Ⅰ．農場
　
1.農場における汚染実態
　生乳は無菌的に搾乳しても、各種の病原菌を含んでいます。これは乳房内での汚染（一次感染）に由来します。一次感染の経路には、乳頭口や乳房の外傷などから上行する経路（ブドウ球菌、レンサ球菌、腸内細菌など）と経口、経鼻、生殖器感染した病原菌が下行的ルートを経て乳房にたどり着く経路（リステリア菌、サルモネラなど）があります。二次汚染は搾乳器、ヒト、土壌などによるものです。
　乳房炎の発生原因の最も多い起因菌は、黄色ブドウ球菌であり、バルク乳での汚染率は22.2から83.3％と地域によって汚染率が異なっています。黄色ブドウ球菌検出乳は正常バルク乳に比較し、衛生的乳質が悪く、体細胞数、耐熱性細菌数が多い。
　ヤギ、ヒツジ、ウシの生乳中の総菌数は、ヤギ乳で7.7x106cells/ml、ヒツジ乳で2.7x10E6cells/ml、牛乳で1.9x10E7cells/mlであった。また、<I>Staphylococcus aureus</I> は、ヤギ乳では検出されず、ヒツジ乳で16%に100cells/ml、牛乳で26%に80cells/ml検出された。<I>Salmonella</I>e はそれぞれの乳で、検出されなかった\S（農場 汚染実態）#1-1\E。また、バルク乳中の総菌数（DMC）は耐熱性菌数（LPC）、環境性レンサ球菌（E.Stre）、シュードモナス菌数（PD）と有意に相関し、生菌数（SPC）はLPC、SA（黄色ブドウ菌数）、E.Stre、PDと有意に相関した。体細胞数（SCC）は40万/ml以上の30検体につき検討したところ、SAと1％水準で有意に相関した。PL陽性分房乳64検体中SA検出率は40％、SAの検出率が高い牛のSCCは高い傾向があり、SAが潜在性乳房炎の原因菌であると考えられた。搾乳評価点が低い農家ほど牛群の平均SCCが高い傾向があり、搾乳技術レベルが乳房炎発生を左右することが再確認された。また、搾乳評価点が低いほどバルク乳の品質評価点が低下する傾向が見られた\S（農場 汚染実態）。#1-1\E
　未殺菌乳78検体の中温好気性菌数は、log 4～7.17　cfu/mlであり平均はlog 5.59 cfu/mlであった。黄色ブドウ球菌は、46.9%存在し平均菌数は、log 4.69±0.5 cfu/mlであり最大値は、log 5.99 cfu/mlであった\S（農場 汚染実態）#1-1\E。
　中国の12カ所の酪農家から採取した生乳及び貯蔵タンク内の黄色ブドウ球菌の汚染率は生乳で39.1%、貯蔵タンクで63%と極めて高く、汚染菌数は殆ど（約95%）は102-104cfu/mlであったが、5％は＞104cfu/mlであった。この結果から、生産農家における乳牛の飼育、搾乳などの十分な衛生対策と生乳保存などの衛生管理が必要であると考えられた\S（農場 汚染実態）#1-1\E。
　8カ所のミルクセンターから集めた175のバルクミルク、287のコンポジットミルク、酪農家の手と鼻からのふき取り検査を行った。バルクミルクでは100%、コンポジットミルクからは97.6%、<I>S.aureus</I>が確認され、搾乳後の乳の取扱いが汚染の原因ではないかと考えられた\S（農場 汚染実態）#1-1\E。
　健康牛乳汁と慢性乳房炎牛乳汁から得られた乳汁169検体の黄色ブドウ球菌は大差なく高頻度で黄色ブドウ球菌とコアグラーゼ陰性ブドウ球菌が分離された\S（農場 汚染実態）#1-1\E。
　
乳首・乳頭汚染
　ホルスタイン種雌牛の泌乳中期となる6頭の乳頭表面から分離された細菌は黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性のブドウ球菌、レンサ球菌などであった｡2種類以上の細菌が分離された検体もあった\S（農場 制御）#1-4\E。
　乳房炎は酪農の宿命であり、自分の子供を育てるだけの乳を生産している動物に乳房炎はなく、過大な量の生乳生産をするように改良された乳牛は乳房炎になりやすいと言われています。
