Ⅶ．検査法
　
毒素検出法
　セレウス菌による食中毒は下痢-腹痛を主症状とする下痢型と嘔吐を主症状とする嘔吐型があります。下痢型食中毒の発症に関与している毒素は下痢原生毒素（エンテロトキシン）で加熱やトリプシン、プロナーゼなどの酵素や胃酸で失活する38000-46000の蛋白質と推定されています。
　毒素の検出法には、一般的に生物学的試験法と抗毒素抗体を用いる免疫学的試験法があります。免疫学的手法による下痢型毒素の検出には、現在市販のセレウス菌毒素検出用キットの逆受身ラテックス凝集反応を利用したRPLA試験キットとミクロスライドゲル内沈降反応法が利用されていますが、前者方が簡便です。
　これらの試験に際しては、増菌培養が必要で1%グルコース添加のブレインハートインフェージョン（BHI）培地で32℃、5-6時間振とう培養後、その遠心上清をメンブランフイルターでろ過したものを試料として用いています。微量の毒素検出や毒素産生能試験では、70%硫酸アンモニウム（硫安）による沈殿（硫安分画）で20倍に濃縮して検出感度を上げています\S（検査法 毒素検出 その他）#7-1-6\E。
　RPLA法と酵素免疫測定キット（ELISA：Tecra（オーストラリア）を比較した成績が報告されています。RPLA法とELISA法では対象となる抗原は異なるため、セレウス菌下痢型毒素の検出率に大きな差があることが報告されています\S（検査法 毒素検出 その他）#7-1-6\E。別の文献でも両方法による結果の間に相関がないことが報告されております\S（検査法 毒素検出 その他）#7-1-6\E。
　一方、PRLA法とウエスタンブロット法及び生物学的試験法であるVPR法（Vascular Permeability reaction：ウサギ皮内血管透過性亢進試験）を110種の菌を用いて比較した結果、すべての菌種において、これらの結果は一致し、PRLA法は簡便で有用なエンテロトキシン測定法であると報告されています\S（検査法 毒素検出 その他）#7-1-6\E。RPLA法の検出感度は1-2　ng/mlで、測定時間は18-24時間です。
　嘔吐型食中毒に関与する毒素はセレウリソと命名され、このセレウリドは疎水性の分子量1153.38の環状ペプチドで熱、酸やアルカリやペプシンなどの酵素に強い耐性を持った毒素です。嘔吐毒の検出はHEp-2培養細胞（ヒト咽頭癌由来）に対する空砲化変性活性試験を用いて、毒素量は細胞の変性活性が認められる最高希釈倍率（U）を求め、1Uを5　ng/gとして算出しています\S（検査法 毒素検出 その他）#7-1-6\E。また、嘔吐毒の産生は米粉を添加した培地が有効であることが知られています。最近、LC/MS分析法による嘔吐型毒素の定量が可能となっています。しかし、前者は技術を必要とし、後者は高価な機器が必要であり、簡便・迅速な検出法の開発が望まれています。
　
菌数計測
　セレウス菌数はマニトール卵黄ポリミキシン寒天選択培（MYP）地表面へ塗布し、30℃で24～48時間培養後のコロニーを計数した\S(検査法 菌数計測)#7-3\E。これらの選択培地上ではセレウス菌はマンニット非分解、集落周辺に白濁の卵黄反応（レシチナーゼ反応）を呈します。そのほかの選択分離培地としては、芽胞形成に適し、特にセレウス菌と<I>B.thuringiensis</I>を区別できるKG培地、英国ではPEMBA培地、わが国ではNGKG培地が広く利用されています。セレウス栄養細胞と胞子の計数方法は全細胞数と胞子数を計測するために、試料を80℃10分の加熱処理の前後でIP寒天に塗沫し、37℃で24時間培養し、計数する。栄養細胞数は、全細胞数（熱処理前）と胞子数（熱処理後）の差から求められる\S(検査法 菌数計測)#7-3\E。
