文献番号：s-58
タイトル：Multiplex polymerase chain reaction assay for simultaneous detection of
　　　　　<I>Staphylococcus aureus</I> and Streptococcal causes of bovine mastitis
邦訳タイトル：ウシ乳房炎の原因菌<I>Staphylococcus aureus</I>およびStreptococcusを同時検出するための
　　　　　　　多重PCR法
著者：PHUEKTES P, MANSELL P D, BROWNING G F
誌名､発行年、巻号頁：Journal of Dairy Science　(2001), <B>84</B>, (5), 1140‐1148
菌種：1.<I>Staphylococcus aureus</I>
　
<ITEM1> \n調査の目的
 
4つの主な乳房炎原因菌（<I>S.aureus</I>,<I>S.agalactiae</I>.S.dysgalactiae,<I>S.uberis</I>）の同時検出法として、16Sから23S rRNAスペーサー領域の増幅に基づく多重PCRを開発する。
　
<ITEM2> \n検体名
 
オーストラリアSouth Gippslandの潜在感染牛群から採取した117のミルク試料
　
<ITEM3>
 
乳採取前に乳首を70%エタノール浸漬綿布でぬぐう。始めの乳は捨て、約5mlの乳を滅菌プラスチック容器に採る。乳試料は採取36時間以内に -20℃で凍結させ分析実施まで保存した。
　
<ITEM4> \n検査検体数
 
-
　
<ITEM5>
 
1)菌株。コントロールの<I>S.aureus</I>,<I>S.agalactiae</I>.S.dysgalactiae、<I>S.uberis</I>は乳房炎罹患牛から分離した。
2)オリゴヌクレオチドプライマー。全てのオリゴヌクレオチドプライマーは公表されたシーケンスによる。開発したプライマーは表1に示す。
3)PCRと多重PCRの特異性。PCRプライマーの特異性は、乳試料中に普通に見られる菌種（<I>S.epidermidis</I>、<I>S.intermedius</I>、Enterococcus　faecalis、<I>E.coli</I>、S.bovis、S.zooepidemicus、<I>M.bovis</I>）で調べた。
4)PCRと多重PCRの感度。<I>S.aureus</I>、<I>S.agalactiae</I>、S.dysgalactiae、<I>S.uberis</I>からの精製DNAの10倍希釈列を用いて各PCR法の感度を決定した。
5)PCR感度の決定。<I>S.aureus</I>、<I>S.agalactiae</I>、S.dysgalactiae、<I>S.uberis</I>を加えた乳試料を用いて、PCRの感度と各抽出法の感度を調べた。
6)乳試料DNAのフェノール-クロロホルム抽出。300μlの乳試料を300μlの0.5%SDSと100μl/mlのプロテイナーゼKを含むNTEバファー（0.1MNacl,20mMトリス-塩酸[pH7.4],1mMEDTA[pH7.4]）と混合し、37℃4時間インキュベートし、等量のフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（25:24:1）を加え3分混合した後に、10,000xg 3分間遠心分離し上層を集める。この操作を2回繰り返す。上層を集め60μlの3M酢酸Na(pH4.8)と1.2mlの冷100%エタノールを加え、-20℃で30分保持してDNAを沈澱させる。次に4℃で10,000xg15分遠心分離でDNAを回収し、70%エタノールで洗い、10,000xg5分間室温で遠心分離する。DNAは風乾後50μlのTEバッファーで溶解させる。
7)乳試料DNAのスピンカラム抽出。各乳試料100μlを1%2-メルカプトエタノールを含む350μlのRLTバッファーと激しく混合後300μlの100%　　エタノール続いて15μlのQiaexⅡmatrixを加える。これをスピンカラムにアプライし、9,000xg、30秒遠心分離する。600μlのRLTバッファーでカラムを洗い、続いて500μlのRPEバッファーで2回洗う（9,000xg･30秒遠心分離）。さらに16,000xg、1.5分遠心分離し、過剰のエタノールを除く。30μlのRNaseフリー水をマトリックスに直接のせ、9,000xg、1分遠心分離してDNAを溶出させる。
8)PCR産物の分析　　　増幅産物12μlを0.1μg/ml臭化エチジウムを含む2%寒天ゲルで電気泳動（0.5xTPEバッファー中6V/cm　45分）する。PCR産物は紫外光で可視化し、増幅産物7μlを20%PAGE分析（6V/cmで2時間電気泳動後銀染色）、分子量マーカーにはプラスミドpU18のHaeⅢ制限エンドヌクレアーゼ分解物および50bpステップラダーを用いた。
　
<ITEM6>
 
多重PCRの感度は従来法の培養法より検出感度が低かったが、DNA抽出の前に濃縮することにより感度が改良された。阻害物質が希釈されたことおよび菌数が増加したことによる。その結果、<I>S.aureus</I>,<I>S.uberis</I>の検出は従来法よりも感度が高くなり、<I>S.agalactiae</I>,S.dysgalactiaeの検出感度は従来法と同等であった。多重PCR法は、乳汁中の4菌の同時検出を迅速に,高感度にでき、ルーチンの診断法に利用できると思われた｡
　
<ITEM7>
 
Journal of Dairy Science, 84,1140
　
<PUBMED>

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/query?form=4&db=m&Term=Journal of Dairy Science, 84,1140

<LIST1>

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