　岩手県、千葉県、長野県、愛知県、広島県および宮崎県において、乳房炎牛79頭の乳汁から<I>Staphylococcus</I>属菌397菌株を分離し、このうち50菌株の<I>S.aureus</I>を同定した。この<I>S.aureus</I>分離株コアグラーゼ型別およびエンテロトキシン型別では3つに分類され、コアグラーゼ遺伝子型別のRFLP型別では6つに細分化された。乳房炎牛の乳汁から分離した<I>S.aureus</I>において、コアグラーゼ遺伝子多形は、コアグラーゼ型別やエンテロトキシン型別より厳密な分類法であることが示唆された\S（農場 汚染実態）#1-1\E。
　食中毒例、健康人、牛乳房炎・牛乳より分離した144株について、黄色ブドウ球菌株のエンテロトキシン(SE)遺伝子保有状況を調査した。seg,seh,sei遺伝子は高頻度で認められ、特に、segとseiをともに保有している菌株が多数検出された。牛乳房炎・牛乳由来株は特定遺伝子を保有の傾向が見られた\S（農場 汚染実態）#1-1\E。
　また、乳房炎から分離された<I>S.aureus</I>の血清型の罹患率を調べた結果、分離した107種の<I>S.aureus</I>のうち血清型5と8は24.2%を占めたにすぎなかった｡残りの81分離株のうち50株は336型であると同定された｡26の分離株は2種の血清型と反応したが、5種は型決定にいたらなかった\S（農場 制御）#1-4\E｡
　国内酪農家29戸のバルク乳中のブドウ球菌の調査を実施した。<I>S.aureus</I>検出異常乳が年4回中1回以上の酪農家は11戸（37.9%）、1回だけは1戸、4回すべて異常を示した酪農家は5戸であった。コアグラーゼ陰性ブドウ球菌(CNS)検出異常乳が1回以上の酪農家は28戸（96.6%）、1回だけは6戸、4回すべて異常を示した酪農家は1戸であった。<I>S.aureus</I>異常バルク乳は正常バルク乳に比較して衛生的乳質が悪く、体細胞数、耐熱性細菌数が多い。又、CNS異常バルク乳では体細胞数が多かったことから、バルク乳の本菌汚染は搾乳器具などの汚染による2次的な混入ではなく、乳房内の感染に原因するものと考えられた\S（農場 汚染実態）#1-1\E。
　
2.農場における増殖特性
　搾乳直後の生乳には細菌生育を抑制する作用があることが知られています。オーストラリア乳業会社より入手した生乳の<I>S.aureus</I> 、<I>S.entertidis</I>及び<I>L.monocytogenes</I>に対する生乳の抗菌活性を調べた。<I>S.aureus</I> と<I>S.entertidis</I> は初めの24～32時間は＞10E8cfu／mlまで増殖したが、以後滅少傾向を示し、<I>S.aureus</I> と <I>S.entertidis</I> は、72時間後にそれぞれ10E4cfu／mlと10E5cfu／mlとなった。また、<I>L.monocytogenes</I>は、初め12時間は遅い速度で発育し、以後急速に減少し56時間では検出されなくなった。pHは、いずれも72時間後にはおよそ4．0に低下した。生乳のこれらの菌に対する阻害効果は、乳中に自然に存在するH2O2産生微生物によるLactperoxidase system(LPS)の活性化によるものと考えられた。各菌の阻害程度の違いは、細胞壁構造の違いあるいはLPSによるダメージを中和あるいは修復する能力の違いによるものと考えられる\S（農場 増殖特性）#1-2\E。
　ヤギ、ヒツジ、ウシの乳中の総菌数は、ヤギ乳、7.7x10E6cells/ml、ヒツジ乳、2.7x10E6cells/ml、牛乳、1.9x10E7cells/ml であった。また、<I>S.aureus</I> は、ヤギ乳では検出されず、ヒツジ乳で16%に100cells/ml、牛乳で、26%に80cells/ml検出された。<I>Salmonella</I>e はそれぞれの乳で、見つからなかった。<I>S.aureus</I> の増殖実験では、100mlづつ使用し、3回行った。それぞれ、10E4cells/mlになるように調製し、17℃と31℃で行った。エンテロトキシンA 産生<I>S.aureus</I> の増殖は、31℃で6時間後、17℃で18時間後に最大の菌数になった\S（農場 汚染実態）#1-1\E。
