Ⅳ．流通・保管・販売
　
(1)汚染実態
　セレウス菌は牛乳やクリームを汚染して粒状クリームまたは甘い凝乳となる腐敗の原因として古くから知られています。本菌は市販の殺菌乳および滅菌乳からも高率に検出され、さらに粉乳およびアイスクリームの汚染が高いことも認められています
　殺菌乳167検体中の52検体（31.2%）から低温性胞子形成細菌が検出された。検出された菌種は<I>B.cereus</I>が最も多く、その他には<I>B.megaterium</I>、<I>B.coagulans</I>、B.licheniformis、B.firmusであった。
　また、378の乳製品（牛乳およびチーズ）中265品（70％）で<I>Bacillus</I>属を検出した結果、菌数は10～1.2x103 cfu／mlまたはgであった。265の陽性サンプルより483株、14種を分離した結果、最多の好冷株は<I>B.cereus</I>（全体の18.6%）であった。<I>B.coagulans</I>、<I>B.mycoides</I>、<I>B.subtilis</I>などが一般的な中温菌であり、<I>B.stearothermophilus</I>が優勢な好熱菌であった\S（流通・保管・販売 汚染実態）#4-1\E。
　ノルウェー製の乳製品からも85種のB．cereusが検出された。うち、50種（59%）はエンテロトキシン産生菌であり、また、13種（15%）は好冷菌であった（6℃にて増殖）。そのうちの6種（7%）は、両方の性質を持っていた\S（流通・保管・販売 汚染実態）#4-1\E。
　オランダの一般世帯の冷蔵庫に保管された低温殺菌乳中のセレウス菌と好熱菌数の汚染率は334検体中247検体（74%）で好熱菌数が50～5000個/mlであった。セレウス菌は133検体(40%)から単離できたが、一般的に菌数は低く、258検体(77%)で5個/ml以下であった。好熱菌数とセレウス菌数は保管温度が高く保存期間が長いほど多くなった。増殖試験を行った106株の53%が7℃での増殖が可能であった。エンテロトキシン産生をテストした37株ではウエスタンブロット法で27株（33%）、PCR法で28株（76%）、ベロ細胞法で26株(70%)にそれぞれ産生が認められ、単離した菌のうちラクトースを資化できない株でのエンテロトキシン産生はラクトース資化できる株のそれに比べて低いものであった\S（流通・保管・販売 汚染実態）#4-1\E。
　
(2)増殖特性
　セレウス菌の栄養細胞の発育温度域は10～48℃だが、低温増殖性の菌も見出されています。pH域は4.9～9.3、水分活性域0.913～0.95、芽胞の発芽温度域は1～59℃、pH域は4.35～9.30、水分活性域は0.993以上で食中毒の感染菌量は＞105/gと報告されています。
　スペインとオランダで起きた3件の食中毒の原因菌は4～37℃で増殖し、43℃では増殖しなかった。このようなセレウス菌好冷株は多くの乳製品（殺菌乳）やムース、調理食品から見つかった\S（流通・保管・販売 汚染実態）#4-1\E。
　乳由来の低温または中温性<I>Bacillus</I>属50菌株（ｾﾚｳｽ菌26株含む）の温度に対する増殖特性は培養結果より各検体は下記の3つのグループに分けられた。
　Aグループは低温発育性で6.5℃、30℃で生育するが、40℃では生育せず、27株のうちｾﾚｳｽ菌15株(約56%)であった。Bグループは中温発育性で全ての温度で生育する、9株のうちｾﾚｳｽ菌8株（約89%）。CグループはAとBの中間で30℃、40℃で生育するが、6.5℃では生育せず、15株のうちｾﾚｳｽ菌4株（約27%）であった。グループBは他のグループと異なり、ほとんどｾﾚｳｽ菌であった\S（流通・保管・販売 増殖特性）#4-2\E。
