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（別添） 組換えDNA技術応用食品の検査方法

1.検体採取方法
1.1. 組換えDNA技術応用食品の検体採取
1.1.1. トウモロコシ及び大豆の穀粒の検体採取
　組換えDNA技術応用食品が不均一に分布しているということを前提として、ロットを代表するような検体採取を行うため、対象となるロットの大きさ、荷姿、包装形態に応じて、以下に掲げる検体採取を行う。検体採取に際しては、他ロットの穀粒が混入しないよう十分配慮し、使用する器具・容器包装等は使い捨てのものを使用するか、その都度、十分に洗浄等を行い使用すること。
　次に、検体採取した穀粒が均質になるよう十分に混合した後、この中から検査に必要な一定量^＊を採り、粉砕器等を用いて均質に粉砕する。
^＊安全性未審査の組換えDNA技術応用食品のうち、該当するトウモロコシ系統の検査を目的とした定性PCR用試料又は安全性審査済みの組換えDNA技術応用食品を対象とした定量検査用試料として用いるには、５００g必要である。

1.1.1.1. 袋積みの場合
　以下の表に従って検体採取を行う。

ロットの大きさ			検体採取の ための開梱数	検体採取量（kg）	検体数
	≦	15	2	1	1
16	〜	25	3	1	1
26	〜	90	5	1	1
91	〜	150	8	1	1
151	〜	280	13	1	1
281	〜	500	20	1	1
501	〜	1,200	32	1	1
1,201	〜	3,200	50	1	1
3,201	〜	10,000	80	1	1
10,001	〜	35,000	125	1	1
35,001	〜	150,000	200	1	1
150,001	〜	500,000	315	1	1
	≧	500,001	500	1	1

1.1.1.2. ばら積みの場合
1.1.1.2.1. サイロ搬入時
　サイロに搬入する際に１サイロを１ロットとして、ロット全体を代表する検体となるようオートサンプラー等を用いて検体採取を行うものとし、適正な時間的間隔をもって１５回、計１０kg以上を検体採取したものを縮分してサイロ毎に１検体（１kg以上）とする。
　既にサイロに搬入したものについては、他のサイロに移動させる時点で同様に検体採取を行う。

1.1.1.2.2. はしけ搬入時
　はしけ（内航船を含む。）に搬入する際に１はしけを１ロットとして、ロット全体を代表する検体となるようオートサンプラー等を用いて検体採取を行うものとし、適正な時間的間隔をもって１５回計１０kg以上を検体採取したものを縮分してはしけ毎に１検体（１kg以上）とする。

1.1.1.2.3. はしけにおける検体採取
　すでにはしけに搬入したものについて検体採取を行う場合、１はしけを１ロットとして、ロット全体を代表する検体となるよう上層、中層、下層毎に各５カ所、計１５カ所から、計１０kg以上を検体採取したものを縮分してはしけ毎に１検体（１kg以上）とする。

1.1.2. パパイヤの検体採取
　パパイヤの検体採取については、対象となるロットの大きさに応じて以下の表に従い検体採取を行うこと。

ロットの大きさ			検体採取の ための開梱数	検体採取量(個)
	≦	50	2	2
51	〜	500	3	3
501	〜	35,000	5	5
	≧	35,001	8	8

1.2. 加工食品の検体採取
　加工食品の検体採取については、対象となるロットの大きさに応じて以下の表に従い検体採取を行うこと。

1.2.1. トウモロコシ及び大豆の粉砕加工品（コーングリッツ、コーンフラワー、コーンミール等、穀粒を粉砕したもの）
　検体採取については、1.1.1.1.の袋積みの場合に従う。なお、安全性未審査の組換えDNA技術応用食品のうち、該当するトウモロコシ系統の検査を目的とした定性PCR用試料には、採取した検体のうち、５００gを均質に粉砕した試料を用いる。

1.2.2. それ以外の加工食品
　以下の表に従って検体採取を行う。

ロットの大きさ			検体採取の ための開梱数	検体採取量（g）	検体数
	≦	15	2	120	1
16	〜	50	3	120	1
51	〜	150	5	120	1
151	〜	500	8	120	1
501	〜	3,200	13	120	1
3,201	〜	35,000	20	120	1
35,001	〜	500,000	32	120	1
	≧	500,001	50	120	1

2．安全性未審査の組換えDNA技術応用食品の検査方法
2.1. 検査方法
2.1.1. トウモロコシ（CBH351）の検査
　トウモロコシの穀粒については、ラテラルフロー法で行う。また、コーングリッツ、コーンフラワー、コーンミール等、遺伝子組換えにより新たに発現されるタンパク質が物理化学的な変化を受けていない粉砕加工品（以下、「トウモロコシ半製品」という。）についても、ラテラルフロー法で行う。
　その他のトウモロコシ加工品については定性PCR法で行う。
　なお、トウモロコシ半製品については、ラテラルフロー法で行った後、定性PCR法による確認試験を行う。

2.1.1.1. トウモロコシ穀粒からのCBH351トウモロコシの検知
2.1.1.1.1. ラテラルフロー法
　市販のTest Kitは、Strategic Diagnostics社（SDI）製Trait・Bt9 Corn Grain 5-Minute Test Kit (Part# 7000012) を用いる方法である。以下に記述する方法は、キットの説明書に記載の方法と基本的に同一である。なお、実験室で実験を行う場合には、水は、特に断り書きがない限りすべて逆浸透膜精製したRO水又は蒸留水を用いることを推奨する。

2.1.1.1.1.1. 実験操作
　採取したトウモロコシ穀粒から無作為に８００粒を採取し粉砕した後、粉砕物^＊を５００mL容程度の口の広い蓋付きの容器に採り、水２８８mLを加えた後、１０−２０秒間、試料が全て濡れるまでよく振とうする。もしこの段階で上澄み液が生じなければ、少量の水を加え、試料をよく振とうし、振とう後上澄み液が生じたかどうか観察する。振とう後、数mL程度の上澄み液が生じるまで水を加える。次に、試料の上澄み液０.５mLをキット付属の１.５mL容試料管に移し、その試料管にTrait・Bt9テストストリップを垂直に立てる。
^＊通常２３０gを量り採り粉砕したもの（２３０gで８００粒に満たないときは８００粒の粉砕物）。

2.1.1.1.1.2. 結果の判定
　テストストリップを試料管に立て、５分経過した時点^＊で、テストストリップの表示部を観察する。赤色のラインがテストストリップ表示部に２本現れれば陽性、コントロールラインだけが現れれば陰性と判定する。また、１本も現れなければ、その試験は無効と判定する。
^＊５分間以上経過すると赤色のラインが濃くなる場合があり、正しく判定することができないので注意が必要。

2.1.1.2. トウモロコシ加工品からのCBH351トウモロコシの検知
　加工食品からのDNAの抽出精製法（2.2.3.）に従って、一試料につき２回並行で抽出を行い、得られたDNA溶液を用い、以下の条件で定性PCRを行う。

2.1.1.2.1. 定性PCR法
　定性PCR法は、抽出されたDNAの一部をプライマー対を用いてPCR増幅し、電気泳動により分離した後に、その増幅産物を検知する方法である。
^*PCR法では、鋳型DNAが微量存在しても増幅産物が検知されうる。したがって、目的外のDNA（特にPCR増幅産物）の混入に特に注意を払う必要がある。また、DNAは、人間の皮膚表面から分泌されているDNA分解酵素により分解されるので、本酵素の混入を防止しなければならない。これらの点を考慮し、使い捨てのチュ−ブ、チップ等を使用し、DNA、DNase等がコンタミネーションしないよう注意して用いること。また、定性PCRの際に用いる水は、特に断り書きがない限りすべて逆浸透膜精製したRO水又は蒸留水をMilli-Q等で１７MΩ/cmまで精製した超純水など、DNA、DNase等がコンタミネーションしていないものを用いること。
^*また、独立行政法人農林水産消費技術センター作成のJAS分析試験ハンドブック「遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル コンタミネーション防止編」も参考にし、コンタミネーション防止に細心の注意を払うこと。

2.1.1.2.1.1. PCR増幅
　PCR用反応試料管に反応液を以下のように調製する。反応液は、PCR緩衝液^*1、０.２０mmol/L dNTP、３mmol/L 塩化マグネシウム、０.２μmol/L ５’及び３’プライマー^*2並びに０.６２５units Taq DNAポリメラーゼ^*3を含む液に、１０ng/μLに調製したDNA試料液２.５μL（DNAとして２５ng）を氷中で加え、全量を２５μLにする。次に、その反応試料管をPCR増幅装置^*4にセットする。反応条件は次の通りである。９５℃に１０分間保ち反応を開始させた後、９５℃ ０.５分間、６０℃ ０.５分間、７２℃ ０.５分間を１サイクルとして、４０サイクルのPCR増幅を行う。次に終了反応として７２℃ で７分間保った後、４℃で保存し、得られた反応液をPCR増幅反応液とする。PCRのブランク反応液として、必ずプライマー対を加えないもの及びDNA試料液を加えないものについても同時に調製する。また、試料からDNAが抽出されていることの確認として、DNA試料液ごとに、CBH351検出用プライマー対の代わりに陽性対照用プライマー対^*5を用い、同様にPCR増幅を行う。
^*1PCR緩衝液
　PCR buffer II（アプライドバイオシステムズ社製、塩化マグネシウムを含まないもの）又は同等の結果が得られるものを用いる。
^*2CBH351検出用プライマ−対は以下の通りである。
　F-primer（CaM０３-５’）：５’-CCT TCG CAA GAC CCT TCC TCT ATA-３’
　R-primer（CBH０２-３’）：５’-GTA GCT GTC GGT GTA GTC CTC GT-３’
^*3Taq DNAポリメラーゼ
　AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ（アプライドバイオシステムズ社製）又は同等の結果が得られるものを用いる。
^*4PCR増幅装置
　GeneAmp PCR System 9700（アプライドバイオシステムズ社製）又は同等の結果が得られるものを用いる。
^*5陽性対照用のプライマー対は以下の通りである。
　F-primer（Zein n-５’）：５’-CCT ATA GCT TCC CTT CTT CC-３’
　R-primer（Zein n-３’）：５’-TGC TGT AAT AGG GCT GAT GA-３’

2.1.1.2.1.2. アガロ−スゲル電気泳動
　PCR増幅反応液をアガロ−スゲル電気泳動により分離し、PCR増幅バンドを確認する。

2.1.1.2.1.2.1. アガロースゲルの作成
　必要量のアガロ−スを秤量し、TAE緩衝液^*1を加え、加熱してアガロ−スを溶解する。次に１００mL当たり５μLのエチジウムブロミド溶液^*2（１０mg/mL）を加え、ゲルを５０℃前後まで冷やした後ゲルメ−カ−に流し込み、室温で十分に冷やし固めてゲルを作製する^*3。ゲルはすぐに使用するのが望ましいが、緩衝液に浸して数日間保存することもできる。ゲルの濃度は泳動するDNAの長さに応じて決める必要があるので、目的とするPCR増幅産物のバンド長にあわせてゲル濃度（１.０〜４.０％）を決める。
^*1TAE緩衝液
　各最終濃度が４０mmol/L Tris-酢酸、１mmol/L EDTAとなるように蒸留水を用いて調製したものをTAE緩衝液とする。
^*2エチジウムブロミド
　２本鎖DNAの鎖の間に入り込む蛍光試薬であり、強力な発ガン作用と毒性がある。取扱いには必ず手袋をはめ、マスクを着用すること。
^*3前染色
　ここでは、前染色法を述べる。この段階でエチジウムブロミド溶液を加えず、電気泳動終了後、2.1.1.2.1.2.3.に従って、ゲルを後染色しても良い。

2.1.1.2.1.2.2. 電気泳動
　TAE緩衝液を満たした電気泳動漕にゲルをセットする。PCR増幅反応液７.５μLと適当量のゲルローディング緩衝液を混ぜ合わせた後、ゲルのウェルに注入する。ゲルへの試料注入に時間がかかりすぎると、DNAが拡散し鮮明な結果が得られにくくなるので注意する。次に、１００V定電圧で電気泳動を行い、ゲルローディング緩衝液に含まれるBPBがゲルの１/２から２/３まで進んだところで電気泳動を終了する。

2.1.1.2.1.2.3. ゲルの染色（後染色）
　前染色を行った場合は本項の操作は必要ない。
　ゲルが浸る量のTAE緩衝液が入った容器に、泳動後のゲルを移し入れる。次に緩衝液１００mL当たり、５μLのエチジウムブロミド溶液（１０mg/mL）を加え、容器を振とう器に乗せて軽く振とうしながら３０分程度染色する。その後、TAE緩衝液のみの入った容器に染色済みのゲルを移し、３０分程度軽く浸透しながら脱染色を行う。

2.1.1.2.1.3. ゲルイメージ解析
　ゲルイメージ解析装置内のステ−ジに食品包装用ラップ^＊を置き、その上に電気泳動と染色が終了したゲルをのせて紫外線（３１２nm）を照射する。ゲルイメージ解析装置の画面で電気泳動パタ−ンを確認する。DNA分子量標準と比較して目的のPCR増幅バンドの有無を判定する。ブランク反応液で対応するPCR増幅バンドが検知された場合は、DNA抽出操作以降の結果を無効として、改めて実験をやり直す。泳動結果は画像デ−タとして保存しておく。
^＊ポリ塩化ビニリデン製のフィルムでないと紫外線は吸収されてしまい、像が得られない場合があるので注意を要する。

2.1.1.2.1.4. 結果の判定
　陽性対照用プライマー対を用いたレーンで１５７bpのPCR増幅バンドが検出され、CBH351検出用プライマー対を用いたレーンで１７０bpのPCR増幅バンドが検出された場合、新たに同一のDNA試料液を用いPCR用反応液を調製し、確認用プライマー対^＊を用いPCR増幅を行う。得られたPCR増幅反応液についてアガロ−スゲル電気泳動、ゲルイメージ解析を行い、１７１bpのPCR増幅バンドが検出された場合、本検体はCBH351陽性と判定する。なお、２つのDNA抽出液での結果が異なった場合は陽性と判定する。また、どちらか一方の抽出液において陽性対照用プライマー対で予定長のPCR増幅バンドが検出されない場合には、再度電気泳動以降の操作を行い、それでも予定長のPCR増幅バンドが検出されない場合には、その抽出液での結果を無効とし、もう一方の抽出液の結果だけで判定する。２つのDNA抽出液とも陽性対照用プライマー対を用いたレーンで対応するPCR増幅バンドが検出できない場合には、改めて３回目の抽出を行い、さらにPCR以降の操作を実施して、判定を行う。３回目のDNA抽出液を用いた場合でも陽性対照用プライマー対でPCR増幅バンドが検出されないときは、本試料からの安全性未審査の組換えDNA技術応用食品の検知は不能とする。以下に判定例を示す。

判定例

	試料番号	1	2	3	4	5	6	7	8	9
抽出１	陽性対照用プライマー	+	+	+	+	+	+	+	+	-
	検出用プライマー	+	+	+	+	-	-	+	+	/
	確認用プライマー	+	+	+	+	/	/	-	-	/
抽出２	陽性対照用プライマー	+	+	+	-	+	-	+	-	-
	検出用プライマー	+	+	-	-	-	-	+	-	/
	確認用プライマー	+	-	/	/	/	/	-	/	/
判定		陽性	陽性	陽性	陽性	陰性	陰性	陰性	陰性	/

