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トリフルミゾール試験法


1. 分析対象化合物
 トリフルミゾール, トリフルミゾール代謝物 〔4−クロロ−α,α,α−トリフルオロ−N−(1−アミノ−2−プロポキシエチリデン)−o−トルイジン〕

2. 装置
紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフを用いる。

3. 試薬、試液
次に示すもの以外は, 総則の3に示すものを用いる。
カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウムカラムクロマトグラフィー用に製造した合成ケイ酸マグネシウム(粒径150〜250μm)を130°で12時間以上加熱した後,デシケーター中で放冷する。これに対して水を5%加える。
0.01mol/l炭酸塩緩衝液 0.2mol/l炭酸ナトリウム溶液0.8ml及び0.2mol/l炭酸水素ナトリウム溶液9.2mlに水を加えて200mlとする。
トリフルミゾール及び4−クロロ−α,α,α−トリフルオロ−N−(1−アミノ−2−プロポキシエチリデン)−o−トルイジン標準溶液 トリフルミゾール10mg及び4−クロロ−α,α,α−トリフルオロ−N−(1−アミノ−2−プロポキシエチリデン)−o−トルイジン10mgをアセトニトリルに溶かして100mlとする。
0.05mol/lリン酸塩緩衝液 0.5mol/lリン酸一カリウム溶液55.4ml及び0.5mol/lリン酸二ナトリウム溶液48.2mlに水を加えて1,000mlとする(pH6.8)。

4. 標準品
トリフルミゾール 本品はトリフルミゾール99%以上を含む。
融点 本品の融点は63.5°である。
4−クロロ−α,α,α−トリフルオロ−N−(1−アミノ−2−プロポキシエチリデン)−o−トルイジン 本品は4−クロロ−α,α,α−トリフルオロ−N−(1−アミノ−2−プロポキシエチリデン)−o−トルイジン98%以上を含む。

5. 試験溶液の調製
a 抽出法
(1) 穀類及び種実類の場合
検体を420μmの標準網ふるいを通るように粉砕した後,その20.0gを量り採り,水40mlを加え,2時間放置する。
これにメタノール100mlを加え,振とう機を用いて30分間激しく振り混ぜた後,静置し,ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いて吸引ろ過し,ろ液を500mlの分液漏斗に移す。ろ紙上の残留物を採り,メタノール50mlを加え,振とう機を用いて30分間激しく振り混ぜた後,上記と同様に操作して,ろ液を上記の500mlの分液漏斗に合わせる。
これに5%塩化ナトリウム溶液200ml及びジクロロメタン(特級)100mlを加え,振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後,静置し,ジクロロメタン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にジクロロメタン(特級)100mlを加え,上記と同様に操作して,ジクロロメタン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え,時々振り混ぜながら15分間放置した後,すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでジクロロメタン(特級)20mlを用いて三角フラスコを洗い,その洗液でろ紙上の残留物を洗う。洗液をその減圧濃縮器中に合わせ,40°以下でジクロロメタンを除去する。この残留物にアセトン及びn−ヘキサンの混液(1:19)5mlを加えて溶かす。
(2) 果実,野菜及び抹茶の場合
果実及び野菜の場合は,検体約1kgを精密に量り,必要に応じ適量の水を量つて加え,細切均一化した後,検体20.0gに相当する量を量り採り,0.05mol/lリン酸塩緩衝液20mlを加える。
抹茶の場合は,検体20.0gを量り採り,0.05mol/lリン酸塩緩衝液20mlを加える。
これにメタノール100mlを加え,振とう機を用いて30分間激しく振り混ぜた後,静置し,ケイソウ土を1cmの厚さに敷いたろ紙を用いて吸引ろ過し,ろ液を500mlの分液漏斗に移す。ろ紙上の残留物を採り,メタノール50mlを加え,振とう機を用いて30分間激しく振り混ぜた後,上記と同様に操作して,ろ液を上記の500mlの分液漏斗に合わせる。この液のpHを測定し,酸性であれば0.1mol/l水酸化ナトリウム溶液を用いてpH7付近に調整する。
これに5%塩化ナトリウム溶液200ml及びジクロロメタン(特級)100mlを加え,振とう機を用いて5分間激しく振り混ぜた後,静置し,ジクロロメタン層を300mlの三角フラスコに移す。水層にジクロロメタン(特級)100mlを加え,上記と同様に操作して,ジクロロメタン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え,時々振り混ぜながら15分間放置した後,すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いでジクロロメタン(特級)20mlを用いて三角フラスコを洗い,その洗液でろ紙上の残留物を洗う。洗液をその減圧濃縮器中に合わせ,40°以下でジクロロメタンを除去する。この残留物にアセトン及びn−ヘキサンの混液(1:19)5mlを加えて溶かす。
(3) 抹茶以外の茶の場合
検体4.00gを100°の水240mlに浸し,室温で5分間放置した後,ろ過する。オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム(360mg)に,アセトニトリル5ml及び水5mlを注入し,流出液は捨てる。このカラムに上記のろ液30mlを注入した後,水10ml,次いでアセトニトリル及び水の混液(3:7)10mlを注入し,流出液は捨てる。続いてアセトニトリル及び水の混液(4:1)5mlを注入し,流出液を採り,これを試験溶液とする(b 精製法による操作は必要ない。)。
b 精製法
内径15mm,長さ300mmのクロマトグラフ管に,カラムクロマトグラフィー用合成ケイ酸マグネシウム10gをアセトン及びn−ヘキサンの混液(1:19)に懸濁したもの,次いでその上に無水硫酸ナトリウム約5gを入れ,カラムの上端に少量のアセトン及びn−ヘキサンの混液(1:19)が残る程度までアセトン及びn−ヘキサンの混液(1:19)を流出させる。このカラムにa 抽出法で得られた溶液を注入した後,アセトン及びn−ヘキサンの混液(1:19)50mlを注入し,流出液は捨てる。次にアセトン及びn−ヘキサンの混液(1:9)100mlを注入し,最初の流出液40mlを200mlの三角フラスコ(I)に採り,次の流出液60mlを200mlの三角フラスコ(II)に採る。各流出液をそれぞれすり合わせ減圧濃縮器中に移し,40°以下でアセトン及びn−ヘキサンを除去する。それぞれの残留物にアセトニトリルを加えて溶かし,正確に10mlとして,前者は,4−クロロ−α,α,α−トリフルオロ−N−(1−アミノ−2−プロポキシエチリデン)−o−トルイジンの試験溶液とし,後者はトリフルミゾールの試験溶液とする。
4−クロロ−α,α,α−トリフルオロ−N−(1−アミノ−2−プロポキシエチリデン)−o−トルイジンの試験溶液を5.操作法のa 定性試験に準じて試験し,試験溶液中の不純物のため試験が困難な場合は次の操作を行う。
三角フラスコ(I)に採った流出液の残留物にジクロロメタン(特級)100mlを加えて溶かし,300mlの分液漏斗(I)に移す。これに1mol/l塩酸50mlを加え,よく振り混ぜた後,静置し,水層を300mlの分液漏斗(II)に移す。ジクロロメタン層に1mol/l塩酸50mlを加え,上記と同様に操作して,水層を分液漏斗(II)に合わせる。これに10mol/l水酸化ナトリウム溶液11mlを加え,次いでジクロロメタン(特級)50mlを加え,よく振り混ぜた後,静置し,ジクロロメタン層を200mlの三角フラスコに移す。水層にジクロロメタン(特級)50mlを加え,上記と同様に操作して,ジクロロメタン層を上記の三角フラスコに合わせる。これに適量の無水硫酸ナトリウムを加え,時々振り混ぜながら15分間放置した後,すり合わせ減圧濃縮器中にろ過する。次いで少量のジクロロメタン(特級)を用いて三角フラスコを洗い,洗液をその減圧濃縮器中に合わせ,40°以下でジクロロメタンを除去する。この残留物にアセトニトリルを加えて溶かし,正確に10mlとして,これを4−クロロ−α,α,α−トリフルオロ−N−(1−アミノ−2−プロポキシエチリデン)−o−トルイジンの試験溶液とする。