　新たに殺菌された殺菌乳を7℃保存下での微生物の状態をモニターしたところ、保存初日の中温好気性菌数（APC）は＜10～102/mlと低く、セレウス菌が検出されたのは27サンプル中2サンプルだけであった。5日日から有意のAPCとセレウス菌数の増加が認められ、実験終了時（9日）にセレウス菌が検出されなかったのは3サンプルのみで、＞103/mlが11サンプルあった。これら11サンプル中9サンプルは5日目には未だ検出限界以下であったことは注目すべきで、この菌の発育最低温度5～6℃を流通過程で越える可能性がある場合は消責期限を短縮する必要がある\S（流通・保管・販売 増殖特性）#4-2\E。
　8種類の市販粉乳（脱脂粉乳、全脂粉乳）の微生物学的品質調査と保存温度が還元乳中でのセレウス菌の生育、品質保持期限および微生物叢に及ぼす影響を調べた。還元乳の品質保持期限は20℃、30℃の場合、凝固した時間の12時間前の時点と定義、5℃では凝固を示さなかったことから、風味異常を示した時点とした。当初は<I>Bacillus</I>と<I>Micrococcus</I>が優勢であった。30℃保存では、始めは<I>Bacillus</I>が増殖したが、次第に<I>Micrococcus</I>に変化した。腐敗時には、<I>Bacillus</I>は数ｵｰﾀﾞｰ急激に減少した。セレウス菌数は腐敗前の10時間程度で危険レベルに達した。20℃でも時間の違いはあるが同様の傾向を示した。5℃では<I>Bacillus</I>は漸増したが、グラム陰性菌の割合が高くなった。セレウス菌数は発症レベルに達しなかった\S（流通・保管・販売 汚染実態）#4-1\E。
　デイリー製品（9品目のクリーム）において、温度6℃と21℃で2時間～6日間、セレウス菌がどの程度増殖するかを調べた。6℃では増殖せず。21℃では増殖が顕著であった。クリーム類は増殖数と腐敗が明らかに相関するが、クリームキャラメルのように風味をつけたデザートでは増殖数が多くても腐敗が感知できなかった\S（流通・保管・販売 増殖特性）#4-2\E。
　乳酸菌のセレウス菌に対する抑制に関しては、乳酸菌<I>Streptococcus　lactis</I>（<I>S.lactis</I>）の存在の有無に拘わらず、セレウス胞子の発芽後の生育には有意差はなかった。6時間を超えると、<I>S.lactis</I>を共存させたスキムミルクにおけるセレウス芽胞数は急速に減少した。一方、コントロールのスキムミルクにおいては、同芽胞が指数関数的に増加した。4時間培養では、<I>S.lactis</I>を共存させたスキムミルクにおけるセレウス芽胞の生存率は77%であったが、コントロールでは97%と生存率が高かった。また、<I>S.lactis</I>の酸産生速度はセレウス菌の有無とは関係がなかった。
　乳酸で酸性にした酸性スキムミルクにおいては、pHが6.55から5.03に低下するにつれ、胞子の発芽、発芽後の生育および栄養型細胞の増殖が抑制された。PH5.0では胞子の発芽、発芽後生育および栄養型細胞の細胞分裂のいずれも阻止された。しかし、芽胞はこのpHでは破壊されなかった。