　試料番号９の例の場合には、３回目の抽出を行う。
　+は陽性、-は陰性、/は検査不要を表す。
^＊CBH351確認用プライマー対は以下の通りである。
　F-primer (Cry９C-５’)：５’-TAC TAC ATC GAC CGC ATC GA-３’
　R-primer (３５Ster-３’)：５’-CCT AAT TCC CTT ATC TGG GA-３’

2.1.1.3. トウモロコシ半製品（コーングリッツ、コーンフラワー、コーンミール等）からのCBH351トウモロコシの検知
　試料について粉砕せず、そのまま２３０ｇ採る他は2.1.1.1.1.ラテラルフロー法に従って行う。ラテラルフロー法により陽性の結果が得られた検体については、1.2.1.並びに2.2.1.に従い２回並行でDNAを抽出し、DNA試料液を用いて更に2.1.1.2.1.の定性PCRを実施し、どちらかの抽出液由来のPCR増幅反応液において、陽性対照用プライマー対を用いたレーンで１５７bpのPCR増幅バンドが検出され、CBH351検出用プライマー対を用いたレーンで１７０bpのPCR増幅バンドが検出された場合、陽性と判定する。

2.1.2. パパイヤ（55-1）の検知
2.1.2.1. 定性PCR法
　生食用パパイヤ及び加工食品については、検出用として２０７bpのPCR増幅バンドが検出される55-1検出用プライマー対（NosC-５’, CaMVN-３’）及び陽性対照用として２１１bpのPCR増幅バンドが検出されるPapainプライマー対（papain-５’, papain-３’）を用いること。なお、２５０bpのPCR増幅バンドが検出される55-1確認用プライマー対（CaM ３-５’, GUS nμ３’）が異なる他は2.1.1.2.1.と同様の方法で定性PCRを行う。

55-1検出用プライマー対
　F-primer（NosC-５’）：５’-TTA CGG CGA GTT CTG TTA GG-３’
　R-primer（CaMVN-３’）：５’-CAT GTG CCT GAG AAA TAG GC-３’
陽性対照用（Papain遺伝子検出用）プライマー対
　F-primer（papain-５’）：５’-GGG CAT TCT CAG CTG TTG TA-３’
　R-primer（papain-３’）：５’-CGA CAA TAA CGT TGC ACT CC-３’
55-1確認用プライマー対
　F-primer（CaM -５’）：５’-CCT TCG CAA GAC CCT TCC TCT ATA-３’
　R-primer（GUS n-３’）：５’-TCG TTA AAA CTG CCT GGC AC-３’

2.1.2.2. GUS試験法
　遺伝子組換え体作出の際、組換えの指標とするためβ-glucuronidase（GUS）遺伝子を目的とする外来遺伝子に加えて導入する場合がある。この手法を用いて作出された遺伝子組換え体は、外来遺伝子に加えGUS遺伝子も同時に発現するため、GUS活性を検出することにより遺伝子組換え体であることの判定を行うことが可能となる。GUSは５-bromo-４-chloro-３-indolyl-β-D-glucuronide（X-Gluc）を基質とする。当該基質はGUS活性により脱エステル化されインドキシル誘導体モノマーを生じる。生じたモノマーは空気により酸化されることで重合し、青色の水不溶性インジゴチン色素を生成する。遺伝子組換えパパイヤ（55-1）においてもGUS遺伝子が導入されているため、上記原理に従い、青色を呈することを指標にその活性を検出し、遺伝子組換えパパイヤであることの判定を行うことが可能である。なお、本試験法における試料検体は、呈色反応の識別しやすいことを考慮し、胚を対象とする。

2.1.2.2.1. 実験操作
　あらかじめ、２００mMリン酸緩衝液（pH７.０）^*1を１ウェル当たり５０μLずつ９６ウェルプレートのうち必要数のウェルに分注しておく。試験には、パパイヤ1個体につき１２個の胚を用いるため、必要となるウェル数は（パパイヤの個体数×１２）である。
　採取したパパイヤ果実を縦半分に切り、種子を無作為に１粒選出する。以下の手順に従い胚を取り出す。まず、ガラス板上で、粘性のある外皮をピンセットまたはメスの先端を利用し取り除く。次に、メスで種子の縦中央に切れ目を入れる^*2。深く突き刺さないよう留意しながら切れ目にメスの先端を入れ、種皮を完全に取り除き、淡白色の胚珠を採取する。次に、胚珠の縦中央に観察される白線に沿ってメスを入れ、胚珠を縦半分に切断する^*3。切断後、切断面に露出する胚をピンセットで注意深く取り出し^*4、あらかじめ９６ウェルプレートに分注しておいた２００mMリン酸緩衝液（pH７.０）に速やかに浸す。この操作を繰り返し、1検体当たり１２個の胚を取り出す。胚を採取する過程において、種皮が白色の種子や胚珠が含まれない種子が観察される場合があるが、それらは試験に用いない。ウェルに検査に用いる全ての胚を採取し終えた後、各ウェルよりリン酸緩衝液を除去する。続いて、基質溶液^*5を１ウェル当たり５０μLずつ加える。基質溶液を添加した後、その浸透を促すためアスピレ−タ−を用いて１５分間の脱気処理を行う。脱気処理後、９６ウェルプレ−ト全体をパラフィルムで密封し、３７℃、１０〜１５時間^*7の条件で保温する。保温後、各ウェルに７０％エタノ−ルを５０μLずつ加え反応を停止する。それぞれの検体について、青色を呈した胚の数を数え、GUS発現率^*8を算出する。
^*1２００mMリン酸緩衝液（pH７.０）
　２００mM NaH₂PO₄と２００mM Na₂HPO₄を３.３：６.７（v/v）の割合で混合した溶液を２００mMリン酸緩衝液（pH７.０）とする。調製時には、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合し、混合後、必ずpHが７.０であることを確認する。なお、当緩衝液は、必ず試験を開始する直前に作製し、一試験毎に使い切ること（用時調製）。
^*2パパイヤの種子は縦方向に長く、これに比して横方向に短い。このことを基準に、種子を実験者に対して横向きになるよう配置させ、メスを左端に入れ、右端に向かって横方向に切り進めることで切れ目を入れるとよい。メスを深く差し込むと胚を切断してしまうこともあるので注意する。
^*3胚珠はその中心部に位置する胚とその周りを覆う胚乳で構成されている。また、全体としては胚乳の示す淡白色をしている。しかし、胚珠表面を注意深く観察することで、淡白色とは明らかに異なる白色の線が中央部を上端から下端にかけて走っていることが観察される。この白色の線は胚によって示されるものである。胚珠を切断する際には、刃がこの線に対して平行となるようにメスを入れ、胚を傷つけないよう注意しながら二分する。
^*4胚が露出しなかった場合、切断面において胚を覆っている胚乳をメスで削り取り、胚を露出させる。その後、ピンセットを用いて注意深く取り出す。この際、胚を傷つけないよう充分注意しながら操作を進める。傷のついた胚は非特異的に青色を呈する場合がある。
^*5基質溶液
　X-Gluc溶液^*6が最終濃度１mMとなるように、２００mMリン酸緩衝液（pH７.０）で調製した溶液を基質溶液とする。基質溶液調製時には、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合し、均一な溶液として調製する。なお、基質溶液は、必ず試験に供する胚すべてを採取し終えた後に調製し、一試験毎に使い切るものとする。
^*6X-Gluc溶液
　X-Gluc粉末２０mgをマイクロ遠沈管（１.５mL）に量り取り、１mLのジメチルホルムアミドを加え溶解したものをX-Gluc溶液とする。−２０℃で保存すること。
^*7恒温器を使用して保温する。また、１５時間を超えて保温した場合、非遺伝子組換えパパイヤの胚が非特異的に染色される可能性が考えられる。この場合、正確な判定を下すことができなくなるため、保温時間については記載された時間を厳守すること。
^*8GUS発現率（％）=〔（青色を呈した胚の数）/（試験した胚の数１２）〕×１００

2.1.2.2.2.　結果の判定
　検体が遺伝子組換えパパイヤ（55-1）の場合、理論的には７５％（９胚/１２胚）の割合で胚が青色を呈する。しかし、当該試験法においては、試験に供する胚を無作為に選出するため、必ずしも上記理論値には合致しない。一方、非遺伝子組換えパパイヤでは、青色を呈する胚は観察されない。したがって、GUS発現率が３０％以上（青色を呈した胚の数が４以上）の場合を陽性と判定し、GUS発現率が３０％未満（青色を呈した胚の数が４未満）の場合を陰性と判定する。
　判定例：試料１は、試験に供した１２個の胚のうち青色を呈した胚はみられない（GUS発現率 ０％）ため、陰性と判定される。また、試料２は、１２個の胚のうち、９個が青色を呈した（GUS発現率 7５％）ため、陽性と判定される。）

試料番号	1	2	3	陰性対照
調査した胚の数	12	12	12	12
青色を示した胚の数	0	9	4	0
GUS発現率	0	75	33	0
判定	陰性	陽性	陽性	陰性

2.1.3. トウモロコシ（Bt10）の検査
2.1.3.1. 定性PCR法
　トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ半製品について、PCR増幅及び結果の判定を除き、2.1.1.2.1.と同様の方法で定性PCRを行う。なお、DNA抽出精製は、2.2.1.2.に示すシリカゲル膜タイプキット法（QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit: トウモロコシに適用）を用いる。

2.1.3.1.1. PCR増幅
　PCR用反応試料管に反応液を以下のように調製する。反応液は、PCR緩衝液^*1、０.１６mmol/L dNTP、１.５mmol/L 塩化マグネシウム、０.６mmol/L ５’及び３’プライマー^*2並びに０.８units Taq DNAポリメラーゼ^*3を含む液に、１０ng/μLに調製したDNA試料液５.０μL（DNAとして５０ng）を氷中で加え、全量を２５μLにする。次に、その反応試料管をPCR増幅装置^*4にセットする。反応条件は次の通りである。９４℃に１０分間保ち反応を開始させた後、９４℃ ２５秒間、６２℃ ３０秒間、７２℃ ４５秒間を１サイクルとして、４０サイクルのPCR増幅を行う。次に終了反応として７２℃で７分間保った後、４℃で保存し、得られた反応液をPCR増幅反応液とする。PCRのブランク反応液として、必ずプライマー対を加えないもの及びDNA試料液を加えないものについても同時に調製する。また、試料からDNAが抽出されていることの確認として、DNA試料液ごとに、Bt10検出用プライマー対の代わりに陽性対照用プライマー対^*5を用い、同様にPCR増幅を行う。
^*1PCR緩衝液
　PCR buffer II（アプライドバイオシステムズ社製、塩化マグネシウムを含まないもの）又は同等の結果が得られるものを用いる。
^*2Bt10 検出用プライマー対は以下の通りである。
　F-primer（JSF５）：５’-CAC ACA GGA GAT TAT TAT AGG GTT ACT CA-３’
　R-primer（JSR５）：５’-ACA CGG AAA TGT TGA ATA CTC ATA CTC T-３’
^*3Taq DNAポリメラーゼ
　AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ（アプライドバイオシステムズ社製）又は同等の結果が得られるものを用いる。
^*4PCR増幅装置
　GeneAmp PCR System 9700（アプライドバイオシステムズ社製）又は同等の結果が得られるものを用いる。
^*5陽性対照用のプライマー対は以下の通りである。
　F-primer（Zein n-５’）：５’-CCT ATA GCT TCC CTT CTT CC-３’
　R-primer（Zein n-３’）：５’-TGC TGT AAT AGG GCT GAT GA-３

2.1.3.1.2. 結果の判定
　陽性対照用プライマー対を用いたレーンで１５７bpのPCR増幅バンドが検出され、Bt10検出用プライマー対を用いたレーンで１１７bpのPCR増幅バンドが検出された場合、新たに同一のDNA試料液を用いPCR用反応液を調製し、Bt10確認用プライマー対^*1を用いPCR増幅を行う^*2。得られたPCR増幅反応液についてアガロ−スゲル電気泳動、ゲルイメージ解析を行い、１５１bpのPCR増幅バンドが検出された場合、本検体はBt10系統陽性と判定する。なお、２つのDNA抽出液での結果が異なった場合は陽性と判定する。また、どちらか一方の抽出液において、陽性対照用プライマー対で予定長のPCR増幅バンドが検出されない場合には、再度電気泳動以降の操作を行い、それでも予定長のPCR増幅バンドが検出されない場合には、その抽出液での結果を無効とし、もう一方の抽出液の結果だけで判定する。２つのDNA抽出液とも陽性対照用プライマー対を用いたレーンで対応するPCR増幅バンドが検出できない場合には、改めて３回目の抽出を行い、さらにPCR以降の操作を実施して、判定を行う。３回目のDNA抽出液を用いた場合でも陽性対照用プライマー対でPCR増幅バンドが検出されないときは、本試料からの安全性未審査の組換えDNA技術応用食品の検知は不能とする。判定例は2.1.1.2.1.4.を参照のこと。
^*1Bt10 確認用プライマー対は以下の通りである。
　F-primer（Bt10LS-5’）：５’-GCC ACA ACA CCC TCA ACC TCA-３’
　R-primer（Bt10LS-3’）：５’-GAA GTC GTT GCT CTG AAG AAC AT-３’
^*2　Bt10 確認用プライマー対を用いる場合のPCR条件は以下の通りである。９４℃に１０分間保ち反応を開始させた後、９４℃ ２５秒間、６５℃ ３０秒間、７２℃ ４５秒間を１サイクルとして、４０サイクルのPCR増幅を行う。次に終了反応として７２℃ で７分間保った後、４℃で保存し、得られた反応液をPCR増幅反応液とする。

^* 個々の機種の状態によってAmplification plot上のΔRnが変動することから、普遍的なTh. Lineの設定の数値を示すことが困難である。従ってAmplification plot上でベースライン（3サイクルから15サイクル）のΔRnのノイズ幅の最大値をより上側で、安定した指数関数的な増幅曲線上で交わるTh. Lineを選択する。参考として、ABI PRISM^TM 7700、ABI PRISM^TM 7900及びABI PRISM^TM 7500のいずれにおいても0.2-0.5の範囲であると考えられる。

2.2. DNA抽出精製法
　DNAの抽出精製の際用いる水は、特に断り書きがない限りすべて逆浸透膜精製したRO水又は蒸留水をMilli-Q等で１７MΩ/cmまで精製した超純水など、DNA、DNase等がコンタミネーションしていないものを用いること。

2.2.1. トウモロコシ及び大豆穀粒からのDNA抽出精製
　界面活性剤セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）とフェノール/クロロホルム混合液を用いて抽出精製するCTAB法は、応用範囲が広い上、PCR阻害物質が残存しにくく、純度の高いDNAを得ることができる非常に優れた方法であるが、フェノール、クロロホルムという有害試薬を用いること及び煩雑な精製操作が必要という欠点がある。市販のDNA抽出キットを用いるとこれらの欠点を解消することができる。市販のDNA抽出キットには、シリカゲル膜タイプのもの、シリカベースのレジンタイプのもの、イオン交換樹脂タイプのもの、マグネット吸着ビーズタイプのものがあるが、いずれの方法を利用しても、トウモロコシ、大豆等の穀粒からPCRに利用可能なDNAを抽出精製することができる。以上の点を考慮して、本項では、CTAB法とシリカゲル膜タイプキット（QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit並びにNIPPON GENE GM quicker）を用いた方法、シリカベースのレジンタイプのキット（Promega Wizard DNA Clean-up System）を用いた方法を記す。なお、シリカゲル膜タイプキット法は、使用するキット及び、適用する試料によって操作方法が異なるため注意する。