　
3.農場における毒素産生
　生乳（中国12ヵ所の酪農家）から分離した135株中46株(34%)がSE産生性を示し、SE型はA(37%)、B（13%）、C（43%）単独産生性を示すものが多かった（約93%）。以上のごとく、生乳から分離した<I>S.aureus</I>株のSE産生性はC型及びA型が多く見られた。他にA、B産生混合型が2株とC、D産生混合型が1株存在した\S（農場 毒素産生）#1-3\E。
　一方、ナイロビ周辺のケニア共同クリーム製造所に入荷した生乳中のエンテロトキシンAの汚染実態を調査した結果、培養を行った201サンプル中120サンプル（120/201、約60%）で、凝集素陽性<I>S.aureus</I>が検出され、そのうち83サンプル（83/120、約69％）でエンテロトキシンAの産生が認められた。凝集素陰性のブドウ球菌が検出された67検体では、全てでエンテロトキシンAの産生は認められなかった\S（農場 汚染実態）#1-1\E。また、インドのKanalで収集した生乳から分離した<I>S.aureus</I>株のエンテロトキシン産生比率は2.1%であった\S（農場 汚染実態）#1-1\E。
　8カ所のミルクセンターから集めた175のバルクミルク、287のコンポジットミルク、酪農家の手と鼻から単離した<I>S.aureus</I>株のうち、バルクミルクでは42.9%、コンポジットミルクでは47.3%、酪農家からは45.2%が毒素を産生した\S（農場 汚染実態）#1-1\E。
　乳汁から分離された黄色ブドウ球菌48株のエンテロトキシン(SE)生産性、毒素性ショック症候群毒素（TSST-1）産生性を検討した結果、コアグラーゼ型はⅥ型が16株、SEはC型産生性が11株と最も多く認められ、TSST-1は13株に認められた。今回検査に用いた黄色ブドウ球菌はコアグラーゼⅥ型、SEC産生性、TSST-1産生性の株が48株中10株と最も多く認められた\S（農場 汚染実態）#1-1\E。
　健康牛乳汁と慢性乳房炎牛乳汁からは大差なく高頻度で黄色ブドウ球菌とコアグラーゼ陰性ブドウ球菌が分離された。分離した黄色ブドウ球菌とコアグラーゼ陰性ブドウ球菌は、いずれも高率に腸管毒素と毒素性ショック症候群毒素－1を産生した。また、黄色ブドウ球菌の産生する腸管毒素の中で、エンテロトキシンC（SEC）が重度な乳房炎症状を示す乳房で高率かつ高濃度に産生されていた。
　牛乳房炎・牛乳より分離した黄色ブドウ球菌株のエンテロトキシン(SE)遺伝子保有状況を調査した。牛乳房炎・牛乳由来株は特定遺伝子を保有の傾向が見られた。Seg、sehおよびsei遺伝子が高い頻度で認められた。特にsegおよびseiを共に保有している菌株が多数検出された。seh保有株はほとんどがSEHを200～700ng/mlを産生した。segおよびsei保有株は、少量（＜10～36ng/ml）の毒素を産生した\S（農場 毒素産生）#1-3\E。
　ヒト（健康体保菌者、病院患者）から採取された66種の黄色ブドウ球菌の82%がエンテロトキシンA又はBを産生した。このうち、11%がA、Bともに産生した。一方、食中毒とは関係の無い食品の33%から、コアグラーゼ陽性黄色ブドウ球菌が検出され、このうち47%がエンテロトキシンAまたはBを産生したが、双方を産生したものは無かった\S（農場 汚染実態）#1-1\E。
　
4.農場における制御
　搾乳直後の生乳には細菌抑制作用があり、3～4日間は有効に作用することが報告されています。オーストラリア乳業会社より入手した生乳（搾乳後24～72時間貯蔵後）の<I>S.aureus</I>、<I>S.entertidis</I>及び<I>L.monocytogenes</I>に対する生乳の抗菌活性を調べた。生乳に接種した菌量は約10E4cfu/mlで<I>S.aureus</I>と<I>S.entertidis</I>は初めの24～32時間は＞108cfu/mlまで増殖したが、以後滅少傾向を示し、72時間後に<I>S.aureus</I>と<I>S.entertidis</I>は、それぞれ104cfu/mlと105cfu/mlとなった。また、<I>L.monocytogenes</I>は、初め12時間は遅い速度で発育し、以後急速に減少し56時間では検出されなくなった。pHは、いずれも72時間後にはおよそ4.0に低下した。生乳のこれらの菌に対する阻害効果は、乳中に自然に存在するH2O2産生微生物によるラクトパーオキシダーゼ（ラクテニン2）によるものと考えられた。各菌の阻害程度の違いは、細胞壁構造の違いあるいはLPSによるダメージを中和あるいは修復する能力の違いによるものと考えられる\S（農場 制御）#1-4\E。