　チェダーチーズ製造（72.2℃17秒殺菌シタミルクから）工程中のセレウス栄養型細胞はミルクの熟成中におよそ5培に増加し、芽胞数は10培減少した。カッテイングでカードは19500　cfu/gのセレウス菌(生菌数)を含んでいた。粉砕工程では220000　cfu/mlまで増加した。その後の食塩添加および円形成型工程では、セレウス菌数は42000　cfu/gまで減少した。しかし、そのチーズカードの芽胞数はカッテイング時の690　cfu/gの低レベルから6000　cfu/gまで上昇した。一日保管されたチーズにおいては、セレウス菌数は4300　cfu/gであったが、芽胞数は5600　cfu/mlであった。セレウス菌は芽胞の状態で存在していた。熟成時間が8週から52週と進んでも、生菌数と芽胞数は5500～8200 cfu/gの範囲で一定していて、外観上コントロールのチーズとはほとんど変わりがなかった。チーズの熟成期間においては、セレウス菌は栄養型ではほとんど存在せず芽胞型で存在しており、適切なpHコントロールを行えば、セレウス菌の増殖を効果的に抑制できることを実証した\S（流通・保管・販売 増殖特性）#4-2\E。
　工場で充填された半脱脂殺菌牛乳中の<I>Bacillus cereus</I> の低温保存中の菌数変化について、予測微生物学から計算される値と保存試験の測定値とを比較した。今回のガンマコンセプトを用いた予測モデルから求めた増殖速度は、他の予測モデルからの文献値と良く一致した。また、予測モデル及び実験結果から得られた増殖速度は良く一致した。予測微生物学を用いた汚染の予測は初期細菌数が0.01個/mlの検体を工場で4℃で2日、販売店で7℃で2日、消費者で7℃で5日保存した場合、10E2.9　個に増菌すると予測される。一方、初期細菌数0.001～10個/mlの検体を工場で4℃で2日、販売店で7℃で2日保存した場合の「消費者の保存温度（6～12℃）」と「細菌数が10E5を超える（感染菌数）日数」との関係を調べた結果、10E5を超える日数は1.2～13.4日の範囲であると予測された\S（流通・保管・販売 増殖特性）#4-2\E。
　
(3)毒素産生
　牛乳より分離したセレウス菌の牛乳中での8℃と30℃保存下における、下痢型毒素産生について調査した。30℃での毒素産生は7時間後より著しい増加が見られ、24時間後では、50～73.2％の株で細胞障害活性が見られた。低温下（8℃）では、嫌気下では見られず、通気下で72～96時間後に増加した。増殖が遅いセレウス菌株（＜2×10E7　CFU/ml）では細胞障害活性は無く、毒素産生株は1×10E8　～3×10E8　CFU/ml集中していた。通気下でのスキムミルクおよびホイップクリームで毒素産生が多く見られた\S（流通・保管・販売 毒素産生）#4-3\E。
　乳製品（牛乳およびチーズ）から分離した90の<I>B.cereus</I>分離株中の72％（65株）が逆受身ラテックス凝集法で毒素産生性を示した。他の株（<I>B.coagulans</I>、<I>B.mycoides</I>、<I>B.subtilis</I>、<I>B.stearothermophilus</I>）は産生しないか検出レベル以下のものであった\S（流通・保管・販売 毒素産生）#4-3\E。
　デイリー製品（各クリーム9品目）において、腐敗を感知する前に <I>B.cereus</I>菌による下痢毒素が産生されるかどうかを調べた。温度6℃、21℃で2時間～6日間観察した。　
　6℃では毒素産生はなし。21℃では、4時間までは毒素産生なし。クリーム類は24時間で毒素が検出され、腐敗臭も感知できた。一方、クリームキャラメルのような風味をつけたデザートでは、十分な毒素産生が起こっていても腐敗が感知できなかった\S（流通・保管・販売 毒素産生）#4-3\E。
　卵、牛乳、魚肉、食肉製品などでは、セレウス菌は増殖するが、嘔吐型毒素の産生性は非常に低かった。食酢、マヨネーズなどで調理した食品で嘔吐型毒素産生が明らかに抑制される場合があり、pHを下げることによって、セレウス菌の毒素産生を抑制することが可能であった。
　セレウス菌好冷株は多くの乳製品（殺菌乳）やムース、調理食品から見つかった。この好冷菌のエンテロトキシン産生は4℃以下での保存やpH5.0以下において妨げられた\S（流通・保管・販売 毒素産生）#4-3\E。