2.2.1.1. CTAB法
　均質に粉砕された試料２gをポリプロピレン製遠沈管（５０mL容）に量り採り、CTAB緩衝液^*1１５mLを入れ、ホモジナイザーで組織が見えなくなるまで均一化する。遠沈管の縁とホモジナイザーの先を洗浄するように CTAB緩衝液３０mLを加え、転倒混和後５５℃で３０分間放置する^*2。次いで放置液を撹拌し、均質化した溶液６００μLをマイクロ遠沈管（１.５mL容）に量り採る。次いで５００μLのフェノール/クロロホルム混合液^*3を加え、転倒混和後ミキサーで軽く懸濁し、７,５００×gで１５分間室温遠心後、水層（上層）を新しいマイクロ遠沈管に移す。この時中間層に触れないように注意する。クロロホルム/イソアミルアルコール混合液^*4５００μLを加え、転倒混和後ミキサーで軽く懸濁し、７,５００×gで１５分間室温で遠心後、水層（上層）を新しいマイクロ遠沈管に移す。等容量のイソプロピルアルコール（室温）を加え、転倒混和後７,５００×gで１０分間室温遠心し、デカンテーションで上澄み液を捨てる。５００μLの７０％エタノールを壁面から静かに加え、７,５００×gで１分間室温遠心し、沈殿に触れないようにできる限りエタノールを吸い取り捨てる。その後、２〜３分間真空乾燥する。このとき完全に乾燥しないように注意する。５０μLのTE緩衝液^*5を加えてよく混和後、室温に１５分間放置して、時々転倒混和して完全に溶かす。RNase A　５μLを加え、３７℃で３０分間放置する。２００μLのCTAB緩衝液を加えた後、２５０μLのクロロホルム/イソアミルアルコール混合液を加え、転倒混和後ミキサーで軽く懸濁し、７,５００×gで１５分間室温遠心後、水層（上層）を新しいマイクロ遠沈管に移す。このとき、中間層に触れないように採取する。２００μLのイソプロピルアルコールを加え、転倒混和してから、７,５００×gで１０分間、室温で遠心し、デカンテーションで上澄み液を捨てる。次いで、２００μLの７０％エタノールを壁面から静かに加え、７,５００×gで１分間室温遠心し、沈殿に触れないようにできる限りエタノールを吸い取り捨てる。その後、２〜３分間真空乾燥する。このとき、完全に乾燥しないよう注意する。５０μLの水を加えて混合した後、１５分間室温に放置して、時々転倒混和して完全に溶解したものをDNA試料原液^*6とする。
^*1CTAB緩衝液
　ビーカーに、０.５mol/L EDTA（pH８.０）８mL、１mol/L Tris−塩酸（pH８.０）２０mL、５mol/L食塩水５６mLを入れ、約１５０mLとなるように水を加え、撹拌しながらCTAB ４gを加えて完全に溶解する。さらに水を加え全量を２００mLとし、オートクレーブで滅菌したものをCTAB緩衝液とする。
^*2ホモジナイザーを使用しない場合には、ボルテックスミキサーを用いて試料塊がないように激しく混合する。その際には、まず１５mLのCTAB緩衝液を加え十分に混合した後、さらにCTAB緩衝液３０mLを加え混合する。混合後は、加温処理以降の操作に従う。
^*3フェノール/クロロホルム混合液
　１mol/L Tris−塩酸（pH８.０）飽和フェノールとクロロホルム/イソアミルアルコール混合液を１：１（v/v）で混合したものをフェノール/クロロホルム混合液とする。
^*4クロロホルム/イソアミルアルコール混合液
　クロロホルムとイソアミルアルコールを２４：１（v/v）で混合したものをクロロホルム/イソアミルアルコール混合液とする。
^*5TE緩衝液
　各最終濃度が１０mmol/L Tris−塩酸（pH８.０）、１mmol/L EDTA（pH８.０）となるように水を用いて調製したものをTE緩衝液とする。
^*6定量PCRに供する際は、DNA試料液はTE緩衝液を用いてDNAを溶解し、濃度を調製したものとする。そのため、定量PCR法を実施することを目的としてDNA抽出を行う場合には、真空乾燥させた沈殿に５０μLのTE緩衝液を加えて混合した後、４℃で一晩保存することで完全に溶解し、DNA試料原液とする。

2.2.1.2. シリカゲル膜タイプキット法（QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit:トウモロコシに適用）
　均質に粉砕した試料２gをポリプロピレン製遠沈管（５０mL容）に量り採り、あらかじめ６５℃に温めておいたAP1緩衝液^*1１０mLとRNase A ２０μLを加え、試料塊がないようにボルテックスミキサーで激しく混合し、６５℃で１５分間加温する。その間２、３回、遠沈管を反転させて試料を攪拌する。AP2緩衝液^*2３,２５０μLを加え、氷上に１０分間静置した後、４,０００×g以上、４℃の条件で２０分間遠心する^*3。次いでその上清５００μLをQIAshredder spin columnに負荷し、１０,０００×g以上で４分間遠心後、溶出液を遠沈管（１５mL容）に移す。この操作を再度繰り返した後、その溶出液の１.５倍量のAP3緩衝液^*4・エタノール混液^*5を加える。その混合液５００μLをmini spin columnに負荷し、１０,０００×g以上で１分間^*6遠心する。残りの混合液のうち、さらに５００μLを同じmini spin columnに負荷し、同条件で遠心し溶出液を捨てる。最終的に混合液がすべてなくなるまで同様の操作を繰り返す。次いでAW緩衝液^*7５００μLを負荷し、１０,０００×g以上で１分間^*6遠心し、溶出液を捨てる。同様の操作を計３回繰り返す。溶出液を捨て、mini spin columnを乾燥させるため、１０,０００×g以上で２０分間遠心する。mini spin columnをキットの遠沈管に移し、あらかじめ６５℃に温めておいた水７０μLを加え、５分間静置した後、１０,０００×g以上で１分間遠心しDNAを溶出する。もう一度水を加え、同じ操作を行い、得られた溶出液を合わせ、DNA試料原液^*8とする。
^*1AP1緩衝液
　シリカゲル膜タイプのキット（QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit）付属のもの、あるいは別途購入したものを用いる。
^*2AP2緩衝液
　シリカゲル膜タイプのキット（QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit）付属のもの、あるいは別途購入したものを用いる。
^*3遠心後の上清
　上清を確認し、澄明でない場合には、同条件での遠心操作を再度繰り返し、以降の操作を行う。
^*4AP3緩衝液
　シリカゲル膜タイプのキット（QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit）付属のもの、あるいは別途購入したものを用いる。
^*5AP3緩衝液・エタノール混液
　AP3緩衝液^*4とエタノール（９６-１００％）を１：２で混合したものをAP3緩衝液・エタノール混液とする。
^*6遠心時間
　mini spin columnに負荷する液の性状により、カラムの通過に時間がかかることがある。すべての液がカラムを通過するのに必要な遠心時間を適宜、調整する。
^*7AW緩衝液
　使用する直前に、容器ラベルに記載された適量のエタノ−ル(９６-１００％)を混合したものをAW緩衝液とする。
^*8定量PCRに供する際は、spin columnの乾燥以降の操作を下記のとおり変更し行う。「mini spin columnをキットの遠沈管に移し、あらかじめ６５℃に温めておいたTE緩衝液７０μLを加え、５分間静置した後、１０,０００×g以上で１分間遠心しDNAを溶出する。もう一度TE緩衝液を加え、同じ操作を行い、得られた溶出液を合わせ、DNA試料原液とする。

2.2.1.3. シリカゲル膜タイプキット法（QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit: 大豆に適用）
　均質に粉砕した試料１gをポリプロピレン製遠沈管（５０mL容）に量り採り、あらかじめ６５℃に温めておいたAP1緩衝液^＊1 １０mLとRNase A ２０μLを加え、試料塊がないようにボルテックスミキサーで激しく混合し、６５℃で１時間加温する。その間５、６回、遠沈管を反転させて試料を攪拌する。スイング式遠心分離機を使用し、３,０００×g、室温の条件で１０分間遠心後、その上清７mLを、ポリプロピレン製遠沈管(１５mL容)に移す。AP2緩衝液^＊2 ２,５００μLを加え、ボルテックスミキサーで１０秒間激しく攪拌する。氷上に１5分間静置後、スイング式遠心機で3,０００×g以上、室温の条件で３５分間遠心する^＊3。得られた上清のうち8mLを新しい１５mLチューブに移す。ボルテックスミキサーを用いて攪拌した後、５００μLをQIAshredder spin columnに負荷し、１０,０００×g以上で４分間遠心後、溶出液を遠沈管（１５mL容）に移す。その溶出液の１.５倍量のAP3緩衝液^＊4・エタノール混液^＊5を加える。混合液５００μLをmini spin columnに負荷し、１０,０００×g以上で１分間^*6遠心する。残りの混合液のうち、さらに５００μLを同じmini spin columnに負荷し、同条件で遠心し溶出液を捨てる。最終的に混合液がすべてなくなるまで同様の操作を繰り返す。次いでAW緩衝液^＊7 ５００μLを負荷し、１０,０００×g以上で１分間^＊6遠心し、溶出液を捨てる。同様の操作を計３回繰り返す。溶出液を捨て、mini spin columnを乾燥させるため、１０,０００×g以上で２０分間遠心する。mini spin columnをキットの遠沈管に移し、あらかじめ６５℃に温めておいた水７０μLを加え、５分間静置した後、１０,０００×g以上で１分間遠心しDNAを溶出する。もう一度水を加え、同じ操作を行い、得られた溶出液を合わせ、DNA試料原液^＊8とする。
^＊1 AP1緩衝液
　シリカゲル膜タイプのキット（QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit）付属のもの、あるいは別途購入したものを用いる。
^＊2 AP2緩衝液
　シリカゲル膜タイプのキット（QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit）付属のもの、あるいは別途購入したものを用いる。
^＊3 遠心後の上清
　上清を確認し、澄明でない場合には、同条件での遠心操作を再度繰り返し、以降の操作を行う。
^＊4 AP3緩衝液
　シリカゲル膜タイプのキット（QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit）付属のもの、あるいは別途購入したものを用いる。
^＊5 AP3緩衝液・エタノール混液
　AP3緩衝液^*4 とエタノール（９６-１００％）を１：２で混合したものをAP3緩衝液・エタノール混液とする。
^＊6 遠心時間
　mini spin columnに負荷する液の性状により、カラムの通過に時間がかかることがある。すべての液がカラムを通過するのに必要な遠心時間を適宜、調整する。
^＊7 AW緩衝液
　使用する直前に、容器ラベルに記載された適量のエタノ−ル(９６-１００％)を混合したものをAW緩衝液とする。
^＊8　定量PCRに供する際は、spin columnの乾燥以降の操作を下記のとおり変更し行う。「mini spin columnをキットの遠沈管に移し、あらかじめ６５℃に温めておいたTE緩衝液７０μLを加え、５分間静置した後、１０,０００×g以上で１分間遠心しDNAを溶出する。もう一度TE緩衝液を加え、同じ操作を行い、得られた溶出液を合わせ、DNA試料原液とする。」

2.2.1.４. シリカゲル膜タイプキット法（NIPPON GENE GM quicker: トウモロコシに適用）
　均質に粉砕した試料1gをポリプロピレン製遠沈管（５０mL容）に量り採り、GEｌ 緩衝液^＊1 6mLとRNase A ２０μLを加え、試料塊がないようにボルテックスミキサーで３０秒間混合した後^*2、室温で１０分間静置する。GE2 緩衝液^＊3 ７５０μＬを加え、１０〜１２回転倒混和し^*4、氷上に１０分間静置する。5,０００×g以上、４℃の条件で1０分間遠心^*5する。次いでその上清^*6４００μLを１.５mLチューブに移し、GB3 緩衝液　５０μL及びエタノール（１００％） ２００μLを添加した後、１０〜１２回転倒混和する^*7。混合液６５０μL(全量)をspin columnに負荷した後、１３,０００×g以上、４℃の条件で３０秒間遠心し、溶出液を捨てる。次いでGW緩衝液6００μLを負荷し、１３,０００×g以上、４℃の条件で１分間遠心し、溶出液を捨てる。spin columnを乾燥させるため、１３,０００×g以上、４℃の条件で３分間遠心する。spin columnを新たな１.５mL容チューブに移し、水 ５０μLを加え３分間室温で静置した後、１３,０００×g以上で１分間遠心し、得られた溶出液をDNA試料原液^＊8とする。
^＊1 GEｌ緩衝液
　シリカゲル膜タイプのキット（NIPPON GENE GM quicker）付属のもの、あるいは別途購入したものを用いる。
^*2　攪拌操作が不十分であると、DNAの収量が著しく減少する。ボルテックスに対して５０ｍL容チューブを垂直にあて、そのまま３０秒間しっかりと攪拌する。攪拌が不十分な場合はさらに３０〜６０秒間攪拌する。
^＊3 GE２緩衝液
　シリカゲル膜タイプのキット（NIPPON GENE GM quicker）付属のもの、あるいは別途購入したものを用いる。
^*4　発生した泡がチューブ内に残っていても、続けてGE2緩衝液を添加することが可能である。抽出液には粘性が生じているので、添加したGE2緩衝液が十分に均一となるよう混合する。
^*5　使用するローター及び５０ｍL容チューブの特性を考慮したうえで、gが最大となるように遠心条件を設定する。
^*6　沈殿や浮遊物等を可能な限り取らないように上清を回収する。また、上清は４mL程分取することが可能であり、４℃の条件であれば、数日は安定である。その後の試験にあわせ、DNAの再抽出・精製が必要となった場合には、本上清を用い、それ以降の操作を実施する。
^*7　GB3緩衝液を添加し、続いてエタノールを添加した後に、攪拌操作を行う。析出物が生じて白濁している場合は、液が透明になるまで十分転倒混和する。
^＊8　定量PCRに供する際は、spin columnの乾燥以降の操作を下記のとおり変更し行う。「spin columnを新たな１.５mL容チューブに移し、TE緩衝液 ５０μLを加え３分間室温で静置した後、１３,０００×g以上で１分間遠心し、得られた溶出液をDNA試料原液とする。」

