1. | ガイドラインの目的及び適用範囲 |
1-1) | 目的 |
1-2) | 適用範囲 |
2. | 検査精度の確保及び試験方法の標準化のための方策 |
2-1) | 施設・設備の整備等に関する事項 |
(1) | 核酸抽出を行う場所 可能な限り独立した施設ないしは設備を用いて行うこと。 |
(2) | 試薬の保管場所及び試薬の調製場所 可能な限り独立した施設ないしは設備を用いて行うこと。 |
(3) | 核酸増幅を行う場所 可能な限り独立した施設ないしは設備を用いて行うこと。 |
(4) | 増幅産物の検出を行う場所 増幅前の試料を取り扱う部屋と増幅産物を取り扱う部屋とを区別すること。 また、NATでは、感染性のある標準品や陽性試料を取り扱うことから、試験・検査は、製造区域とは明確に区別された場所で行うことが必要である。 |
2-2) | 機器,器具の保全、管理に関する事項 |
2-3) | (被験)検体の移送・保管、試薬の保管・管理に関する事項 |
(1) | 検体の移送・保管に関する事項 |
(2) | 試薬の保管・管理に関する事項 |
2-4) | 核酸の抽出・増幅及び増幅産物の検出に関する事項 |
(1) | 抽出に関する事項 スパイク実験等により、用いる抽出法について評価を行うこと。 市販の試薬を用いる場合には、試薬メーカーによる解析結果をもって代えることができる。 |
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(2) | プライマー及びプローブに関する事項 プライマー及びプローブ(以下「プライマー等」という。)は核酸検出系の中心的役割を果たしており、その品質がNATの重要な要素となっている。このため、選択したプライマー等の科学的合理性を説明できることが必要であり、プライマー等の大きさ、GC含量、Tm値、想定されるヘアピン構造や2次構造についての情報を明らかにしておくとともに、次のような情報も明らかしておくこと。 |
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(3) | プライマー等の純度、ロット間差等の品質の確保に関する事項 プライマー等の純度について最新の測定法を用いて解析し、解析結果を示すとともに、必要に応じてその規格値を定めておくこと。さらに、プライマー等の最適量について、段階的希釈法での検出能を指標とするなどして解析するとともに、ロット間の一定性についての情報や、複数のロットの合成プライマー等の特性解析結果やイールド等についての詳細な情報を明らかにしておくこと。なお、プライマー等の化学修飾を行う場合には、その詳細に係るデータを含む説明資料を作成しておくこと。 市販の試薬を用いる場合には、試薬メーカーによる解析結果をもって代えることができる。 |
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(4) | 使用する酵素の品質の確保に関する事項 NATに用いるすべての酵素について、その由来と機能を明らかにしておくこと。酵素の純度、力価,比活性について受入れ規格を定めておくこと。調製した酵素について、エクソヌクレアーゼ活性、DNA及びRNA依存性のポリメラーゼ活性等を明らかにしておくこと。市販の試薬を用いる場合には、試薬メーカーによる解析結果をもって代えることができる。 |
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(5) | 受入れ基準の設定 試薬や反応液の受入れ規格を、適切な評価に基づいて作成しておくこと。 |
2-5) | 試験の最適化と特異性の確認、非特異的反応の除去に関する事項 |
(1) | 特異性の確認(目的とする遺伝子の検出) |
(2) | 交差反応性(非特異的反応)の除去 |
(3) | 増幅産物が特異的である確認 |
・ | ウイルス遺伝子(亜)型(ジェノタイプ)に対する検出感度 |
2-6) | 検出感度に関する事項 |
(1) | 検出感度 |
(2) | 検出感度の求め方 |
・ | 希釈系列の作製 標準品の希釈系列を作製すること。希釈液の数を処理しやすい数にするためには、予備試験(例えば指数段階的に希釈を作製するなど)を行い予備的な陽性検出感度値(すなわち陽性シグナルが得られる高い希釈倍率)を決定する。希釈範囲は、予備的な陽性検出感度値付近を選択する(希釈液として陰性血漿を用い、希釈率として0.5logまたはそれ以下を使用する。)。あるいはバリデートされた定量的NATを用いることも可能である。95%の確率で検出されるウイルス遺伝子の量は適切な統計学的な手法によって算出すること。 NATにおいては、各試験の精度や感度を管理するためには標準品あるいは参照品が必須である。通常、NATの開発過程における、ウイルス濃縮、遺伝子の抽出、増幅、ハイブリダイゼーション、定量、汚染をモニターするための標準品又は参照品、ランコントロールを用いた解析を行う必要がある。 ランコントロールにおいては、95%の確率で検出される検出感度の3倍量のウイルスを含む標準検体を用いることが推奨される。試験では、この標準検体は必ず陽性にならなければならない。このように標準検体を用いることにより、各試験の成立をモニターすることが可能となる。 |
・ | 3回以上の独立した試験の実施 少なくとも3つの独立した希釈系列を用い、充分な回数の試験を繰り返し、各希釈段階での総試験回数が24になるように試験を実施する。例えば、3つの希釈系列を別々の日に8回行う、4つの希釈系列を別々の日に6回行う、6つの希釈系列を別々の日に4回行うなどである。これらの結果は試験法の日差変動を示す役目も果たしている。 交叉汚染が防止できていることを示すために、陰性プール血漿と高い濃度で目的とするウイルスをスパイクした陰性プール血漿(濃度としては95%の確率で検出されるウイルス量の100倍量以上)を、少なくとも20検体をランダムに配置するなどして、試験することにより確認しておくこと。 |
・ | 使用する標準品 (1)国際標準品、(2)国際標準品とのデータの互換性が保証された国内標準品、(3)国際標準品又は国内標準品とのデータの互換性が保証された自社標準品のいずれかを使用すること。 |
2-7) | 判定基準の設定に関する事項 |
(1) | 陽性及び陰性の判定基準の明確化と文書化 陽性及び陰性の合理的な判定基準を明確にし、文書化しておく必要がある。 |
(2) | 再試験を行う時の基準及び判定基準の文書化 再試験を行うときの基準、再試験での合理的な判定基準についても文書化しておく必要がある |
2-8) | 従事者の技術の標準化と向上に関する事項 |
(1) | 作業手順の標準化と作業手順書の作成 |
・ | サンプリングの方法(容器の種類等) |
・ | ミニプールの調製方法 |
・ | 試験までの保存条件 |
・ | 交叉汚染やウイルス遺伝子・試薬・標準検体の劣化を防止するための試験条件の正確な記述 |
・ | 使用する装置の正確な記述 |
・ | 統計解析を含む結果の詳細な計算式 |
(2) | 検査従事者を対象とした教育・訓練、技能検査の実施 |
(3) | 作業記録の作成、保管・管理 |
2-10) | 汚染防止に関する事項 |
(1) | 試験操作中の器具などを介した汚染の防止策 |
(2) | 着衣、履物等を介した汚染拡大の防止策 |
3. | 試験、検出結果の意義づけ |
3-1) | 「陽性」と判定した結果の意義 |
3-2) | 「陰性」と判定した結果の意義 |
3-3) | 必要とされる検出限界値について |
4. | 新技術の導入に関する事項 |