　生乳中に汚染するセレウス菌の芽胞を定量的に検出するための試験法を検討した。中温性で芽胞の発芽が遅い菌株2株、中温性で芽胞の発芽が早い菌株2株、芽胞の発芽の早い低温性の菌株4株の芽胞を接種した生乳を用いた。試料を熱処理して芽胞のみを生存させた後、Triton X-100とトリプシンを加え加温し、試料を0.8μmフィルターで濾過した後にMYP培地、PEMBA培地、ポリミキシン添加血液寒天を比較したところ、血液寒天が最も判定に適していた。また、培養温度は低温性、中温性細菌の両方の生育が20℃において最も良かった。しかも20℃で培養を行った場合は、溶血反応を示すセレウス菌以外の<I>Bacillus</I>属菌の生育が抑制され、判定が容易となった。培養時間は2日に設定した。熱処理の条件は低温性の菌株の芽胞は熱に弱い結果となったために、熱処理の条件は72℃5分とした。また72℃5分の処理ではフィルターの濾過性も優れていた。各種芽胞を添加した試料を用い、フィルター濾過法とMPN法の比較を行った結果、フィルター濾過法の定量性は、MPN法より優れていた\S(検査法 菌数計測)#7-3\E。
　蛍光プローブを用いたPCR法を開発し、脱脂粉乳中の <I>B.cereus</I>の検出への利用性を評価した。780bpヘモリシン増幅産物の配列は<I>B.cereus</I>と<I>B.thuringiensis</I>の間に種に特異的な差異の無いことを示したが、639bpセレオリシンの増幅産物の866、875、1287ヌクレオ位置で、種特異的な差異が見られた。また、72株の<I>B.cereus</I>中51株が cerTAQ-1プローブで陽性、5株の<I>B.thuringiensis</I>中1株のみが cerTAQ-1プローブで陽性、39株の <I>B.cereus</I>中35株が cerTAQ-2で陽性であった。蛍光PCRを用いた43点の脱脂粉乳の<I>B.cereus</I>存在テスト。43サンプル中12サンプルが43CFU／g以上の汚染、全てが蛍光PCR陽性であった。残31サンプル中12がセレウス陰性、19が3～9CFU/gの汚染であった。全31サンプルとも蛍光PCR陰性であった\S(検査法 菌数計測)#7-3\E。
　
菌の同定法
　<I>B.cereus</I>は、Bacillaceae科の<I>Bacillus</I>属に属するグラム陽性の大型の芽胞形成桿菌で、<I>B.thuringiensis</I>、<I>B.mycoides</I>およびB.anthracis（炭疽菌）と遺伝学的に近縁関係にあります。<I>B.mycoides</I>は寒天平板上の根毛状の成育を示し、非運動性であり、平板培地上で他の近縁菌とは容易に区別できる。B.anthracisは莢膜を有し、ペニシリンを含む培地では生育できないことから半別は可能である。<I>B.thuringiensis</I>と、<I>B.cereus</I>は、生化学的性状および寒天平板上の成育状況は全く同一であるが、<I>B.thuringiensis</I>は細胞質内に結晶体毒素を形成することによって区別される。
　近年、<I>B.cereus</I>以外の<I>Bacillus</I>属菌の中にも食中毒を起こす菌として<I>B.subtilis</I>、B.licheniformis、<I>B.brevis</I>が報告されています。 
　最近、好気性芽胞形成菌（<I>Bacillus</I>属細菌）を正確、かつ簡易に同定する方法が確立された。16s rRNA遺伝子の塩基配列の塩基配列の5末端領域約275bp（Hyper　Variable領域（HV領域））が種間で、異なり、また、種内では非常によく保存されていることがわかり、HV領域の塩基配列の違いによって、<I>Bacillus</I>属細菌を種レベルで極めて正確かつ迅速に同定あるいはグルーピングできることが分かってきました。
　チーズ製造工場のホエー製造ラインにおける<I>B.cereus</I>の汚染の程度と原因について検討した。分析した720検体のうち、120検体で<I>B.cereus</I>が検出された。原料乳では検体数の4%（11/302）、ホエーサンプルでは、418サンプル中109サンプル（26%）で検出され、製品の濃縮ホエーでは71～81%の<I>B.cereus</I>が検出された。分離された<I>B.cereus</I>に種々の生化学的テスト（全細胞脂肪酸組成、レシチナーゼ産生、マニトールからの酸生成、溶血性、グルコースの嫌気的利用性、硝酸の還元、Voges-Proskauerテスト、リゾチーム抵抗性、易動性、rhizoidal growth、カゼイン加水分解性）やファージ感受性、部分16srDNAシーケンスを行った結果、原料乳とホエー製造ライン中の<I>B.cereus</I>は、異なった菌株であることがわかった。ホエー製造ライン中の<I>B.cereus</I>は、工程の最終段階に向かうにつれて検出数が増加した。製造工程中から分離した菌株は、8℃以下では生育しなかったが、未殺菌試料から分離した株の増殖下限温度は、5.3及び7.0℃であった\S(検査法 菌の同定法)#7-4\E。