2.2.1.5. シリカゲル膜タイプキット法（NIPPON GENE GM quicker: 大豆に適用）
　均質に粉砕した試料1gをポリプロピレン製遠沈管（５０mL容）に量り採り、GEｌ　緩衝液^＊1 １２mLとRNase A ４０μLを加え、試料塊がないようにボルテックスミキサーで３０秒間混合した後^*2、室温で１０分間静置する。GE2緩衝液^＊3 １,５００μＬを加え、１０〜１２回転倒混和し^*4、氷上に１０分間静置する。5,０００×g以上、４℃の条件で1０分間遠心する^*5。次いでその上清^*6７００μLを２.０mLチューブに移し、GE3緩衝液　２５０μL及びイソプロパノール（１００％）　２５０μLを添加した後、１０〜１２回転倒混和する^*7。混合液６００μLをspin columnに負荷し、１３,０００×g以上、４℃の条件で３０秒間遠心し、溶出液を捨てる。残りの混合液全量を同じspin columnに負荷し、同条件で遠心し溶出液を捨てる。次いでGW緩衝液6００μLを負荷し、１３,０００×g以上、４℃の条件で１分間遠心し、溶出液を捨てる。spin columnを新たな１.５mL容チューブに移し、水 ５０μLを加え、３分間室温で静置した後、１３,０００×g以上で１分間遠心し、得られた溶出液をDNA試料原液^＊8とする。
^＊1 GEｌ緩衝液
　シリカゲル膜タイプのキット（NIPPON GENE GM quicker）付属のもの、あるいは別途購入したものを用いる。
^*2　攪拌操作が不十分であると、DNAの収量が著しく減少する。ボルテックスに対して５０ｍL容チューブを垂直にあて、そのまま３０秒間しっかりと攪拌する。攪拌が不十分な場合はさらに３０〜６０秒間攪拌する。
^＊3 GE２緩衝液
　シリカゲル膜タイプのキット（NIPPON GENE GM quicker）付属のもの、あるいは別途購入したものを用いる。
^*4　発生した泡がチューブ内に残っていても、続けてGE2緩衝液を添加することが可能である。抽出液には粘性が生じているので、添加したGE2緩衝液が十分に均一となるよう混合する。
^*5　使用するローター及び５０ｍL容チューブの特性を考慮したうえで、gが最大となるように遠心条件を設定する。
^*6　沈殿や浮遊物等を可能な限り取らないように上清を回収する。また、上清は８mL程分取することが可能であり、４℃の条件であれば、数日は安定である。その後の試験にあわせ、DNAの再抽出・精製が必要となった場合には、本上清を用い、それ以降の操作を実施する。
^*7　GB3緩衝液を添加し、続いてイソプロパノールを添加した後に、攪拌操作を行う。析出物が生じて白濁している場合は、液が透明になるまで十分転倒混和する。
^＊8　定量PCRに供する際は、spin columnの乾燥以降の操作を下記のとおり変更し行う。「spin columnを新たな1.5mL容チューブに移し、TE緩衝液 50μLを加え3分間室温で静置した後、１３,０００×g以上で１分間遠心し、得られた溶出液をDNA試料原液とする。」

2.2.1.6. シリカベースレジンタイプキット法（Promega Wizard DNA Clean-up System）
　均質に粉砕した試料２gをポリプロピレン製遠沈管（５０mL容）に量り採り、抽出用緩衝液^*1１７.２mL、５mol/L グアニジン-塩酸２mL及び２０mg/mL Proteinase Kを０.８mL加え、激しくボルテックスミキサーで撹拌後、５５〜６０℃で振とうしながら３時間保温する。次いで、室温まで温度を下げ、３,０００×gで１０分間遠心する。上清が濁っている場合、上清の一部をマイクロ遠沈管（１.５mL容）に移し、さらに１４,０００×gで１０分間遠心する。得られた澄明な上清５００μLと、DNA Clean-up Resin１mLをマイクロ遠沈管(１.５mL容)に採り、転倒混和し、混合液とする。次にmini columnの上部に注射筒を付け、マニホールド（吸引装置）に装着する。マニホールドのコックを閉じ、吸引装置内部が十分に減圧になっていることを確認した後、混合液を注射筒からmini columnに負荷する。直ちにコックを開け、最速で減圧吸引して溶液を完全に除去し、次いで２mLの８０％イソプロピルアルコールを注射筒から加えカラムを洗浄する。注射筒を外したmini columnをマイクロ遠沈管（１.５mL容）に装着し、室温下１０,０００×gで２分間遠心し、カラムを乾燥する。次にmini columnを新しいマイクロ遠沈管（１.５mL容）に移し、あらかじめ６５〜７０℃に温めておいた水１００μLを滴下する^*2。１分間放置後、室温下１０,０００×g以上で１分間遠心し、DNA を溶出し、得られた溶出液をDNA試料原液とする。
^*1抽出用緩衝液
　１５０mM 塩化ナトリウム、２mmol/L EDTA及び１％ SDSを含む１０mmol/L Tris-塩酸緩衝液 （pH７.５）
^*2定量PCR法に供する際は、水の代わりにあらかじめ６５〜７０℃に温めておいたTE緩衝液１００μLを滴下する。

2.2.2. パパイヤからのDNA抽出精製
　採取したパパイヤから種子を除いた果肉部分をおよそ１０mm角に切り出し、凍結乾燥を行う。次にミキサーミル等でこれらを混合し、粉砕する。粉砕試料を用い、以下のCTAB法または、シリカゲル膜タイプのキット（QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit）を用いた方法に従ってDNAを抽出精製する。

2.2.2.1. CTAB法
　粉砕試料２０mgをマイクロ遠沈管（１.５mL容）に量り採り、CTAB緩衝液１５０μLを入れ、マイクロミキサーで組織が見えなくなるまで均一化する^＊。ミキサーの先を洗浄するように CTAB緩衝液４５０μLを加え、転倒混和してから５５℃で３０分間放置する。５００μLのフェノール/クロロホルム混合液を加え、転倒混和後ミキサーで軽く懸濁し、７,５００×gで１５分間室温遠心後、水層（上層）を新しいマイクロ遠沈管に移す。このとき、中間層に触れないように注意する。５００μL クロロホルム/イソアミルアルコール混合液を加え、転倒混和後ミキサーで軽く懸濁し、７,５００×gで１５分間室温遠心後、水層（上層）を新しいマイクロ遠沈管に移す。等容量のイソプロピルアルコール（室温）を加え、転倒混和後 ７,５００×gで１０分間室温遠心し、デカンテーションで上澄み液を捨てる。５００μLの７０％エタノールを壁面から静かに加え、７,５００×gで１分間室温遠心し、沈殿に触れないようにできる限りエタノールを吸い取り捨てる。その後、２〜３分間真空乾燥する。このとき完全に乾燥しないように注意する。５０μLのTE緩衝液を加えてよく混和後、室温に1５分間放置して、時々転倒混和して完全に溶かす。RNase A　５μLを加え、３７℃で３０分間放置する。２００μLのCTAB緩衝液を加えた後に、２５０μLのクロロホルム/イソアミルアルコール混合液を加え、転倒混和後ミキサーで軽く懸濁し、７,５００×gで１５分間室温遠心後、水層（上層）を新しいマイクロ遠沈管に移す。この時、中間層に触れないように採取する。２００μLのイソプロピルアルコールを加え、転倒混和してから、７,５００×gで１０分間室温で遠心し、デカンテーションで上澄み液を捨て、ピペットでイソプロピルアルコールを捨てる。次いで、２００μLの７０％エタノールを壁面から静かに加え、７,５００×gで１分間室温遠心し、沈殿に触れないようにできる限りエタノールを吸い取り捨てる。その後、２〜３分間真空乾燥する。このとき、完全に乾燥しないよう注意する。５０μLの水を加えて混合した後、１５分間室温に放置して、時々転倒混和して完全に溶解したものをDNA試料原液とする。
^＊マイクロミキサーを使用しない場合には、ボルテックスミキサーを用いて試料塊がないように激しく混合する。その際には、まず３００μLのCTAB緩衝液を加え十分に混合した後、さらにCTAB緩衝液３００μLを加え混合するようにする。混合後は、加温処理以降の操作に従う。

2.2.2.2. シリカゲル膜タイプキット法
　粉砕試料８０mgをマイクロ遠沈管（２mL容）に量り採り、シリカゲル膜タイプのキット（QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit）を用い、以下の方法に従ってDNAを抽出精製する。
　試料にあらかじめ６５℃に温めておいたAP1緩衝液６００μLとキット付属のRNase A ４μLを加え、試料塊がないようホモジナイザーを用いて混合し、６５℃で１５分間放置する。その間数回遠沈管を反転させ試料を撹拌する。その後AP2緩衝液１９５μLを加え、氷上に５分放置後、室温下１０,０００×gで５分間遠心する。上清をQIAshredder spin columnに負荷し、室温下１０,０００×gで２分間遠心し、溶出液をマイクロ遠沈管（２mL容）に移す。遠沈管に1.５倍量のAP3緩衝液・エタノール混液を加え、１０秒間ボルテックスミキサーで撹拌した後、得られた混合液のうち５００μLをmini spin columnに負荷し、室温下１０,０００×gで５分間遠心し^＊、溶出液を捨てる。次いで、残りの混合液のうち、さらに５００μLを同じmini spin columnに負荷し、同条件で遠心し溶出液を捨てる。最終的に混合液がすべてなくなるまで同様の操作を繰り返す。次いで、columnにAW緩衝液５００μLを加え、室温下１０,０００×gで５分間遠心し、溶出液を捨てもう一度AW緩衝液を加え、同じ操作を繰り返す。溶出液を捨て、mini spin columnを乾燥させるため、１０,０００×g以上で１５分間遠心する。mini spin columnをキットの遠沈管に移し、あらかじめ温めておいた水５０μLを加え、５分間放置した後、１０,０００×gで１分間遠心しDNAを溶出する。もう一度水を加え、同様の操作を行い、得られた溶出液を合わせ、DNA試料原液とする。
^＊混合液中に析出物が有る場合columnが詰まりやすくなる。その場合、完全に溶出させるため遠心時間を１０分程度まで延ばす。

2.2.3. 加工食品からのDNAの抽出精製
　平成１２年農林水産省告示第５１７号第３条に規定する別表２の加工食品からのDNAの抽出精製は、独立行政法人農林水産消費技術センター作成のJAS分析試験ハンドブック「遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル 個別品目編」に記載されている方法を準用する。タコス、トルティーヤ、コーンチップ及びコーンフレーク（加熱加工されているものに限る。）、ジャガイモ（加工品を含む。）並びに缶詰のパパイヤからのDNAの抽出精製は以下の手法で行う。

2.2.3.1. タコス、トルティーヤ、コーンチップ及びコーンフレーク（加熱加工されているものに限る）からのDNAの抽出精製
　試料を凍結乾燥した後、ミキサーミル等で粉砕する。次いで粉砕試料１gをポリプロピレン製遠沈管（５０mL容）に量り採り、イオン交換樹脂タイプのDNA抽出精製キット（QIAGEN Genomic-tip）を用い以下のようにDNAを抽出精製する。
　試料にG2緩衝液^*1４mLを加えて、ボルテックスミキサー等で激しく混合し、さらにG2緩衝液４mL、Proteinase K^*2１００μLとRNase A １０μLを加えて、よく振って混合した後、５０℃で２時間放置する。その間２〜３回遠沈管を反転させて試料を転倒混和する。次いで、３,０００×g以上で, 低温下（４℃）１５分遠心し、得られた上清をポリプロピレン製遠沈管（１５mL容）に移し、さらに軽く遠心する。次いで、QBT緩衝液^*1１mLを用い平衡化したQIAGEN Genomic-tip ２０/Gに２mLずつ数回に分けて負荷する。次いで、チップをQC緩衝液^*1で２mLずつ３回洗浄した後、チップを新しい遠沈管に移し、あらかじめ５０℃に温めておいたQF緩衝液^*2を１mLずつ２回加え、DNAを溶出する。溶出液を遠沈管に移し、０.７倍量のイソプロピルアルコールを加えよく混合し、１０,０００×g以上で、低温下（４℃）１５分間遠心し、上清を捨てた後、７０％エタノール１mLを加え、さらに１０,０００×g以上で、低温下（４℃）５分間遠心する。さらに上清を捨て、残った沈殿をアスピレーターを用い乾燥した後、水１００μLを加え、６５℃で５分間放置し、ピペッティングによりDNAを溶解させ、DNA試料原液とする。
^*1G2緩衝液、QBT緩衝液、QC緩衝液及びQF緩衝液はキットに付属しているが、足りない場合にはキットの説明書に従って調製可能である。
^*2QIAGEN社のもの又は同等の効力を持つものを用いる。

2.2.3.2. ジャガイモ（加工品を含む）からのDNAの抽出精製
　試料をミキサーミル等により粉砕した後、粉砕試料２００mgをポリプロピレン製遠沈管（１５mL容）に量り採る。試料中に水分が多い場合は８,０００×gで１５分間遠心し、上清を捨てる。次いでシリカゲル膜タイプのキット（QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit）を用い、以下の様にDNAを抽出精製する。
　試料にあらかじめ６５℃に温めておいたAP1緩衝液１.５mLとRNase A １０μLを加え、試料塊がないようボルテックスミキサーで激しく混合し、６５℃で1５分間放置する。その間数回遠沈管を反転させサンプルを撹拌する。その後AP2緩衝液４００μLを加え、氷上に５分放置後、室温下１０,０００×gで５分間遠心する。上清を別の遠沈管に移し、その内５００μLをQIAshredder spin columnに負荷し、１０,０００×gで２分間、室温で遠心し、溶出液をキットの遠沈管に移す。これを全量終えるまで数回繰り返す。得られた溶出液のうち半量を別のマイクロ遠沈管（２mL容）に移し、それぞれの遠沈管に1.５倍量のAP3緩衝液・エタノール混液を加え、１０秒間ボルテックスミキサーで撹拌し、溶解液を得る。得られた溶解液のうち５００μLを、mini spin columnに負荷し、室温下１０,０００×gで1分間遠心し、溶出液を捨てる。次いで残りの溶解液のうち、さらに５００μLを同じmini spin columnに負荷し、同条件で遠心し溶出液を捨てる。最終的に溶解液がすべてなくなるまで同様の操作を繰り返す。
　次いで、columnにAW緩衝液５００μLを加え、室温下１０,０００×gで１分間遠心し、溶出液を捨てもう一度AW緩衝液を加え、同じ操作を繰り返す。溶出液を捨てた後、mini spin columnを乾燥するため、１０,０００×ｇ以上で１５分間遠心する。mini spin columnをキットの遠沈管に移し、あらかじめ温めておいた水５０μLを加え、５分間放置した後、室温下１０,０００×gで１分間遠心しDNAを溶出する。もう一度水を加え、同じ操作を行い、得られた溶出液を合わせ、DNA試料原液とする。

2.2.3.3. 缶詰のパパイヤからのDNAの抽出精製
　試料を水でよく洗浄し、凍結乾燥した後、ミキサーミル等で粉砕する。次いで粉砕試料２gをポリプロピレン製遠沈管（５０mL容）に量り採り、イオン交換樹脂タイプのDNA抽出精製キット（QIAGEN Genomic-tip）を用い以下のようにDNAを抽出精製する。
　試料にG2緩衝液７.５mLを加え、ボルテックスミキサー等で激しく混合し、さらにG2緩衝液７.５mL、QIAGEN Proteinase K ２００μLとRNase A ２０μLを加えて、よく振って混合した後、５０℃で２時間放置する。その間２〜３回遠沈管を反転させて試料を転倒混和する。次いで、３，０００×g以上で、低温下（４℃）１５分間遠心し、得られた上清をポリプロピレン製遠沈管（１５mL容）に移し、さらに軽く遠心する。次いで、QBT緩衝液１mLを用い平衡化したQIAGEN Genomic-tip ２０/Gに２mLずつ数回に分けて負荷する。次いで、tipをQC緩衝液で２mLずつ３回洗浄した後、チップを新しい遠沈管に移し、あらかじめ５０℃に温めておいたQF緩衝液を１mLずつ２回加え、DNAを溶出する。溶出液を遠沈管に移し、０.７倍量のイソプロピルアルコールを加えよく混合し、１０,０００×g以上で、低温下（４℃）１５分間遠心し、上清を捨てた後、７０％エタノール２mLを加え、さらに１０,０００×g以上で、低温下（４℃）５分間遠心する。さらに上清を捨て、残った沈澱をアスピレーターを用い乾燥した後、水１００μLを加え、６５℃で５分間放置し、ピペッティングによりDNAを溶解させ、DNA試料原液とする。

