文献番号：s-73
タイトル：Detection and analysis of Staphylococccal enterotoxin A in food by western immunoblotting
邦訳タイトル：ウェスタンイムノブロッティングによる食品中ブドウ球菌エンテロトキシンAの検出と分析
著者：Rasooly A, Rasooly R S
誌名､発行年、巻号頁：International Journal of Food Microbiology　（1998）, <B>41</B>, (3), 205-212
菌種：1.<I>Staphylococcus aureus</I>
　
<ITEM1> \n調査の目的
 
食品中のトキシン検出法として、無関係な抗体との交差反応や加熱処理した食品には使えないといったELISA法の欠点を補うものとして、ウェスタンイムノブロッティング法の評価を行う。
　
<ITEM2> \n検体名
 
S. aureusATCC13565を接種したマッシュルーム及び　S. aureusエンテロトキシンA(SEA)で汚染させたマッシュルーム、牛乳、ポテトサラダ、肉製品
　
<ITEM3>
 
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<ITEM4> \n検査検体数
 
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<ITEM5>
 
1)菌株と接種。S. aureusATCC13565をBHIブロスで37℃振とう培養し、マッシュルーム缶詰（226g）の内容物に約E+6細胞/mlで接種する。接種マッシュルームは滅菌フラスコに移し37℃で5時間振とう培養する。時間を追ってサンプリングし、菌数をカウントする。缶詰内容を121℃20分オートクレーブする。
2)サンプル調製。2gのマッシュルームをホモゲナイズし、等容の水を加える。各1容のランニングバッファーとサンプルバッファーを加え、それをゲルにのせる。牛乳はゲルの変形をさけるために水で1：10に希釈する。ポテトサラダと肉製品はホモゲナイズし、SEAで汚染させ(2ng/40μl)、40μlをSDS-PAGEに用いる。
3)SDS-PAGEとイムノブロッティング。12.5%SDS-PAGEゲルにのせる前に、サンプルを90℃で2分加熱する。Bio-Radミニゲル装置を用い、150Vで2時間泳動させ、ニトロセルロース膜に400mAで60分電気転写させる。膜はトリス-Tween20で20分ブロックし、ウサギ抗SEAと2時間インキュベートする。膜は洗浄し、山羊抗ウサギ-アルカリホスファターゼ-コンジュゲートと2時間インキュベートする。洗浄後、BCIP/NBT、アルカリホスファターゼ基質溶液、を発色試薬として用いる。
　
<ITEM6>
 
 試験用試料は可溶化や前処理せず単に均一化するのみで良い。 SEAの検出阻界は100pg/mlである。SEAバンド強度をデンシトメーターで測定したところ、SEAシグナルは0.1-100ng/mlの範囲でSEAの量と比例していた。本法はきのこ、乳、じやがいもサラダ、肉製品を含む食品中未変性及び変性SEAを同定できる。さらにSEAはきのこ中と同様にBHI培地中対数増殖期の中間期で分泌されることが分かった。実用上、本法とELISA法は互いに補完しあうものである。一般に、初期スクリーニングはELISAで行われ、不明瞭あるいは陽性の場合ウェスタンブロットを用いて再検査される。
　
<ITEM7>
 
International Journal of Food Microbiology, 41, 205
　
<PUBMED>

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/query?form=4&db=m&Term=International Journal of Food Microbiology, 41, 205

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