6. 操作法
a 定性試験
次の操作条件で試験を行う。試験結果は標準品と一致しなければならない。
操作条件
カラム充てん剤 オクタデシルシリル化シリカゲル(粒径5μm)を用いる。
クロマトグラフ管 内径2〜5mm,長さ200〜500mmのステンレス管を用いる。
カラム温度 40°
検出器 波長238nmで操作する。
移動相 アセトニトリル,0.01mol/l炭酸塩緩衝液及び水の混液(7:1:2)に対して4%リン酸を加え、pH9.0に調整したものを用いる。トリフルミゾールの試験を行う場合は,トリフルミゾールが約10分で流出する流速に調整する。4−クロロ−α,α,α−トリフルオロ−N−(1−アミノ−2−プロポキシエチリデン)−o−トルイジンの試験を行う場合は,4−クロロ−α,α,α−トリフルオロ−N−(1−アミノ−2−プロポキシエチリデン)−o−トルイジンが約6分で流出する流速に調整する。
b 定量試験
a 定性試験と同様の操作条件で得られた試験結果に基づき,トリフルミゾール及び4−クロロ−α,α,α−トリフルオロ−N−(1−アミノ−2−プロポキシエチリデン)−o−トルイジンのそれぞれについてピーク高法又はピーク面積法により定量を行い,トリフルミゾール及び4−クロロ−α,α,α−トリフルオロ−N−(1−アミノ−2−プロポキシエチリデン)−o−トルイジンの含量を求め,次式により,4−クロロ−α,α,α−トリフルオロ−N−(1−アミノ−2−プロポキシエチリデン)−o−トルイジンを含むトリフルミゾールの含量を求める。
トリフルミゾール(4−クロロ−α,α,α−トリフルオロ−N−(1−アミノ−2−プロポキシエチリデン)−o−トルイジンを含む。)の含量(ppm)=A+B×1.17
A:トリフルミゾールの含量(ppm)
B:4−クロロ−α,α,α−トリフルオロ−N−(1−アミノ−2−プロポキシエチリデン)−o−トルイジンの含量(ppm)

7. 定量限界
0.05 mg/kg

8. 留意事項
 トリフルミゾールは、トリフルミゾール及びその代謝物である4−クロロ−α,α,α−トリフルオロ−N−(1−アミノ−2−プロポキシエチリデン)−o−トルイジンのそれぞれについて定量を行い、4−クロロ−α,α,α−トリフルオロ−N−(1−アミノ−2−プロポキシエチリデン)−o−トルイジンについてはその含量に係数を乗じてトリフルミゾールの含量に換算し、これらの和を分析値とすること。

9. 参考文献
なし

10. 類型
A


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