2.2.4. DNA試料原液中のDNAの純度の確認並びにDNA試料液の調製と保存
　DNA試料原液の適当量を取り、水あるいはTE緩衝液を用いて適宜希釈し^＊1、２００〜３２０nmの範囲で紫外部吸収スペクトルを測定し、２６０nm及び２８０nmの吸光度（O.D.２６０及びO.D.２８０^*2）を記録する。次いでO.D.２６０の値1を５０ng/μL DNAとしてDNA濃度を算出する。またO.D.２６０/O.D.２８０を計算する。この比が１.７〜２.０になれば、DNAが十分に精製されていることを示す。得られたDNA濃度から、DNA試料原液を以後の試験に必要な濃度に水で希釈して^*3DNA試料液とし、２０μLごとにマイクロ試料管に分注し、−２０℃以下で冷凍保存する。分注したDNA試料液は、融解後直ちに使用し、残った溶液は再度保存せず廃棄する。なお、DNA試料原液の濃度がPCRで規定された濃度に達しないときは、そのままDNA試料液として用いる。

^＊1試験の目的により、DNA試料原液は水もしくはTE緩衝液で調製されている。希釈する場合には、DNA試料原液の調製に使用した溶解液を用る。また、希釈倍率は、吸光度測定装置により適切な測定に要する液量及び濃度域が異なるため、適宜とする。
^*2O.D.２６０がDNA由来の吸光度、O.D.２８０がタンパク質等不純物由来の吸光度と考える。
^*3定量PCR法に供する際は、TE緩衝液を用いて希釈する。


3. 安全性審査済みの組換えDNA技術応用食品の検査方法
3.1. 大豆
3.1.1. ELISA法
　試料中のCP4EPSPSタンパク質を検知する手法である。１００mesh（編み目の一目の長さ１５０μm）のふるいを通過した粉末試料０.５gを用いて、SDI社製GMO Soya Test Kit Ver.2.１の説明書に記載された手法に従って試験する。以下に方法について記述する。
　試料又は標準品０.５gをポリプロピレン製遠沈管（１５mL容）に正確に量り採り、Soya Extraction 緩衝液４.５mLを加え、ボルテックスミキサーを用い１０秒間混合した後、２,５００×gで１５分間遠心し、上清を抽出液とする。Soya Assay 緩衝液２８０μLに抽出液２０μLを加え撹拌し希釈液とする。さらに、Soya Assay 緩衝液３８０μLに希釈液２０μLを加え撹拌し、試料液とする。このキットで作成できる検量線の範囲は０〜２.５％であるので、未知検体の抽出液について検量線の範囲内で定量値が内挿できるよう、別に１０倍希釈した試料液も準備しておく。ウェルに試料液を１００μLずつ加え、３７oCで１時間保温する。その後、Wash緩衝液で３回洗浄し、Reconstituted and Diluted Soya Conjugate Mix １００μLを加え、３７oCで1時間保温する。さらにWash緩衝液で３回洗浄する。次に、Color Reagent １００μL を加え、室温で１０分間放置した後、Stop Solution １００μLを加えて反応を停止する。反応停止後、マイクロプレートリーダーを用い、４５０nmの波長でウェルの吸光度を測定し、別途購入した標準試料を用い作成した検量線より組換え体の含有量を求める。なお、同一の実験を２ウェルで行い、得られた値を平均する。

3.1.2. 定量PCR法
　TaqMan Chemistryを応用した定量PCR法を行う。同法では、定性PCR法に通常使用するプライマー対に加え、蛍光オリゴヌクレオチドプローブを使用する。当プローブはプライマー対により増幅される塩基配列中に相補鎖を形成するよう設計されている。また、同プローブにはリポーター、クエンチャー両色素が結合しており、DNAポリメラーゼによる増幅産物の伸長反応に伴い加水分解を受けると、蛍光を放射する。蛍光強度は、PCRサイクル数に対し指数関数的に増強し、また一定の蛍光強度に達するまでのサイクル数は、鋳型DNA量に依存する。したがって、一定の蛍光強度に達したPCRサイクル数を比較することで、鋳型DNA量が求められる。
　組換えDNA技術応用食品の定量は、非組換え体、組換え体を問わず普遍的に存在する遺伝 子（内在性遺伝子）を内標として用い、内在性遺伝子のコピー数に対する組換え遺伝子のコピー数を求めることで行う。本法においては、標準物質として標準プラスミドDNA溶液^*1を使用する。標準プラスミドDNA溶液に含まれるDNAの量はコピー数として規定されており、そのため、定量PCRの結果はコピー数として求められる。
　大豆を対象とした定量PCR法においては、大豆に普遍的に存在するレクチン遺伝子を内在性遺伝子としている。検査の際には、まずレクチン遺伝子を標的とするプライマー対（Le1-n02）とプローブ（Le1-Taq）を使用し定量PCRを行い、DNA試料液中のレクチン遺伝子のコピー数を求める。また、同時に、同一DNA試料液について、組換え遺伝子を標的とするプライマー対（RRS-01）とプローブ（RRS-Taq）を使用し別に定量PCRを行い、組換え遺伝子のコピー数を求める。組換え遺伝子のコピー数をレクチン遺伝子のコピー数で除し、その値をあらかじめ求められている係数（内標比^*2）でさらに除して得られた値に１００を乗したものが、試料中に含まれる遺伝子組換え作物の％含量となる。以下に定量PCR法の実際を述べる。定量PCRはABI PRISM^TM 7700、ABI PRISM^TM 5700、ABI PRISM^TM 7900HT（96well及び384well）、ABI PRISM^TM 7000並びにRoche LightCycler System、若しくは同等の性能を有する装置を用いて行う。また、使用する機種により、試薬、反応液組成、反応条件、手技並びに解析手法が異なるため、検査に際しては、以下機種ごとに記載された各項に従い、必ず使用する機種に適した方法を用いること。なお、3.1.2.及び3.2.1.記載の.定量PCR法で用いる水は、特に断り書きがない限りすべて逆浸透膜精製したRO水又は蒸留水をMilli-Q等で１７MΩ/cmまで精製した超純水とする。
^*1標準準プラスミドDNA溶液
　内在性遺伝子及び組換え遺伝子を標的とした特異的プライマー対により増幅された増幅産物をプラスミド上に連結したもの（標準プラスミドDNA）を、ColE1/TE溶液（５ng/μL）で規定のコピー数となるように希釈した溶液。本分析法においては２０、１２５、１,５００、２０,０００、２５０,０００コピーの５段階希釈液に加え、標準プラスミドDNAの含まれていないColE1/TE溶液（５ng/μL）をブランク試料液（NTC：no template control）とした、計６点の検量線を作成する。なお、ColE1/TE溶液とは、大腸菌由来の配列確認のされているプラスミド（ColE1 プラスミド）をTE緩衝液で５ng/μLの濃度に調製した溶液である。
^*2内標比
　純粋な遺伝子組換え体の種子を対象に定量PCRを実施し、得られる組換え遺伝子のコピー数と内在性遺伝子（大豆の場合レクチン遺伝子）のコピー数との比を求めたもの。この内標比は各組換え作物系統に固有であり、常に一定の値を示すと考えられる。各プライマー対及びプローブを用いて測定を行った組換え作物系統ごとの内標比は別紙に規定する。なお、内標比は定量PCR法に使用する機種によって異なるため、混入率の算出時には必ず使用した機種につき規定されている内標比を用いること。また、使用する試薬によっても影響を受ける可能性が考えられるため、参考にも記載のある機種に適した試薬類を確認の上、使用すること。

3.1.2.1. ABI PRISM^TM 7700及びABI PRISM^TM 5700を用いた定量PCR
3.1.2.1.1. PCR用反応液の調製（ABI PRISM^TM 7700及びABI PRISM^TM 5700）
　PCR用反応液は２５μL/wellとして調製する。その組成は以下のとおりである。Universal PCR Master Mix^*1１２.５μL、対象プライマー対溶液（各プライマー、２５μmol/L）０.５μL、対象プローブ溶液（１０μmol/L）０.５μL、水９μL、２０ng/μL DNA試料液２.５μL（５０ng）又は検量線用標準プラスミドDNA溶液２.５μL、あるいは５ng/μL ColE1/TE溶液（ブランク試料液：NTC）２.５μL。試験は、１DNA試料液あたり３ウェル並行で行うものとし、PCR用反応液は３ウェル分を同時に調製する^*2。
　調製の実際は、反応液の調製及びPCRで生じる誤差を減少させるため、以下の手順に従って行う。まず、あらかじめUniversal PCR Master Mixに対象プライマー対、対象プローブを加えた溶液（マスターミックス）を調製する。この際、対象プライマー対と対象プローブの混合溶液^*3を先に調製しておき、これとUniversal PCR Master Mixを１：１.２５の比率で混合させると良い。マスターミックスの調製液量は余剰分を考慮し、１DNA試料液（３ウェル分）当たり８１μLが適当である。混合時にはボルテックスミキサーを用いて十分に攪拌し、攪拌後には軽く遠心する。次いで、マスターミックスを必要数^*4の微量遠沈管に７８.７５μLずつ分注する。分注後、各微量遠沈管に対応するDNA溶液を８.７５μL加え、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合した後、軽く遠心する。このようにして調製した混合溶液を２５μL/wellとして９６ウェルプレート上のウェルに分注する。分注操作終了後、真上からプレートの蓋^*5をする。このとき、片側にゆがみがたまらないよう両側のウェルから交互に閉める。次いで専用ローラーを用いて完全にウェルを密閉する。最後にウェルの底を観察し、底に気泡がある場合は、プレートの縁を軽く叩いて気泡を抜いておく。
^*1Universal PCR Master Mix
　本試薬は粘性が高いため、混合操作を行う際には、混合が確実に行われるように注意する。不十分な場合には、PCRがうまくいかない場合がある。使う直前には必ずボルテックスミキサーを用いて３秒程度混合した後、軽く遠心し、溶液を試料管の底に集めておいてから使用する。また、ウェルに分注する際は、以後撹拌、遠心が困難なことを考慮し、ウェルの底に確実に入れる。
^*2定量PCR用反応液の調製
　冷凍庫から出した試薬類は、必要なものにつき室温で融解後、氷上で保存する。氷上で保存した試薬につき、同一のチップを用い連続分注すると、ピペット内の空気が冷却されるため、２回目以降、通常のピペット操作では正確に分注されないので注意する。ピペットの説明書に書かれた、低温試料を扱う場合の操作法（通常、ふきとめと呼ばれる操作）を理解して使用すること。
^*3対象プライマー対と対象プローブの混合溶液
　対象プライマー対濃度が１.２５μmol/L、対象プローブ濃度が０.５μmol/Lとなるよう水で希釈し、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合し、調製する。また、本混合液は凍結保存が可能であるが、凍結融解を繰り返すことは避ける。
^*4分注必要数
　検量線用標準プラスミド溶液（５点）及びブランク試料液（１点）、この計６点にDNA試料液の数を加えた数。
^*5９６ウェルプレートおよびプレートの蓋
　MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate（Applied Biosystems社）及びMicroAmp Optical Caps、8caps/strips（Flat）（Applied Biosystems社）を使用する。

3.1.2.1.2.プレート情報の設定（ABI PRISM^TM 7700及びABI PRISM^TM 5700）
　反応に際しては、プレート情報の設定を行わなければならない。設定を行う項目は、検体の配置と種類及び、プローブ特性である。具体的には新規シート上で、調製したプレートの配置に対応するように気を付けながら、検体の種類あ（「STND」：検量線用標準プラスミドDNA溶液^*1、「NTC」：ブランク試料液、「UNKN」：DNA試料液）の設定を行う。この際、同一の溶液が分注された３ウェルをReplicateとして指定する^*2。またプローブ特性に関しては、「STND」、「NTC」、「UNKN」のそれぞれについてReporterが「FAM」、Referenceが「ROX」、Quencherが「TAMRA」となるよう設定する。
^*1検量線用標準プラスミドDNA溶液の設定
　検体の種類の設定に加えて、コピー数を設定する。同一の検量線用標準プラスミドDNA溶液を分注したウェルを選択した状態で、Quantity欄にコピー数を入力する。
^*2Replicate としての指定
　同一の溶液を分注したウェルに付けた名称（name欄に入力）と同一の名称を、replicate欄に入力する。

3.1.2.1.3.PCR（ABI PRISM^TM 7700及びABI PRISM^TM 5700）
　装置にプレートをセットし、装置の蓋の温度（Cover temperature）が１０５℃付近になったことを確認した後、反応とデータの取り込みを開始する。反応条件は以下のとおりである。５０℃、２分間の条件で保持した後、９５℃で１０分間加温し、ホットスタート法で反応を開始する。その後、９５℃ ３０秒、５９℃ １分を１サイクルとして、４０サイクルの増幅反応を行う。Remaining timeが０分となっていることを確認し、反応を終了させた後、測定結果の解析を行う。

3.1.2.1.4.検量線の作成（ABI PRISM^TM 7700及びABI PRISM^TM 5700）
　内在性遺伝子及び組換え遺伝子のそれぞれにつき以下の操作で検量線を作成する。サイクル数に対して蛍光シグナルの増加量（ΔRn）をプロットした増幅曲線（Amplification Plot）上で、検量線用標準プラスミドDNA溶液及びDNA試料液由来の蛍光シグナルが指数関数的に増幅しているΔRn部を選択し、Threshold line（Th）を引く。この際、ブランク試料液（NTC）で出現することのある非特異的増幅曲線と交差しないように注意する。また、Base Line はStartを３に、Endを１５に設定する。Thの厳密な引き方は、独立行政法人農林水産消費技術センター作成のJAS分析試験ハンドブック「遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル 定量的PCR編」に記載されている方法を準用する。Thと、検量線用標準プラスミドDNA溶液の蛍光シグナルが交差した点をThreshold cycle（Ct）値とする。次に各々の検量線用標準プラスミドDNA溶液のコピー数の対数値（x軸）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似直線を検量線とする^＊。
^＊実際はThを引いた後、「Amplification Plot」ウインドウ上にある、「Update Calculations」ボタンを押すことで、検量線は自動作成される。この検量線は「Analysis」タブから「Standard Curve」を選択することで表示させる。検量線においては「Corr.」の値を確認し、０.９９０以上であった場合に以降のコピー数の算出を行う。

