文献番号：b-60
タイトル：Epidemiology typing of <I>Bacillus cereus</I> by amplified fragment length polymorphism
邦訳タイトル：-
著者：Ripabelli G.
誌名､発行年、巻号頁：Letters in Applied Microbiology (2000), <B>30</B>, 358-363
菌種：2.<I>Bacillus cereus</I>
　
<ITEM1> \n調査の目的
 
Amplified fragment length polymorphism(AFLP)法でセレウス菌の疫学的分類を試みた。
　
<ITEM2> \n検体名
 
-
　
<ITEM3>
 
セレウス菌21株（15件の食中毒事例のときに分離された菌株）
　
 
<ITEM4> \n検査検体数
 
-
　
<ITEM5>
 
・セレウス菌の培養
　室温・暗所で寒天培地上に保存、37℃・5%馬血液加コロンビア寒天培地で終夜培養
・DNA抽出
　100～150mgの菌体細胞を1mlの冷生理食塩水で遠心洗浄し、60μlのイソアミルアルコールと0.3gジルコニアビーズを加えたL6緩衝液900 μlで懸濁させ、撹拌、室温放置後に遠心分離する。上清にシリカを加え、撹拌、室温放置後に遠心分離し、上清を除去してシリカをL2緩衝液で2回、80%冷エタノールで2回、冷アセトンで1回遠心洗浄後、56℃で10分間乾燥させる。
  100μlの滅菌蒸留水で再懸濁させ、56℃・5分間インキュベート後、遠心上清の230nm, 260nm, 280nmでの吸光度よりDNAの濃度、純度を定量する。
・制限酵素による消化、アダプターのライゲーション及びPCR
制限酵素はHindⅢを使用。アダプターはADH1とADH2(GIBCO社)を使用。PCRプライマーはHI-A,HI-C,HI-G,HI-T(GIBCO社)を用いた。反応条件は1サイクル目に94℃4分、以降94℃1分、60℃1分、72℃2.5分で35サイクル。増幅産物は1.5%アガロースゲル電気泳動を行った。 
　
<ITEM6>
 
・本法の再現性を評価するため、4℃・6週間保存したPCR産物の電気泳動を行ったところ、全ての場合において同じバンドパターンが得られた。
・菌株を20代継代培養する間、バンドパターンに変化はなく、独自のAFLPプロファイルを生じた。
・セレウス菌を用いたAFLP法は、再現性があり、全ての菌株の分析で応用が可能である
・異なる食中毒事例で分離された菌株は、全て異なるAFLPパターンを示した。
・同じ食中毒事例で分離された菌株はおおむね同じAFLPパターンをしめした。しかし全てではなかった。
　
<ITEM7>
 
Letters in Applied Microbiology ,30, 358
　
<PUBMED>

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/query?form=4&db=m&Term=Letters in Applied Microbiology ,30, 358
