文献番号：s-61
タイトル：Demonstration of intracellular <I>Staphylococcus aureus</I> in bovine mastitis alveolar cells and
　　　　　 macrophages isolated from naturally infected cow milk.
邦訳タイトル：自然感染したｳｼの乳汁から単離したウシ乳房炎乳腺胞細胞およびマクロファージにおける細胞内
　　　　　　　<I>Staphylococcus aureus</I>の証明
著者：HEBERT A, SAYASITH K, SENECHAL S, DUBREUIL P, LAGACE J
誌名､発行年、巻号頁：FEMS Microbiology Letters　(2000), <B>193</B>, (1), 57‐62 
菌種：1.<I>Staphylococcus aureus</I>
　
<ITEM1> \n調査の目的
 
自然感染で慢性乳房炎を発症しているウシの乳汁から胞状細胞とマクロファージを単離し,細胞内に生きた<I>S.aureus</I>が存在しているかどうかを検証する｡
　
<ITEM2> \n検体名
 
18頭のホルスタイン牛からの18乳試料
　
<ITEM3>
 
乳房を殺菌後、手で滅菌ボトルに200ml採取し、-20℃で凍結保管
　
 
<ITEM4> \n検査検体数
 
-
　
<ITEM5>
 
1)蛍光活性化セルソーティング(FACS)分析による細胞の単離。乳試料を22℃で2000rpm10分遠心分離して全細胞を集める。ペレットをPBSで4回洗浄後1.5mlのPBSに再懸濁し、この細胞懸濁液500μlに20μlの抗シトケラチンFITCモノクローナル抗体(CAM 5.2)あるいは抗ヒトCD14PEモノクローナル抗体(M5E2)と室温で30分間処理する。コントロールは抗体を用いずに処理する。PBSで洗浄後、遠心分離して細胞を集める。FACSを用いて胞状細胞及び食細胞を分離し、外来細菌や核酸を除くため、抗生物質や溶菌酵素,DNAｱｰｾﾞIを含む緩衝溶液で処理する。処理後に遠心分離分離して細胞を集め、-70℃で保存する。2)胞内生存細胞検出のための細菌学的分析。上記処理乳試料を解凍後、血液寒天平板に蒔き37℃で一夜培養後、標準生化学的方法で同定する。3)PCR分析。分離した細胞より抽出したDNA　5μlを100μlのPCR緩衝液に加え、PCR増幅を実施した。4)DNA放射標識及びハイブリッド形成。増幅DNAサンプル20μlを1.2%寒天ゲルで電気泳動し、変性と中和後DNAをnylon-Hybond膜にサザンブロット法に従って転写する。5‘-端放射標識したオリゴヌクレオチドプローブAHでハイブリッド形成させ、膜を洗浄後、X線フィルムに-70℃で暴露する。
　
<ITEM6>
 
抗CD14抗体を用いたFACS分析でサンプル乳中35.5%の細胞がマクロファージであった。CAM5.2抗体を用いたFACS分析でサンプル乳中13.6%の細胞が胞状細胞であった。FACSにより分離した細胞の血液寒天による<I>S.aureus</I>増殖結果は、<I>S.aureus</I>はマクロファージや胞状細胞に取り込まれた後でも増殖することができることを示した。細胞からDNAを抽出し、PCRによる細菌DNAの増幅を行い,これをサザンハイブリダイゼーション法で解析した結果、<I>S.aureus</I>に特異的なDNAが検出された｡<I>S.aureus</I>感染牛乳汁から分離した胞状細胞やマクロファージ内に、生きた<I>S.aureus</I>やそのDNAが存在することを始めて証明した。
　
<ITEM7>
 
FEMS Microbiology Letters, 193, 57
　
<PUBMED>

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/query?form=4&db=m&Term=FEMS Microbiology Letters, 193, 57