3.1.2.2. ABI PRISM^TM 7900HT 96well及び384wellを用いた定量PCR
3.1.2.2.1. PCR用反応液の調製（ABI PRISM^TM 7900HT 96well）
　PCR用反応液は２５μL/wellとして調製する。その組成は以下のとおりである。Universal PCR Master Mix^*1１２.５μL、対象プライマー対溶液（各プライマー, ２５μmol/L）０.５μL、対象プローブ溶液（１０μmol/L）０.５μL、水９μL、２０ng/μL DNA試料液２.５μL（５０ng）又は検量線用標準プラスミドDNA溶液２.５μL、あるいは５ng/μL ColE1/TE溶液（ブランク試料液：NTC）２.５μL。試験は、１DNA試料液当たり３ウェル並行で行うものとし、PCR用反応液は３ウェル分を同時に調製する^*2。
　調製の実際は、反応液の調製及びPCRで生じる誤差を減少させるため、以下の手順に従って行う。まず、あらかじめUniversal PCR Master Mixに対象プライマー対、対象プローブを加えた溶液（マスターミックス）を調製する。この際、対象プライマー対と対象プローブの混合溶液^*3を先に調製しておき、これとUniversal PCR Master Mixを１：１.２５の比率で混合させると良い。マスターミックスの調製液量は余剰分を考慮し、1 DNA試料液（３ウェル分）当たり８１μLが適当である。混合時にはボルテックスミキサーを用いて十分に攪拌し、攪拌後には軽く遠心する。次いで、マスターミックスを必要数^*4の微量遠沈管に７８.７５μLずつ分注する。分注後、各微量遠沈管に対応するDNA溶液を８.７５μL加え、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合した後、軽く遠心する。このようにして調製した混合溶液を２５μL/wellとして９６ウェルプレート上のウェルに分注する。分注操作終了後、真上からシールし、完全にウェルを密閉する。このとき、しわが寄らないよう注意し、専用のシーリング用アプリケーターを用いて行う^*5。最後にウェルの底を観察し、底に気泡がある場合は、プレートの縁を軽く叩いて気泡を抜いておく。プレートの確認後、ABI PRISM Optical Cover Compression Pad^*6を茶色の面が上になるよう、プレートの上面にセットする。
^*1Universal PCR Master Mix
　本試薬は粘性が高いため、混合操作を行う際には、混合が確実に行われるように注意を要する。不十分な場合には、PCRがうまくいかない場合がある。使う直前には必ずボルテックスミキサーを用いて３秒程度混合した後、軽く遠心し、溶液を試料管の底に集めておいてから使用する。また、ウェルに分注する際は、以後撹拌、遠心が困難なことを考慮し、ウェルの底に確実に入れる。
^*2定量PCR用反応液の調製
　冷凍庫から出した試薬類は、必要なものにつき室温で融解後、氷上で保存する。氷上で保存した試薬につき、同一のチップを用い連続分注すると、ピペット内の空気が冷却されるため、２回目以降、通常のピペット操作では正確に分注されないので注意する。ピペットの説明書に書かれた、低温試料を扱う場合の操作法（通常、ふきとめと呼ばれる操作）を理解して使用すること。
^*3対象プライマー対と対象プローブの混合溶液
　対象プライマー対濃度が１.２５μmol/L、対象プローブ濃度が０.５μmol/Lとなるよう水で希釈し、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合し、調製する。また、本混合液は凍結保存が可能であるが、凍結融解を繰り返すことは避ける。
^*4分注必要数
　検量線用標準プラスミド溶液（５点）及びブランク試料液（１点）、この計６点にDNA試料液の数を加えた数。
^*5９６ウェルプレート、シール及びシーリングアプリケーター
　MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate（Applied Biosystems社）及びABI PRISM Optical Adhesive Cover（Applied Biosystems社）を使用する。シーリングの詳細については製品付属のマニュアルを参考のこと。
^*6ABI PRISM Optical Cover Compression Pad
　ABI PRISM Optical Cover Compression Pad（Applied Biosystems社）を使用する。なお、２０回以上の繰り返し使用は、定量結果に影響を及ぼす可能性があるため、避けること。

3.1.2.2.2.PCR用反応液の調製（ABI PRISM^TM 7900HT 384well）
　PCR用反応液は２０μL/wellとして調製する。その組成は以下のとおりである。Universal PCR Master Mix^*1１０μL、対象プライマー対溶液（各プライマー, ２５μmol/L）０.４μL、対象プローブ溶液（１０μmol/L）０.４μL、水７.２μL、２０ng/μL DNA試料液２μL（５０ng）、又は検量線用標準プラスミドDNA溶液２μL^*2、あるいは５ng/μL ColE1/TE溶液（ブランク試料液：NTC）２μL。試験は、１DNA試料液当たり３ウェル並行で行うものとし、PCR用反応液は３ウェル分を同時に調製する^*3。
　調製の実際は、反応液の調製及びPCRで生じる誤差を減少させるため、以下の手順に従って行う。まず、あらかじめUniversal PCR Master Mixに対象プライマー対、対象プローブを加えた溶液（マスターミックス）を調製する。この際、対象プライマー対と対象プローブの混合溶液^*4を先に調製しておき、これとUniversal PCR Master Mixを１：１.２５の比率で混合させると良い。マスターミックスの調製液量は余剰分を考慮し、１DNA試料液（３ウェル分）当たり６６μLが適当である。混合時にはボルテックスミキサーを用いて十分に攪拌し、攪拌後には軽く遠心する。次いで、マスターミックスを必要数^*5の微量遠沈管に６３μLずつ分注する。分注後、各微量遠沈管に対応するDNA溶液を７μL加え、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合した後、軽く遠心する。このようにして調製した混合溶液を２０μL/wellとして３８４ウェルプレート上のウェルに分注する。分注操作終了後、真上からシールし、完全にウェルを密閉する。この時、しわが寄らないよう注意し、専用のシーリング用アプリケーターを用いて行う^*6。最後にウェルの底を観察し、底に気泡がある場合は、プレートの縁を軽く叩いて気泡を抜いておく。
^*1Universal PCR Master Mix
　本試薬は粘性が高いため、混合操作を行う際には、混合が確実に行われるように注意を要する。不十分な場合には、PCRがうまくいかない場合がある。使う直前には必ずボルテックスミキサーを用いて３秒程度混合した後、軽く遠心し、溶液を試料管の底に集めておいてから使用する。また、ウェルに分注するときは、以後撹拌、遠心が困難なことを考慮し、ウェルの底に確実に入れる。
^*2検量線用標準プラスミドDNA溶液
　ABI PRISM^TM 7900HT 384well を用いた試験においては、反応液に添加する検量線用標準プラスミドDNA溶液の液量を２μとしている。このため、対応するコピー数は、１６、１００、１,２００、１６,０００、２００,０００となる。コピー数の設定を誤ると、正確な測定が行えないため、注意する。
^*3定量PCR用反応液の調製
　冷凍庫から出した試薬類は、必要なものにつき室温で融解後、氷上で保存する。氷上で保存した試薬につき、同一のチップを用い連続分注すると、ピペット内の空気が冷却されるため、２回目以降、通常のピペット操作では正確に分注されないので注意する。ピペットの説明書に書かれた、低温試料を扱う場合の操作法（通常、ふきとめと呼ばれる操作）を理解して使用すること。
^*4対象プライマー対と対象プローブの混合溶液
　対象プライマー対濃度が１.２５μmol/L、対象プローブ濃度が０.５μmol/Lとなるよう水で希釈し、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合し、調製する。また、本混合液は凍結保存が可能であるが、凍結融解を繰り返すことは避ける。
^*5分注必要数
　検量線用標準プラスミド溶液（５点）及びブランク試料液（１点）、この計６点にDNA試料液の数を加えた数。
^*6３８４ウェルプレート、シール及びシーリングアプリケーター
　ABI PRISM384-Well Clear Optical Reaction Plate with Barcode（Applied Biosystems社）及びABI PRISM Optical Adhesive Cover（Applied Biosystems社）を使用する。シーリングの詳細については製品付属のマニュアルを参考のこと。

3.1.2.2.3.プレート情報の設定（ABI PRISM^TM 7900HT 96well及び384wel）
　反応に際しては、プレート情報の設定を行わなければならない。設定を行う項目は、検体の配置と種類及び、プローブ特性である。まず、プローブ特性の設定を行う。プローブ特性はDetector Manager画面上でReporterが「FAM」、Quencherが「TAMRA」となるよう設定する^*1。設定したDetectorをSet upタブに登録した後、同じプライマーとプローブのセットを用いて測定を行うウェルすべてを指定する。次に検体の配置と種類を指定する。具体的には、調製したプレートの配置に対応するように気を付けながら、検体の種類（「Standard」：検量線用標準プラスミドDNA溶液^*2、「NTC」：ブランク試料液、「Unknown」：DNA試料液）をTask欄において指定する。この際、同一の溶液が分注された３ウェルを選択した状態で、名称を入力しておく。またPassive Referenceを「ROX」と設定する。
^*1Detector の設定
　Detectorは各プライマー、プローブのセットに対して設定しておくと良い。
^*2検量線用標準プラスミドDNA溶液の設定
　検体の種類の設定に加えて、コピー数を設定する。同一の検量線用標準プラスミドDNA溶液を分注したウェルを選択した状態で、Quantity欄にコピー数を入力する（3.1.2.2.2. 項に記載したように、９６ウェルを使用する場合と、３８４ウェルを使用する場合では、液量の違いから、コピー数が異なるため注意する。）。

3.1.2.2.4.PCR（ABI PRISM^TM 7900HT 96well及び384well）
　装置にプレートをセットし、反応とデータの取り込みを開始する。反応条件は以下のとおりである。５０℃、２分間の条件で保持した後、９５℃で１０分間加温し、ホットスタート法で反応を開始する。その後、９５℃ ３０秒、５９℃ １分を１サイクルとして、４５サイクルの増幅反応を行う。なお、反応条件の設定において、９,６００ emulationモードのチェックを入れておく。また、９６ウェルと３８４ウェルでは反応液量が異なることから、それぞれにあった液量での設定を行う。Remaining timeが０分となっていることを確認し、反応を終了させた後、測定結果の解析を行う。

3.1.2.2.5.検量線の作成（ABI PRISM^TM 7900HT 96well及び384well）
　内在性遺伝子及び組換え遺伝子のそれぞれにつき以下の操作で検量線を作成する。サイクル数に対して蛍光シグナルの増加量（ΔRn）をプロットした増幅曲線（Amplification Plot）上で、検量線用標準プラスミドDNA溶液及びDNA試料液由来の蛍光シグナルが指数関数的に増幅しているΔRn部を選択し、Threshold line（Th）を引く。この際、ブランク試料液（NTC）で出現することのある非特異的増幅曲線と交差しないように注意する。また、Base LineはStartを３に、Endを１５に設定する。Thの厳密な引き方は、独立行政法人農林水産消費技術センター作成のJAS分析試験ハンドブック「遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル 定量的PCR編」に記載されている方法を準用する。Thと、検量線用標準プラスミドDNA溶液の蛍光シグナルが交差した点をThreshold cycle（Ct）値とする。次に各々の検量線用標準プラスミドDNA溶液のコピー数の対数値（x軸）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似直線を検量線とする^*。
^*実際はThを引いた時点で検量線は自動作成される。検量線においては「Corr.」の値を確認し、０.９９０以上であった場合に以降のコピー数の算出を行う。

3.1.2.3.ABI PRISM^TM 7000を用いた定量PCR
3.1.2.3.1.PCR用反応液の調製（ABI PRISM^TM 7000）
　PCR用反応液は２５μL/wellとして調製する。その組成は以下のとおりである。Universal PCR Master Mix^*1１２.５μL、対象プライマー対溶液（各プライマー, ２５μmol/L）０.５μL、対象プローブ溶液（１０μmol/L）０.５μL、水９μL、２０ng/μL DNA試料液２.５μL（５０ng）、又は検量線用標準プラスミドDNA溶液２.５μL、あるいは５ng/μL ColE1/TE溶液（ブランク試料液：NTC）２.５μL。試験は１DNA試料液当たり３ウェル並行で行うものとし、PCR用反応液は３ウェル分を同時に調製する^*2。
　調製の実際は、反応液の調製及びPCRで生じる誤差を減少させるため、以下の手順に従って行う。まず、あらかじめUniversal PCR Master Mixに対象プライマー対、対象プローブを加えた溶液（マスターミックス）を調製する。この際、対象プライマー対と対象プローブの混合溶液^*3を先に調製しておき、これとUniversal PCR Master Mixを１：１.２５の比率で混合させると良い。マスターミックスの調製液量は余剰分を考慮し、１DNA試料液（３ウェル分）当たり８１μLが適当である。混合時にはボルテックスミキサーを用いて十分に攪拌し、攪拌後には軽く遠心する。次いで、マスターミックスを必要数^*4の微量遠沈管に７８.７５μLずつ分注する。分注後、各微量遠沈管に対応するDNA溶液を８.７５μL加え、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合した後、軽く遠心する。このようにして調製した混合溶液を２５μL/wellとして９６ウェルプレート上のウェルに分注する。分注操作終了後、真上からシールし、完全にウェルを密閉する。このとき、しわが寄らないよう注意し、専用のシーリング用アプリケーターを用いて行う^*5。最後にウェルの底を観察し、底に気泡がある場合は、プレートの縁を軽く叩いて気泡を抜いておく。プレートの確認後、ABI PRISM Optical Cover Compression Pad^*6を茶色の面が上になるよう、プレートの上面にセットする。
^*1Universal PCR Master Mix
　本試薬は粘性が高いため、混合操作を行う際には、混合が確実に行われるように注意を要する。不十分な場合には、PCRがうまくいかない場合がある。使う直前には必ずボルテックスミキサーを用いて３秒程度混合した後、軽く遠心し、溶液を試料管の底に集めておいてから使用する。また、ウェルに分注するときは、以後撹拌、遠心が困難なことを考慮し、ウェルの底に確実に入れる。
^*2定量PCR用反応液の調製
　冷凍庫から出した試薬類は、必要なものにつき室温で融解後、氷上で保存する。氷上で保存した試薬につき、同一のチップを用い連続分注すると、ピペット内の空気が冷却されるため、２回目以降、通常のピペット操作では正確に分注されないので注意する。ピペットの説明書に書かれた、低温試料を扱う場合の操作法（通常、ふきとめと呼ばれる操作）を理解して使用すること。
^*3対象プライマー対と対象プローブの混合溶液
　対象プライマー対濃度が１.２５μmol/L、対象プローブ濃度が０.５μmol/Lとなるよう水で希釈し、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合し、調製する。また、本混合液は凍結保存が可能であるが、凍結融解を繰り返すことは避ける。
^*4分注必要数
　検量線用標準プラスミド溶液（５点）及びブランク試料液（１点）、この計６点にDNA試料液の数を加えた数。
^*5９６ウェルプレート、シール及びシーリングアプリケーター
　MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate（Applied Biosystems社）及びABI PRISM Optical Adhesive Cover（Applied Biosystems社）を使用する。シーリングの詳細については製品付属のマニュアルを参考のこと。
^*6ABI PRISM Optical Cover Compression Pad
　ABI PRISM Optical Cover Compression Pad（Applied Biosystems社）を使用する。なお、２０回以上の繰り返し使用は、定量結果に影響を及ぼす可能性があるため、避けること。