　Random amplified polymorphic DNA(RAPD)分析手法は単一種類のプライマーを用いて行うPCR法、アガロースゲル電気泳動後に検出される複数のPCR産物のバンドパターンにより生物を同定・識別する方法として有用である。
　殺菌乳の製造における<I>B.cereus</I>の汚染源としての充填工程の役割を、古典的な微生物分析とRAPDタイピングの組み合わせにより明らかにした報告があります。古典的な微生物分析としては典型的な溶血活性と血液寒天平板コロニーの形態を、位相差顕微鏡による細胞の特徴的外観を組み合わせて、<I>B.cereus</I>グループを同定した。疑わしい場合は、API 50 CHB/20Eシステムによる生化学的タイプ分けとMYP寒天への塗抹により確認した。殺菌機～充填機の間の3か所で採取した試料は<I>B.cereus</I>濃度が同等に低く､一方、消費者用包装試料では<I>B.cereus</I>の増加が見られた。<I>B.cereus</I>のRAPD型も充填機直前の試料よりも包装済み試料の方が多かった｡包装済み試料で検出された数種のRAPD型は充填機直前の試料では検出されなかった｡このことは、<I>B.cereus</I>の汚染は充填工程にあること示すものである\S(検査法 菌数計測)#7-3\E。また、乳製品工場における殺菌乳へのセレウス菌の汚染に対して、殺菌装置がどのように関与しているかを古典的な微生物検出法と同時に多形DNAランダム増幅法及びポリメラーゼ連鎖反応（RAPD－PCR）を用いた菌株型別により検討した。原乳中の<I>B.cereus</I>胞子の初期濃度は比較的低く、終日低レベルにとどまった。殺菌後の<I>B.cereus</I>含量は最初のサンプリング時間の間は低かったが、第2のサンプリング時間の間に増加した。分離菌は多様であり独特のRAPD様式を有していた。第2のサンプリング時の菌数の大幅な増加は、殺菌装置の不十分な洗浄が原因で、殺菌に耐えたセレウス菌胞子が殺菌装置に付着し牛乳を汚染させた。乳製品の汚染源を追跡するのにRAPD型分けは有用であった\S(検査法 菌数計測)#7-3\E。
　フーリエ変換赤外分光法がBaccillus種の同定に使用できることが報告されています。FTIR分光法は、9つのBaccillus種の間のマハラノビス距離は全て大きく、テストしたBaccillus種の代表株をよく識別することを確認した。<I>B.cereus</I>、<I>B.mycoides</I>及び<I>B.thuringiensis</I>は非常に近い関連性を有しており、炭水化物利用性プロフィール単独では識別することができない。しかし、FTIR分光法を用いることによって14株の<I>B. cereus</I>、12株の<I>B.mycoides</I>、12株の<I>B.thuringiensis</I>の間を識別することができた。FTIR分光法は、食品及び乳工業にとって重要なBaccillus属の種を、迅速にかつ正確に識別するために使用できる方法である\S(検査法 菌数計測)#7-3\E。
　乳加工ライン及び乳工場環境の<I>B.cereus</I>の出現率、分布を調べると共に、分離菌の脂肪酸組成から脂肪酸プロフィールのライブラリーを構築し、MIDI（微生物の細胞壁の脂肪酸組成を分析し、パターン認識で、データベースの脂肪酸組成と比較して微生物を同定する方法）を用いて殺菌乳の<I>B.cereus</I>の汚染源を特定した。MIDIを使用し、セレウス菌の脂肪酸プロフィルライブラリーを作成し、ラインと工場環境からの<I>B.cereus</I>分離株の間の関係を調べたところ、殺菌乳や最終製品からの分離株の大半は原乳の胞子から発芽したものと同じサブグループに属した。以上から、殺菌乳の<I>B.cereus</I>の主たる汚染源は原乳の胞子であり、ラインからの汚染の可能性は少ないことを示唆した\S(検査法 菌数計測)#7-3\E。