　以上のようにセレウス菌産生の下痢型毒素および下痢型毒素産生は、菌増殖を抑える温度4℃以下、pH5以下の条件によって抑制された。下痢型毒素は加熱（56℃、5分）や、トリプシンやプロナーゼなどの酵素や胃酸などで失活されるが、嘔吐型毒素は熱耐性（126℃、90分）が強く、通常の加熱殺菌では失活されないため、嘔吐型食中毒予防のためには黄色ブドウ球菌のエンテロトキシンと同様に、保存温度を低く保ち毒素産生を抑えることが重要である。
　
(4)制御
　食酢、マヨネーズなどで調理した食品で本菌の増殖と嘔吐型毒素産生が明らかに抑制される場合があり、pHを下げることによって、セレウス菌の増殖、毒素産生を抑制することが可能であった。
　殺菌乳を7℃保存下でセレウス菌数と中温好気性菌数（APC）を9日間モニターしたところ、実験最終時にセレウス菌が検出されなかったのは27サンプル中の3サンプルで11サンプルは＞10E3/mlであった。以上のことからセレウス菌の発育最低温度5～6℃を流通過程で越える可能性がある場合は消費期限を短縮する必要があることが示唆された\S（流通・保管・販売 制御）#4-4\E。
　セレウス菌の成長、生存に対するpH、温度、ナイシンの単独及び複合的な影響を観察した。8℃と15℃における芽胞の発芽は、それぞれナイシン5μg/mlと50μg/mlで抑制された。セレウス菌好冷株の成長を制御するのに用いるナイシンの効果は15℃より8℃、またpHは6.57から5.53に下げたときにより効果的であった\S（流通・保管・販売 制御）#4-4\E。
　煮沸(80℃で1分)殺菌乳中における好気性芽胞菌の増殖およびその活性を調査し、二次煮沸殺菌の有用性を調査した。煮沸殺菌乳を30℃で保存した場合、12時間後胞子数は480個/mlから45個/mlへと減少し、24時間後総菌数は470個/mlから1.6×10E6個/mlへと増殖、pHは6.55から5.5へと減少、酸度は0.15%から0.52%へと増加、タイロシン値(タンパク質分解度)は0.072 mgから0.132mgへと増加、遊離脂肪酸値(脂肪分解度)は0.66mlから0.78mlへと増加した。また、胞子420個/ml添加した<I>B.cereus</I>は煮沸殺菌乳中で急速に増殖し、16時間後にはCOBテスト陽性を呈し、24時間後には総菌数1.16×10E6個/mLへと増殖しカードを形成した。胞子480個/ml添加した<I>B.subtilis</I>は煮沸殺菌乳中で急速に増殖し、24時間後にはCOBテスト陽性、総菌数2.7×10E6個/mLへと増殖した。胞子340個/mL添加したB. megateriumは煮沸殺菌乳中で急速に増殖し、42時間後にはCOBテスト陽性を呈させ、48時間後には総菌数10.5×10E6個/mLへと増殖した。1回煮沸殺菌乳は、2回目の煮沸殺菌を行うことにより発芽した耐熱性胞子が殺菌可能となり、品質保持期限が延長された。この2回煮沸殺菌乳は37℃で14.5時間、30℃で21.5時間、22℃で28.4時間保持後でもCOBテストは陰性のままであった\S（流通・保管・販売 増殖特性）#4-2\E。
　セレウス菌下痢型食中毒は感染型食中毒であり、腸管内で本菌が増殖する際に産生する下痢型毒素（エンテロトキシン）の作用によって下痢が起こることは明らかになっています。セレウス菌は低温で発育し、特に芽胞は熱抵抗性であるために、低温殺菌後でも残存するする可能性が高く、また、消毒剤や乾燥にも抵抗性を示す。従って、食中毒の予防には、汚染させないこと、あるいは汚染菌量を少なくすることによって、保存温度を低く抑えるしか方法はない。また、低温殺菌による加熱は、芽胞の発芽・増殖を促進するので低温殺菌後の