3.1.2.3.2. プレート情報の設定（ABI PRISM^TM 7000）
　反応に際しては、プレート情報の設定を行わなければならない。設定を行う項目は、検体の配置と種類及び、プローブ特性である。まず、プローブ特性の設定を行う。プローブ特性はDetector Manager画面上でReporterが「FAM」、Quencherが「TAMRA」となるよう設定する^*1。設定したDetectorをWell Inspectorに登録した後、同じプライマーとプローブのセットを用いて測定を行うウェルすべてを指定する。次に検体の配置と種類を指定する。具体的には、調製したプレートの配置に対応するように気を付けながら、検体の種類（「Standard」：検量線用標準プラスミドDNA溶液^*2、「NTC」：ブランク試料液、「Unknown」：DNA試料液）をTask欄において指定する。この際、同一の溶液が分注された３ウェルを選択した状態で、名称を入力しておく。またPassive Referenceを「ROX」と設定する。
^*1Detector の設定
　Detectorは各プライマー、プローブのセットに対して設定しておくと良い。
^*2検量線用標準プラスミドDNA溶液の設定
　検体の種類の設定に加えて、コピー数を設定する。同一の検量線用標準プラスミドDNA溶液を分注したウェルを選択した状態で、Quantity欄にコピー数を入力する。

3.1.2.3.3. PCR（ABI PRISM^TM 7000）
　装置にプレートをセットし、反応とデータの取り込みを開始する。反応条件は以下のとおりである。５０℃、２分間の条件で保持した後、９５℃で１０分間加温し、ホットスタート法で反応を開始する。その後、９５℃ ３０秒、５９℃ １分を１サイクルとして、４５サイクルの増幅反応を行う。なお、反応条件の設定において、９,６００ emulationモードのチェックを入れておく。Remaining timeが０分となっていることを確認し、反応を終了させた後、測定結果の解析を行う。

3.1.2.3.4. 検量線の作成（ABI PRISM^TM 7000）
　内在性遺伝子及び組換え遺伝子のそれぞれにつき以下の操作で検量線を作成する。サイクル数に対して蛍光シグナルの増加量（ΔRn）をプロットした増幅曲線（Amplification Plot）上で、検量線用標準プラスミドDNA溶液及びDNA試料液由来の蛍光シグナルが指数関数的に増幅しているΔRn部を選択し、Threshold line（Th）を引く。この際、ブランク試料液（NTC）で出現することのある非特異的増幅曲線と交差しないように注意する。また、Base LineはStartを３に、Endを１５に設定する。Thの厳密な引き方は、独立行政法人農林水産消費技術センター作成のJAS分析試験ハンドブック「遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル 定量的PCR編」に記載されている方法を準用する。Thと、検量線用標準プラスミドDNA溶液の蛍光シグナルが交差した点をThreshold cycle（Ct）値とする。次に各々の検量線用標準プラスミドDNA溶液のコピー数の対数値（x軸）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似直線を検量線とする^*。
^*実際はThを引き、「Analyze」ボタンを押した時点で検量線は自動作成される。検量線においては「Corr.」の値を確認し、０.９９０以上であった場合に以降のコピー数の算出を行う。

3.1.2.4. Applied Biosystems 7500 Systemを用いた定量PCR
3.1.2.4.1. PCR用反応液の調製（Applied Biosystems 7500 System）
　PCR用反応液は２５μL/wellとして調製する。その組成は以下のとおりである。Universal PCR Master Mix^＊1 １２.５μL、対象プライマー対溶液（各プライマー, ２５μmol/L）０.５μL、対象プローブ溶液（１０μmol/L）０.５μL、水９μL、２０ng/μL DNA試料液２.５μL（５０ng）、又は検量線用標準プラスミドDNA溶液２.５μL、あるいは５ng/μL ColE1/TE溶液（ブランク試料液：NTC）２.５μL。試験は１DNA試料液当たり３ウェル並行で行うものとし、PCR用反応液は３ウェル分を同時に調製する^＊2。
　調製の実際は、反応液の調製及びPCRで生じる誤差を減少させるため、以下の手順に従って行う。まず、あらかじめUniversal PCR Master Mixに対象プライマー対、対象プローブを加えた溶液（マスターミックス）を調製する。この際、対象プライマー対と対象プローブの混合溶液^＊3を先に調製しておき、これとUniversal PCR Master Mixを１：１.２５の比率で混合させると良い。マスターミックスの調製液量は余剰分を考慮し、１DNA試料液（３ウェル分）当たり８１μLが適当である。混合時にはボルテックスミキサーを用いて十分に攪拌し、攪拌後には軽く遠心する。次いで、マスターミックスを必要数^＊4の微量遠沈管に７８.７５μLずつ分注する。分注後、各微量遠沈管に対応するDNA溶液を８.７５μL加え、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合した後、軽く遠心する。このようにして調製した混合溶液を２５μL/wellとして９６ウェルプレート上のウェルに分注する。分注操作終了後、真上からシールし、完全にウェルを密閉する。このとき、しわが寄らないよう注意し、専用のシーリング用アプリケーターを用いて行う^＊5。最後にウェルの底を観察し、底に気泡がある場合は、プレートの縁を軽く叩いて気泡を抜いておく。
^＊1 Universal PCR Master Mix
　本試薬は粘性が高いため、混合操作を行う際には、混合が確実に行われるように注意を要する。不十分な場合には、PCRがうまくいかない場合がある。使う直前には必ずボルテックスミキサーを用いて３秒程度混合した後、軽く遠心し、溶液を試料管の底に集めておいてから使用する。また、ウェルに分注するときは、以後撹拌、遠心が困難なことを考慮し、ウェルの底に確実に入れる。
^＊2 定量PCR用反応液の調製
　冷凍庫から出した試薬類は、必要なものにつき室温で融解後、氷上で保存する。氷上で保存した試薬につき、同一のチップを用い連続分注すると、ピペット内の空気が冷却されるため、２回目以降、通常のピペット操作では正確に分注されないので注意する。ピペットの説明書に書かれた、低温試料を扱う場合の操作法（通常、ふきとめと呼ばれる操作）を理解して使用すること。
^＊3 対象プライマー対と対象プローブの混合溶液
　対象プライマー対濃度が１.２５μmol/L、対象プローブ濃度が０.５μmol/Lとなるよう水で希釈し、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合し、調製する。また、本混合液は凍結保存が可能であるが、凍結融解を繰り返すことは避ける。
^＊4 分注必要数
　検量線用標準プラスミド溶液（５点）及びブランク試料液（１点）、この計６点にDNA試料液の数を加えた数。
^＊5 ９６ウェルプレート、シール及びシーリングアプリケーター
　MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate（Applied Biosystems社）及びABI PRISM Optical Adhesive Cover（Applied Biosystems社）を使用する。シーリングの詳細については製品付属のマニュアルを参考のこと。

3.1.2.4.2. プレート情報の設定（Applied Biosystems 7500 System）
　反応に際しては、プレート情報の設定を行わなければならない。設定を行う項目は、検体の配置と種類及び、プローブ特性である。まず、プローブ特性の設定を行う。プローブ特性はDetector Manager画面上でReporterが「FAM」、Quencherが「TAMRA」となるよう設定する^＊1。設定したDetectorをWell Inspectorに登録した後、同じプライマーとプローブのセットを用いて測定を行うウェルすべてを指定する。次に検体の配置と種類を指定する。具体的には、調製したプレートの配置に対応するように気を付けながら、検体の種類（「Standard」：検量線用標準プラスミドDNA溶液^＊2、「NTC」：ブランク試料液、「Unknown」：DNA試料液）をTask欄において指定する。この際、同一の溶液が分注された３ウェルを選択した状態で、名称を入力しておく。またPassive Referenceを「ROX」と設定する。
^＊1 Detector の設定
　Detectorは各プライマー、プローブのセットに対して設定しておくと良い。
^＊2 検量線用標準プラスミドDNA溶液の設定
　検体の種類の設定に加えて、コピー数を設定する。同一の検量線用標準プラスミドDNA溶液を分注したウェルを選択した状態で、Quantity欄にコピー数を入力する。

3.1.2.4.3. PCR（Applied Biosystems 7500 System）
　装置にプレートをセットし、反応とデータの取り込みを開始する。反応条件は以下のとおりである。５０℃、２分間の条件で保持した後、９５℃で１０分間加温し、ホットスタート法で反応を開始する。その後、９５℃ ３０秒、５９℃ １分を１サイクルとして、４５サイクルの増幅反応を行う。なお、反応条件の設定において、RUN Modeを９,６００ emulationに設定する。RUNの終了を知らせる「The run completed successfully 」の表示を確認し、反応を終了させた後、測定結果の解析を行う。

3.1.2.4.4. 検量線の作成（Applied Biosystems 7500 System）
　内在性遺伝子及び組換え遺伝子のそれぞれにつき以下の操作で検量線を作成する。サイクル数に対して蛍光シグナルの増加量（ΔRn）をプロットした増幅曲線（Amplification Plot）上で、検量線用標準プラスミドDNA溶液及びDNA試料液由来の蛍光シグナルが指数関数的に増幅しているΔRn部を選択し、Threshold line（Th）を引く。この際、ブランク試料液（NTC）で出現することのある非特異的増幅曲線と交差しないように注意する。また、Base LineはStartを３に、Endを１５に設定する。Thの厳密な引き方は、独立行政法人農林水産消費技術センター作成のJAS分析試験ハンドブック「遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル 定量的PCR編」に記載されている方法を準用する。Thと、検量線用標準プラスミドDNA溶液の蛍光シグナルが交差した点をThreshold cycle（Ct）値とする。次に各々の検量線用標準プラスミドDNA溶液のコピー数の対数値（x軸）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似直線を検量線とする^*。
^＊　実際はThを引き、「Analyze」ボタンを押した時点で検量線は自動作成される。検量線においては「Corr.」の値を確認し、０.９９０以上であった場合に以降のコピー数の算出を行う。

3.1.2.５. Roche LightCycler Systemを用いた定量PCR
3.1.2.５.1. PCR用反応液の調製（Roche LightCycler System）
　PCR用反応液は２０μL/キャピラリーとして調製する。その組成は以下のとおりである。LC- FastStart DNA Master Hybridization Probes^*1２μL、対象プライマー対溶液（各プライマー，２５μmol/L）０.４μL、対象プローブ（１０μmol/L）０.４μL、水９.８μL、MgCl2 溶液（２５mM）２.４μL、１０ng/μL DNA試料液５μL（５０ng）、又は検量線用標準プラスミドDNA溶液５μL^*2、あるいは５ng/μL ColE1/TE溶液（ブランク試料液：NTC）５μL。試験は、検量線用標準プラスミドDNA溶液、及びNTCに対し１キャピラリー、１DNA試料液に対し２キャピラリー並行で行うものとし、DNA試料液に対するPCR用反応液は２キャピラリー分を同時に調製する^*3。
　調製の実際は、反応液の調製及びPCRで生じる誤差を減少させるため、以下の手順に従って行う。まず、あらかじめLC-FastStart DNA Master Hybridization ProbesにMgCl2 溶液、水並びに対象プライマー対、対象プローブを加えた溶液（マスターミックス）を調製する。この際、対象プライマー対と対象プローブの混合溶液^*4を先に調製しておき、これとLC-FastStart DNA Master Hybridization Probes、MgCl₂ 溶液、水の混合液を８：７の比率で混合させると良い。マスターミックスの調製液量は余剰分を考慮し、１キャピラリー当たり１９.８μLが適当である。混合時にはボルテックスミキサーを用いて十分に攪拌し、攪拌後には軽く遠心する。次いで、マスターミックスを必要数^*5の微量遠沈管に分注する。分注の液量は検量線用標準プラスミド溶液及びNTCに対し１８μL、DNA試料液に対し３６μLとする。分注後、各微量遠沈管に対応するDNA溶液を６μL （検量線用標準プラスミド溶液及びNTC）あるいは１２μL（DNA試料液）加え、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合した後、軽く遠心する。このようにして調製した混合溶液を２０μL/キャピラリーとして分注する。分注操作終了後、真上から蓋をし、完全にキャピラリーを密閉する。最後に遠心操作^*6を行い、混合液をキャピラリーにしっかり充填する。
^*1LC-FastStart DNA Master Hybridization Probes
　LC-FastStart Enzyme（1a red cap）とLC-FastStart Reaction Mix Hybridization Probes（1b colorless cap）とを混合し、調製する。調製したLC-FastStart DNA Master Hybridization Probesは、４℃で一週間の保存が可能である。また、本試薬は粘性が高いため、混合操作を行う際には、混合が確実に行われるように注意を要する。不十分な場合には、PCRがうまくいかない場合がある。
^*2検量線用標準プラスミドDNA溶液
　Roche LightCycler Systemを用いた試験においては、反応液に添加する検量線標準プラスミドDNA溶液の液量を５μLとしている。このため、対応するコピー数は、４０、２５０、３,０００、４０,０００、５００,０００となる。コピー数の設定を誤ると、正確な測定が行えないため、注意する。
^*3定量PCR用反応液の調製
　冷凍庫から出した試薬類は、必要なものにつき室温で融解後、氷上で保存する。氷上で保存した試薬につき、同一のチップを用い連続分注すると、ピペット内の空気が冷却されるため、２回目以降、通常のピペット操作では正確に分注されないので注意する。ピペットの説明書に書かれた、低温試料を扱う場合の操作法（通常、ふきとめと呼ばれる操作）を理解して使用すること。
　また、Roche LightCycler Systemを用いた定量PCRにおいては、試験を検量線用標準プラスミドDNA溶液、及びNTCに対し１キャピラリー、１DNA試料液当たり２キャピラリー並行で行う。装置にかけられるキャピラリーの総数、及び１度の反応につき内在性遺伝子並びに組換え遺伝子の両方を測定することから、１回の測定当たり測定可能なDNA試料液の最大数は５となる。
^*4対象プライマー対と対象プローブの混合溶液
　対象プライマー対濃度が１.２５μmol/L、対象プローブ濃度が０.５μmol/Lとなるよう水で希釈し、ボルテックスミキサーを用いて十分に混合し、調製する。また、本混合液は凍結保存が可能であるが、凍結融解を繰り返すことは避ける。
^*5分注必要数
　検量線用標準プラスミド溶液（５点）及びブランク試料液（１点）、この計６点にDNA試料液の数を加えた数。
^*6遠心操作
　遠心操作は、キャピラリーの破損を避けるため、専用のカローセル遠心機を使用し行うか、あるいは汎用の遠心機を使用する場合には７００×g以下、フラッシュの条件で行う。なお、遠心操作の如何に関わらず、装置本体にセットする前にはキャピラリーをカローセルに装填する。この際も、キャピラリーの破損に十分注意しつつ、しっかりとセットすること。

3.1.2.５.2. キャピラリー情報の設定（Roche LightCycler System）
　反応に際しては、キャピラリー情報の設定を行わなければならない。具体的にはサンプルリスト作成画面上で、調製したキャピラリーの配置(カローセル上の配置)に対応するように気を付けながら、検体の種類（「Standard」：検量線用標準プラスミドDNA溶液^*1、「Negative」：ブランク試料液、「Unknown」：DNA試料液）をType欄において指定する。この際、同一の溶液が分注された２キャピラリーについてはReplicateであることを指定する^*2。また、Seek Temperatureを３０℃と設定し、Maximum Positionにはカローセルに装填したキャピラリーの最大位置番号を入力する。
^*1検量線用標準プラスミドDNA溶液の設定
　検体の種類の設定に加えて、コピー数を設定する。各検量線用標準プラスミドDNA溶液を分注したキャピラリーに対し、Concentration欄にコピー数を入力する。
^*2Replicateの指定
　例えば、キャピラリー位置番号の７と８に同一の溶液を分注した場合、まず番号７に関する情報を設定し、その後、番号８は番号７のReplicateであることを指示する。具体的には番号８のReplicate欄において「７」を入力することで指示を行う。