　
その他
　セレウス菌芽胞と特異的に結合する複合ストレプトアビジン単鎖抗体の開発を行い、迅速かつ簡便なセレウス菌芽胞の検出手法が確立された。抗体の作成は大腸菌を利用して行われ、単純な透析等の処理を施し、可溶性抗体とした。作成された抗体は免疫磁気ビーズ法を利用し、4℃1時間でセレウス菌芽胞を検出した。なお、試料は無調整殺菌乳とリン酸緩衝液中にセレウス菌芽胞を接種（5×104）した物を使用した。対照として複合ストレプトアビジン単鎖抗体を結合させずに同様の実験を行った。1度セレウス菌芽胞に結合した抗体はリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄を行っても殆ど離れることは無かった。無調整殺菌乳では37％のセレウス菌芽胞、リン酸緩衝液では90％以上のセレウス菌芽胞が検出できた。両者の検出精度の違いは、乳中の乳脂肪分と可溶性タンパク質の影響によるためと考えられた。対照実験ではセレウス菌は検出されなかった。
　本手法では24時間以内にセレウス菌の検出が可能で、複合ストレプトアビジン単鎖抗体は工業的に大量生産が可能である。
　PCR（ポリメラーゼ連鎖）反応を利用した食中毒菌の検出に関する論文は数多く存在するが、それぞれ記述内容が大きく異なっている。そこで、13の食中毒菌（<I>Escherichia coli</I>、<I>E.coli</I>-ETEC、<I>E.coli</I>-O157:H7、<I>Shigella</I> spp.、<I>Salmonella</I> spp.、<I>Yersinia enterocolitica</I>、Y. pseudotuberculosis、Vibrio cholerae、V. parahaemolyticus、V. vnlnificus、<I>Listeria monocytogenes</I>、<I>Staphylococcus aureus</I>、<I>Bacillus cereus</I>）について精度の良いポリメラーゼ連鎖反応による検出手法を確立した。
　シーフード（ザリガニ、ずわい蟹、サーモン、ヒラメ、ホタテ貝、カキ、ナマズ、エビ等）12種類とチーズ（クリームチーズ、ヌシャテルチーズ）2種類の14種類に102の食中毒菌種を接種した。今回の検討により、<I>E.coli</I>-O157:H7、<I>Yersinia pseudotuberculosis</I>、<I>Bacillus cereus</I>の3菌種はポリメラーゼ連鎖反応プライマーを新規に確立した。他の10菌種については既存のプライマーを修正し確立した。PCRの検出感度は大部分の食中毒菌において102程度であるが、赤痢菌のみ5×107であった。また、食品成分によるPCR反応の阻害はなかった。食品を単一の培地で培養し、一定のPCR条件で13種類の食中毒菌を検出できた。
　<I>B.cereus</I>とその同種の同定において誤った識別がなされる場合があった。今回、16SrRNA 部の特定DNAﾌﾟﾛｰﾌﾞを用いた<I>B.cereus</I>と<I>B.thuringiensis</I>の識別について検討を行った。農場、乳製品工場、牧場、食物から分離された20種は、従来からの生化学分析と今回の手法により解析したところ、従来法では、<I>B.cereus</I>と判断されていたものが16s　rRNAのV1部の特定DNAﾌﾟﾛｰﾌﾞを設計しPCR法による増幅でハイブリッド形成させることにより、<I>B.thuringiensis</I>であることが判明した。<I>B.cereus</I>と<I>B.thuringiensis</I>の16s rRNAのV1部の特定DNAﾌﾟﾛｰﾌﾞを設計しPCR法による増幅でハイブリッド形成させることにより、両者を迅速に区別することが可能になった\S(検査法 菌の同定法)#7-4\E。
