは水で溶解する。）
F-primer（32f）：5’-CCG CAA TGT GTT ATT AAG TTG TCT AAG-3’
R-primer（32r）：5’-GGT GAA TGT CGC CGT GTG T-3’
なお、トウモロコシ陽性対照用試験では、プライマー対SSIIb-3（各プライマー濃度、25 μmol/L）を用いる場合には0.5 μLを加えること。
＊3 対象プローブ
DAS59132検出用プローブは以下のとおりである。（プローブは水で溶解する。）
5’-FAM-CAA TTT GTT TAC ACC AGA GGC CGA CAC G-TAMRA-3’
＊4 96ウェルプレート、シール及びシーリングアプリケーター
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate（Applied Biosystems社）及びABI PRISM Optical Adhesive Cover（Applied Biosystems社）を使用する。シーリングの詳細については、製品付属のマニュアルを参考のこと。
＊5 ABI PRISM Optical Cover Compression Pad
ABI PRISM Optical Cover Compression Pad（Applied Biosystems社）を使用する。なお、20回以上の繰り返し使用は、定量結果に影響を及ぼす可能性があるため、避けること。
2.1.4.1.1.2. プレート情報の設定
反応に際しては、プレート情報の設定を行わなければならない。設定を行う項目は、検体の配置と種類及び、プローブ特性である。具体的には新規シート上で、調製したプレートの配置に対応するように気を付けながら、検体の種類（「UNKN」：DNA試料液）の設定を行う。また、プローブ特性に関しては、トウモロコシ陽性対照用、DAS59132検出用ともに、Reporterが「FAM」、Quencherが「TAMRA」となるように設定する。なお、トウモロコシ陽性対照用、DAS59132検出用ともに、Passive Referenceを「ROX」と設定する。
2.1.4.1.1.3. PCR増幅
装置にプレートをセットし、反応とデータの取込みを開始する。反応条件は以下のとおりである。50℃、2分間の条件で保持した後、95℃で10分間加温し、ホットスタート法で反応を開始する。その後、95℃ 15秒、60℃ 1分を1サイクルとして、40サイクルの増幅反応を行う。なお、反応条件の設定において9600 emulationモードのチェックを入れておく。Remaining timeが0分となっていることを確認し、反応を終了させた後、測定結果の解析を行う。
2.1.4.1.2. リアルタイムPCRを用いた定性PCR法（ABI PRISMTM 7500）
2.1.4.1.2.1. PCR用反応液の調製
PCR用反応液は25 μL/wellとして調製する。その組成は以下のとおりである。Universal PCR Master Mix＊1 12.5 μL、対象プライマー対溶液（各プライマー、10 μmol/L）1.0 μL＊2、対象プローブ溶液（10 μmol/L）0.5 μL＊3を混合し、水で全量20 μLに調製後、10 ng/μL DNA試料液5.0 μL（50 ng）を添加する。PCRのブランク反応液として、必ずDNA試料液を加えないものについても同時に調製する。分注操作終了後、真上からシール＊4し、完全にウェルを密閉する。このとき、しわが寄らないよう注意し、専用のシーリング用アプリケーターを用いて行う。最後にウェルの底を観察し、底に気泡がある場合は、プレートの縁を軽く叩いて気泡を抜いておく。試験は、1DNA試料液当たり2ウェル並行で行うものとし、PCR用反応試薬は2 ウェル分を同時に調製する。
＊1 Universal PCR Master Mix
本試薬は粘性が高いため、混合操作を行う際には、混合が確実に行われるように注意する。不十分な場合には、PCRがうまくいかない場合がある。使う直前には必ずボルテックスミキサーを用いて3秒程度混合した後、軽く遠心し、溶液を試料管の底に集めておいてから使用する。また、ウェルに分注する際は、以後撹拌、遠心が困難なことを考慮し、ウェルの底に確実に入れる。
＊2 対象プライマー対
DAS59132検出用プライマー対は以下のとおりである。（各プライマーは水で溶解する。）
F-primer（32f）：5’-CCG CAA TGT GTT ATT AAG TTG TCT AAG-3’
R-primer（32r）：5’-GGT GAA TGT CGC CGT GTG T-3’
なお、トウモロコシ陽性対照用試験では、プライマー対SSIIb-3（各プライマー濃度、25 μmol/L）を用いる場合には0.5 μLを加えること。
＊3 対象プローブ
DAS59132検出用プローブは以下のとおりである。（プローブは水で溶解する。）
5’-FAM-CAA TTT GTT TAC ACC AGA GGC CGA CAC G-TAMRA-3’
＊4 96ウェルプレート、シール及びシーリングアプリケーター
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate（Applied Biosystems社）及びABI PRISM Optical Adhesive Cover（Applied Biosystems社）を使用する。シーリングの詳細については、製品付属のマニュアルを参考のこと。
2.1.4.1.2.2. プレート情報の設定
反応に際しては、プレート情報の設定を行わなければならない。設定を行う項目は、検体の配置と種類及び、プローブ特性である。具体的には新規シート上で、調製したプレートの配置に対応するように気を付けながら、検体の種類（「UNKN」：DNA試料液）の設定を行う。また、プローブ特性に関しては、トウモロコシ陽性対照用、DAS59132検出用ともに、Reporterが「FAM」、Quencherが「TAMRA」となるように設定する。なお、トウモロコシ陽性対照用、DAS59132検出用ともに、Passive Referenceを「ROX」と設定する。
2.1.4.1.2.3. PCR増幅