3.1.2.５.3. PCR（Roche LightCycler System）
　装置にカローセルをセットし、反応とデータの取り込みを開始する。反応条件は以下のとおりである。９５℃、１０分間の条件で加温したホットスタート法により反応を開始した後、９５℃ １５秒、５９℃ ３０秒（１℃/秒）^*1を１サイクルとして、５０サイクルの増幅反応を行う。増幅反応終了後、４０℃ ３０秒の条件で保つ。データの取り込みは、増幅反応の各サイクル終了時に行わせるよう設定する^*2。
^*1加温、冷却速度
　ここに示している以外、加温、冷却の速度は２０℃/秒とする。
^*2データの取り込み設定
　データの取り込み設定の実際は、サイクルプログラムデータ画面において、５９℃ ３０秒と設定したカラムについて「Acquisition Mode」を「Single」と設定する。

3.1.2.５.4. 検量線の作成（Roche LightCycler System）
　反応が終了していることを確認した後に、解析を行う。解析は「Fit Point法」を用いて行う。内在性遺伝子及び組換え遺伝子のそれぞれにつき以下の操作で検量線を作成する。Base Lineは Proportionalとし、Number of Pointsは２とする。解析する検体のみを選択した状態にし、Noise Bandを０.１に設定する。上記条件にて検量線を作成させ、Error値^＊が０.２以下であった場合には、その際に得られた数値を解析値とする。
^＊検量線のError値が０.２以上になる場合には以下の検討を行う。Crossing Lineの調整幅（Crossing Lineを移動させる範囲）を０.１から０.２の間とし、手動でCrossing Lineを移動させる。移動させながら検量線のError値が最小となるようなCrossing Lineを設定し、その時点で得られる数値を解析値とする。上記解析を行ってなお検量線のError値が０.２以上になる場合には、検量線から大きく外れている検量線用標準DNA溶液１点を解析対象から外し、同様の解析を行う。以上の解析を行ってもError値が０.２以上になる場合にはその解析条件下での最小Error値を示した時点の数値を解析値とする。

3.1.3. 試料の組換えDNA技術応用食品含有率の計算
　未知DNA試料液につき検量線作成で用いたThを使用してCt値を求め、内標遺伝子及び組換え遺伝子につき、それぞれの検量線から各３ウェル^＊とも内在性遺伝子のコピー数を内挿し、それにより得られる値の平均を内在性遺伝子のコピー数及び組換え遺伝子のコピー数とする。次に次式に従って、対象組換えDNA技術応用食品含有率を求める。

対象組換えDNA技術応用食品含有率（％）=
	［組換え遺伝子のコピー数/（内在性遺伝子のコピー数×内標比）］×１００

　大豆の場合、現在のところ市場に流通している遺伝子組換え大豆はRoundup Ready Soybeanのみであり、Le-1とRRS遺伝子のコピー数から算出された値は、遺伝子組換え大豆の含有率を示している。
^＊Roche LightCycler System を用いた場合には、１DNA試料液当たり各３ウェルではなく、２キャピラリーで実施するので、3.1.2.4.3.記載の解析の結果得られた２キャピラリー分のデータの平均値を内在性遺伝子のコピー数及び組換え遺伝子のコピー数とする。

3.1.4. 結果の判定
　３試料につき各１回の抽出を行い、ELISA法又は定量PCR法により得られた値の平均が５％を越えた試料については、不適切な分別生産流通管理が行われていた可能性がある。


3.2.トウモロコシ
　トウモロコシでは、異なった発現タンパク質をもつ組換え系統が存在する上、同一の発現タンパク質が発現する組換え系統であっても、組換え系統毎にタンパク質の発現量が異なるため、多種の遺伝子組換えトウモロコシが混入している穀粒では、遺伝子組換えトウモロコシの含有率を求める目的でELISA法を用いることはできない。したがって、定量PCR法でのみ分析が可能である。

3.2.1.定量PCR法
　上述のように、トウモロコシでは分析対象が複数系統存在するため、まず一次スクリーニングを実施し、得られた結果に基づき、さらに系統毎の分別定量を行い、組換え系統毎の定量値を合計して、結果の判定を行う。なお、トウモロコシの場合、トウモロコシに普遍的に存在する内在性遺伝子として、スターチシンターゼIIb（SSIIb）遺伝子を用い、同遺伝子を標的とするプライマー対SSIIb-3とプローブSSIIb-Taqを使用して得られた同遺伝子のコピー数と、分析対象となる組換え遺伝子を標的とするプライマー対とプローブを使用して得られた対象遺伝子のコピー数を大豆の場合と同様に算出し、3.1.3.で示した式に基づき対象遺伝子組換えトウモロコシの含有率を求める。

3.2.1.1.スクリーニング
3.2.1.1.1.Cauliflower mosaic virus由来の35S promoterが組み込まれた組換え系統の定量
　組換えトウモロコシ系統Event176、Bt11、T25及びMon810には、共通してCauliflower mosaic virus由来の35S promoter（CaM）配列が組み込まれているため、同配列含量を指標として、これらの系統の混合物については、大まかな含量を推定することが可能である。分析方法は、用いるプライマー対、プローブを除き大豆の定量PCR法で示された方法と同一である。内在性遺伝子として、スターチシンターゼIIb（SSIIb）遺伝子を用い、同遺伝子を標的とするプライマー対SSIIb-3とプローブSSIIb-Taqを使用する。対象遺伝子のプライマー対とプローブはP35S-1とP35S-Taq^＊であり、別紙に規定された内標比を用いて、最終的にCaM配列が組み込まれた遺伝子組換えトウモロコシの含有率を算出する。
^＊P35S-1とP35S-Taqを用いた際の内標比はMon810を対象として算出されたものを用いる。同系統は米国で最も作付け面積が広い組換え系統であること、組換え遺伝子中に35S promoterが１コピーしか存在しないことから、遺伝子組換えトウモロコシの含有率を過小評価する可能性が低い。なお、P35S-Taqは、他のプローブの半分の濃度（終濃度：０.１μmol/L）で使用するため、反応液の調製の際には留意する（定量機器にRoche LightCycler Systemを用いる場合には、これに当たらず、他のプローブと同濃度で使用する。）。

3.2.1.1.2.GA21の定量
　組換え系統GA21は、CaM配列が組み込まれていない。したがって、本系統の含有率を確認するため、CaM配列を分析するものと同一のDNA試料液について、別にGA21に特異的なプライマー対GA21-3とプローブGA21-Taqを用い、3.2.1.1.1.と同様の方法でGA21遺伝子のコピー数を算出し、GA21の含有率を求める。

3.2.1.1.3.結果の判定
　３試料につき、各１回の抽出を行い、得られたDNA試料液について定量PCR行った結果、CaM配列が組み込まれた遺伝子組換えトウモロコシの含有率にGA21の含有率を加えた値が４.５％を越える場合、さらに、別に２回の抽出を行い、計３回の抽出より得られたDNA試料液について、それぞれトウモロコシ組換え系統特異的定量を行う。

3.2.1.2.トウモロコシ組換え系統特異的定量
3.2.1.2.1.Event176、Bt11、T25及びMon810の定量
　GA21については、3.2.1.1.2.と同様の方法で行う。組換え系統Event176、Bt11、T25及びMon810については、定量用プライマー対とプローブとして、それぞれE176-2とE176-Taq、Bt11-3とBt11-Taq、T25-1とT25-Taq及びM810-2とM810-Taqを用い、3.2.1.1.1.と同様の方法^＊でEvent176、Bt11、T25、Mon810の各遺伝子のコピー数を算出し、Event176、Bt11、T25、Mon810の系統別含有率を求める。
^＊Roche LightCycler Systemを用いてBt11を対象とする測定を行う場合は、反応液組成（MgCl2濃度）が異なるため、注意する。組成を以下に示す。LC-FastStart DNA Master Hybridization Probes ２μL、対象プライマー対溶液（２５μmol/L）０.４μL、対象プローブ溶液（１０μmol/L）０.４μL、水１１.４μL、MgCl₂ 溶液（２５mM）０.８μL、１０ng/μL DNA試料液５μL（５０ng）、又は検量線用標準プラスミドDNA溶液５μL、あるいは５ng/μL ColE1/TE溶液（ブランク試料液：NTC）５μL。
　また、ABI PRISM^TM 7５00を用いてトウモロコシ組換え系統特異的定量試験は行うことができない。

3.2.2. 結果の判定
　3.2.1.1.2.で得られたGA21、Event 176、Bt11、T25及びMon810の含有率について、１DNA試料液ずつ総和を算出し、それらの平均が５％を越えた試料については、不適切な分別生産流通管理が行われていた可能性がある。

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（別紙）　内標比

ABI PRISM^TM 7700及びABI PRISM^TM 5700

食品名	対象系統	内標比	備考
大豆	Roundup Ready Soybean	1.05	Le1-n02とLe1-Taq及び RRS-01とRRS-Taqを使用
トウモロコシ	特定せず（スクリーニング）	0.39	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び P35S-1とP35S-Taqを使用
トウモロコシ	GA21	2.01	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び GA21-3とGA21-Taqを使用
トウモロコシ	Event176	1.99	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び E176-2とE176-Taqを使用
トウモロコシ	Bt11	0.44	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び Bt11-3とBt11-Taqを使用
トウモロコシ	T25	0.34	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び T25-1とT25-Taqを使用
トウモロコシ	Mon810	0.38	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び M810-2とM810-Taqを使用

ABI PRISM^TM 7900HT 96well

食品名	対象系統	内標比	備考
大豆	Roundup Ready Soybean	1.04	Le1-n02とLe1-Taq及び RRS-01とRRS-Taqを使用
トウモロコシ	特定せず（スクリーニング）	0.38	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び P35S-1とP35S-Taqを使用
トウモロコシ	GA21	1.99	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び GA21-3とGA21-Taqを使用
トウモロコシ	Event176	2.02	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び E176-2とE176-Taqを使用
トウモロコシ	Bt11	0.40	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び Bt11-3とBt11-Taqを使用
トウモロコシ	T25	0.34	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び T25-1とT25-Taqを使用
トウモロコシ	Mon810	0.36	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び M810-2とM810-Taqを使用

ABI PRISM^TM 7900HT 384well

食品名	対象系統	内標比	備考
大豆	Roundup Ready Soybean	1.00	Le1-n02とLe1-Taq及び RRS-01とRRS-Taqを使用
トウモロコシ	特定せず（スクリーニング）	0.39	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び P35S-1とP35S-Taqを使用
トウモロコシ	GA21	2.06	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び GA21-3とGA21-Taqを使用
トウモロコシ	Event176	2.12	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び E176-2とE176-Taqを使用
トウモロコシ	Bt11	0.43	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び Bt11-3とBt11-Taqを使用
トウモロコシ	T25	0.37	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び T25-1とT25-Taqを使用
トウモロコシ	Mon810	0.38	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び M810-2とM810-Taqを使用

ABI PRISM^TM 7000

食品名	対象系統	内標比	備考
大豆	Roundup Ready Soybean	0.95	Le1-n02とLe1-Taq及び RRS-01とRRS-Taqを使用
トウモロコシ	特定せず（スクリーニング）	0.35	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び P35S-1とP35S-Taqを使用
トウモロコシ	GA21	1.83	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び GA21-3とGA21-Taqを使用
トウモロコシ	Event176	1.93	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び E176-2とE176-Taqを使用
トウモロコシ	Bt11	0.41	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び Bt11-3とBt11-Taqを使用
トウモロコシ	T25	0.40	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び T25-1とT25-Taqを使用
トウモロコシ	Mon810	0.38	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び M810-2とM810-Taqを使用

ABI PRISM^TM 7５00

食品名	対象系統	内標比	備考
大豆	Roundup Ready Soybean	1.02	Le1-n02とLe1-Taq及び RRS-01とRRS-Taqを使用
トウモロコシ	特定せず（スクリーニング）	0.46	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び P35S-1とP35S-Taqを使用
トウモロコシ	GA21	2.13	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び GA21-3とGA21-Taqを使用

LightCycler System

食品名	対象系統	内標比	備考
大豆	Roundup Ready Soybean	1.01	Le1-n02とLe1-Taq及び RRS-01とRRS-Taqを使用
トウモロコシ	特定せず（スクリーニング）	0.53	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び P35S-1とP35S-Taqを使用
トウモロコシ	GA21	2.63	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び GA21-3とGA21-Taqを使用
トウモロコシ	Event176	2.60	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び E176-2とE176-Taqを使用
トウモロコシ	Bt11	0.63	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び Bt11-3とBt11-Taqを使用
トウモロコシ	T25	0.31	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び T25-1とT25-Taqを使用
トウモロコシ	Mon810	0.49	SSIIb-3とSSIIb-Taq及び M810-2とM810-Taqを使用

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（参考）

（１）	2.2. DNA抽出精製法のうち、2.2.1.2.及び2.2.1.3.のシリカゲル膜タイプキット法（QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit）に用いられるAP1及びAP2緩衝液及びRNase Aは、キットに含まれるものとは別にキアゲン（〒104-0054東京都中央区勝どき3-13-1 Forefront Tower II.　Tel. 03-5547-0811　Fax. 03-5547-0818）から購入可能である。
（２）	2.2. DNA抽出精製法のうち、2.2.1.４.及び2.2.1.５.のシリカゲル膜タイプキット法（NIPPON GENE GM quicker）に用いられるGE1及びGE2緩衝液及びRNase Aは、キットに含まれるものとは別にニッポンジーン（〒930-0982 富山市問屋町1-29. Tel. 076-451-6548 Fax. 076-451-6547）から購入可能である。
（３）	3. 安全性審査済の組換えDNA技術応用食品の検査方法のうち、3.1.2.記載の検量線の作成に用いられる標準プラスミドDNA溶液（GMダイズ（RRS）プラスミドセット-ColE1/TE-；　GM Soybean（RRS）Detection Plasmid Set-ColE1/TE-、GMトウモロコシプラスミドセット-ColE1/TE-; GM Maize Detection Plasmid Set-ColE1/TE-）は、ニッポンジーン（〒930-0982 富山市問屋町1-29.　Tel. 076-451-6548　Fax. 076-451-6547）、ファスマック（〒243-0041厚木市緑ヶ丘5-1-3.　Tel. 046-295-8787　Fax. 046-294-3738）から購入可能である。
（４）	3. 安全性審査済の組換えDNA技術応用食品の検査方法のうち、3.1.2.1.1.記載のPCR用反応液の調製に用いられる対象プライマー対、対象プローブは、ニッポンジーン、ファスマックから購入可能である。
（５）	3. 安全性審査済の組換えDNA技術応用食品の検査方法のうち、3.1.2.4.1.記載のLight Cycler Systemを用いた定量PCRにおいて使用する試薬類はロシュ・ダイアグノスティック（〒105-0014 東京都港区芝2-6-1.　Tel. 03-5443-5287　Fax. 03-5443-7098）から購入可能である。
（６）	独立行政法人農林水産消費技術センター作成のJAS分析試験ハンドブック「遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル」は下記ホームページから入手可能である。 http://www.maff.go.jp/sogo_shokuryo/jas/manual00.htm

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