　潜在性乳房炎牛に南瓜子を主成分とする植物多糖体を含むC-UPⅢを投与し、血中マクロファージの貧食率及び貧食数から貧食能を測定し、<I>S.aureus</I>による潜在性乳房炎の抑制効果を検討した。泌乳期乳牛135頭の各分房で<I>S.aureus</I>が検出された15頭にC-UPⅢ20g/頭/日を配合飼料に添加し40日間連続投与した。C-UPⅢ投与5日後では体細胞数（SCC）は有意に減少した。<I>S.aureus</I>感染牛の分房数は投与前の27分房から投与5日後には19分房、40日後には14分房に減少した。<I>S.aureus</I>感染牛7頭中4頭では投与後40日で全てのS. aureusは検出されず、残りの3頭中2頭で検出分房が減少した。尚、供試牛のMΦの貧食率は投与前の70.7％から投与40日後には78.7％に、貧食数は1392個から1995個と貧食率及び貧食数ともに増加した\S（農場 制御）#1-4\E。
　実験的なマウスを用いて、黄色ブドウ球菌の莢膜多糖体(CP)に<I>Pseudomonas aeruginosa</I>菌体外毒素A(ETA)に結合させたCPタイプ8ワクチンの<I>S.aureus</I>菌血症に対する防御効果を検討した。菌血症防御の評価は、マウスをPBSあるいはCP8-ETA複合体で免疫後、2×10E5CFUの<I>S.aureus</I>　5型あるいは8型を腹腔内負荷し、7日以内の死亡数を記録した。免疫した株と同じ株を用いて負荷したマウスは、異なる株負荷したものに比べて腎臓内の<I>S.aureus</I>の数が少なかった｡CP8-ETAあるいはPBSで免疫後<I>S.aureus</I> 8型を負荷する実験において、CP8-ETAで免疫したマウスは12匹中9匹（75％）が7日間生存し、PBSで免疫したマウスはわずか3匹（33.3％）であった。CP8‐ETA複合体で免疫したマウスではCPs‐Freund’sアジュバントあるいはPBSで免疫したものより有意に高い抗体価が得られた｡以上より、CP8‐ETAワクチンは実験的なマウスの<I>S.aureus</I>菌血症に対して防御効果を示す可能性のあることが示された\S（農場 制御）#1-4\E。
　埼玉県畜産センターで飼育しているホルスタイン種雌牛の泌乳中期となる6頭について、ヨード系ディッピング用薬剤を用いて搾乳前に乳首殺菌するプレディッピング法の、殺菌効果及び乳量と乳質に与える影響を検討した。前絞り後、ヨード系ディッピング剤に乳首全体を浸けて、薬液を作用させる時間として空気中に30秒さらし、ペーパータオルで薬剤が残らないように拭き取った後、ライナーを装着し搾乳した。コントロールは逆性石けん製剤入り温湯を用いた。　　
　個体乳の日乳量、乳脂肪率、無脂乳固形分率、乳蛋白質率、乳糖率、体細胞数、生菌数も両区に有意な差はみられなかった。乳首表面の細菌検査において、5ヶ月間の平均値で比較すると、試験区はコントロールに比べて有意に低い値を示した。搾乳前の乳頭が清潔で殺菌され乾燥していることが重要となることから、プレディッピングによる乳頭殺菌は乳房炎防御の一助となると思われた\S（農場 制御）#1-4\E。
　生乳中の汚染菌数が少ないほど細菌が増殖しにくい性質がある。このために生乳中の細菌数を制御するには、乳牛の健康管理や予防接種などによる分房内感染（一次感染）予防と搾乳器具の洗浄や乳房・乳頭の衛生管理による二次感染予防、あるいは一次・二次汚染対策につながる牛舎内環境の衛生管理による汚染細菌の絶対数を減少させることや、搾乳直後に急速冷却して細菌の発育適温以下に乳温を下げることが細菌増殖を抑制する方法として有効である。