装置にプレートをセットし、反応とデータの取込みを開始する。反応条件は以下のとおりである。50℃、2分間の条件で保持した後、95℃で10分間加温し、ホットスタート法で反応を開始する。その後、95℃ 15秒、60℃ 1分を1サイクルとして、40サイクルの増幅反応を行う。なおランモードの設定は9600 emulationモードを選択する。Remaining timeが0分となっていることを確認し、反応を終了させた後、測定結果の解析を行う。
2.1.4.1.3. リアルタイムPCRを用いた定性PCR法（ABI PRISMTM 7700）
2.1.4.1.3.1. PCR用反応液の調製
PCR用反応液は25 μL/wellとして調製する。その組成は以下のとおりである。Universal PCR Master Mix＊1 12.5 μL、対象プライマー対溶液（各プライマー、10 μmol/L）1.0 μL＊2、対象プローブ溶液（10 μmol/L）0.5 μL＊3を混合し、水で全量20 μLに調製後、10 ng/μL DNA試料液5.0 μL（50 ng）を添加する。PCRのブランク反応液として、必ずDNA試料液を加えないものについても同時に調製する。分注操作終了後、真上からキャップし＊4、完全にウェルを密閉する。このとき、専用のシーリング用アプリケーターを用いて行う。最後にウェルの底を観察し、底に気泡がある場合は、プレートの縁を軽く叩いて気泡を抜いておく。試験は、1DNA試料液当たり2ウェル並行で行うものとし、PCR用反応試薬は2ウェル分を同時に調製する。
＊1 Universal PCR Master Mix
本試薬は粘性が高いため、混合操作を行う際には、混合が確実に行われるように注意する。不十分な場合には、PCRがうまくいかない場合がある。使う直前には必ずボルテックスミキサーを用いて3秒程度混合した後、軽く遠心し、溶液を試料管の底に集めておいてから使用する。また、ウェルに分注する際は、以後撹拌、遠心が困難なことを考慮し、ウェルの底に確実に入れる。
＊2 対象プライマー対
DAS59132検出用プライマー対は以下のとおりである。（各プライマーは水で溶解する。）
F-primer（32f）：5’-CCG CAA TGT GTT ATT AAG TTG TCT AAG-3’
R-primer（32r）：5’-GGT GAA TGT CGC CGT GTG T-3’
なお、トウモロコシ陽性対照用試験では、プライマー対SSIIb-3（各プライマー濃度、25 μmol/L）を用いる場合には0.5 μLを加えること。
＊3 対象プローブ
DAS59132検出用プローブは以下のとおりである。（プローブは水で溶解する。）
5’-FAM-CAA TTT GTT TAC ACC AGA GGC CGA CAC G-TAMRA-3’
＊3 96ウェルプレートおよびプレートの蓋
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate（Applied Biosystems社）及びMicroAmp Optical Caps、8caps/strips（Flat）（Applied Biosystems社）を使用する。
2.1.4.1.3.2. プレート情報の設定
反応に際しては、プレート情報の設定を行わなければならない。設定を行う項目は、検体の配置と種類及び、プローブ特性である。具体的には新規シート上で、調製したプレートの配置に対応するように気を付けながら、検体の種類（「UNKN」：DNA試料液）の設定を行う。また、プローブ特性に関しては、トウモロコシ陽性対照用、DAS59132検出用ともに、Reporterが「FAM」、Quencherが「TAMRA」となるように設定する。なお、トウモロコシ陽性対照用、DAS59132検出用ともに、Passive Referenceを「ROX」と設定する。
2.1.4.1.3.3. PCR増幅
装置にプレートをセットし、反応とデータの取込みを開始する。反応条件は以下のとおりである。50℃、2分間の条件で保持した後、95℃で10分間加温し、ホットスタート法で反応を開始する。その後、95℃ 15秒、60℃ 1分を1サイクルとして、40サイクルの増幅反応を行う。Remaining timeが0分となっていることを確認し、反応を終了させた後、測定結果の解析を行う。
2.1.4.1.4 結果の解析と判定
トウモロコシ陽性対照用試験及びDAS59132検出用試験のいずれについても、結果の判定は、Amplification plot上で指数関数的な増幅曲線とCt値の確認及びmulticomponent上での対象色素由来の蛍光強度（FAM）の指数関数的な明確な増加の確認をもって行う。第一に目視でAmplification plot上に指数関数的な増幅曲線が確認された場合に陽性を疑う。次いでベースライン（3サイクルから15サイクル）のΔRnのノイズ幅の最大値の上側で、安定した指数関数的な増幅曲線上で交わるTh. Lineを選択する＊。そのTh. LineからCt値が得られるか否かを解析する。その後トウモロコシ陽性対照用試験及びDAS59132検出用試験の両方において、38未満のCt値が得られた場合に陽性と判定し、38未満のCt値が得られない場合は陰性と判定する。なお、上記判定により陽性が判定された結果についてmulticomponentを解析し、目視でFAMの蛍光強度の指数関数的な増加が観察でき、ROXの蛍光強度の明確な下降やFAMの蛍光強度の緩やかな上昇がないことを確認する。
また、どちらか一方の抽出液において、トウモロコシ陽性対照用試験で38未満のCt値が得られない場合には、リアルタイムPCRを用いた定性PCR法以降の操作を行い、それでも38未満のCt値が得られない場合には、その抽出液での結果を無効とし、もう一方の抽出液の結果だけで判定する。２つのDNA抽出液ともにトウモロコシ陽性対照用試験で38未満のCt値が得られない場合には、改めて3回目のDNA抽出精製を行い、さらにリアルタイムPCRを用いた定性PCR法以降の操作を実施して、判定を行う。3回目のDNA抽出液を用いた場合でもトウモロコシ陽性対照用試験で38未満のCt値が得られない場合には、本試料からの安全性未審査の組換えDNA技術応用食品の検知は不能とする。
