Ⅶ．検査法
　
毒素検出
　食品内毒素型食中毒である黄色ブドウ球菌食中毒の唯一の確定診断法は食品中からのエンテロトキシンを検出することです。しかし、PCR法で毒素遺伝子が検出されても、原因菌が食品内で増殖したことの証明にはなりません。実際にPCR陽性でも毒素が検出できない事例もあり、PCR法の結果のみで原因を特定すべきでないと言われています。
　エンテロトキシン（SE）の検出法には、免疫学的検出法、ゲル内沈降反応、生物学的検出法などがあります。広く用いられているのは免疫学的検出法の逆受身ラテックス凝集反応\S（検査法 毒素検出 市販キット）#7-1-5\Eや酵素抗体法(ELISA)であり、検出感度も1ng/mlと高い。
　通常の食中毒原因食品では希釈しても、エンテロトキシンを検出できます。しかし、1985年に起きた米国チョコレートミルク食中毒ではチョコレートミルクから0.40～0.78 ng/mlの毒素が、また2000年に起きた低脂肪乳食中毒でも毒素濃度は0.38 ng/mlと予想以上に低い。高濃度の蛋白質（カゼイン、乳清等）や、脂質、糖質を含む牛乳などから微量のタンパク毒素を効率よく検出するためには、酸処理（酸沈殿や等電点沈殿）によるカゼイン等のタンパクを、クロロホルム処理で脂質を除去し、更に濃縮する必要があります。チーズ中のエンテロトキシンをVIDAS SET キットを用いて、トリクロロ酢酸（TCA）沈殿法と30%ポリエチレングルコールによる抽出法を比較した結果、どちらの抽出法でも0.5ng/mlレベルで各セロタイプのエンテロトキシンを検出した。しかし、TCA沈殿法の方が高い回収率を与え、チーズサンプルをTCAと2時間接触させておいても偽陰性を示すことも無かった。また、乳製品中のエンテロトキシンを検出するためには、濃縮は必要不可欠である\S（検査法 毒素検出 酵素免疫測定法）#7-1-2\E。
　一方、濃縮操作なしに牛乳等からエントロトキシンを検出した報告があります。牛乳及び脱脂乳を培地として、S. aureus を10E5個/ml接種し、37℃で18時間振とう培養後にエンテロトキシンをELISA法で定量した結果、牛乳、脱脂粉乳からエンテロトキシンA、B、Cを1 ng/mlの感度で検出した。牛乳中のエンテロトキシンは1 ng/ml～20μg/mlの範囲で濃縮をすることなく検出された。また、牛乳も脱脂乳もS. aureusの培地として差は認められず、どちらでもほぼ同量のエンテロトキシンが産生された\S（検査法 毒素検出 酵素免疫測定法）#7-1-2\E。更に、ELISA法での固相の評価を行ったところ､マイクロタイタープレートよりポリスチレンボールを用いた方が検出感度が高い結果が得られた\S（検査法 毒素検出 その他）#7-1-6\E。
　最近、高感度の検出法がいくつか開発された。MPC(microsphere-packed capilllary)  ELISA法はハム、チーズ、鶏肉すべてで1ng/g食品のSEAを容易に検出できた。従来の市販キットによる測定は3～24時間を要したが、本法は10分で測定できた。MPC ELISA法は複数のエンテロトキシン検出部を組み込むことにより、これらの同時検出及び同定ができる可能性を持つ検出法である\S（検査法 毒素検出 酵素免疫測定法）#7-1-2\E 。
　新たに確立した間接ダブルサンドイッチELISA法は0～1 ng/gチーズの間で直線性があり、検出限界は0.01 ng/gチーズ、定量限界は0.04 ng/gチーズであった。併行精度の変動計数は3.1～6.2%、室内再現精度の変動計数は4.7～11.0%であった\S（検査法 毒素検出 酵素免疫測定法）#7-1-2\E及び\S（検査法 菌数計測）#7-3\E。また、ラジオイムノアッセイ法（RIA）による検出法は、24時間以内に0.3ng/g食品の感度でエンテロトキシンを検出できた\S（検査法 毒素検出 その他）#7-1-6\E。
　エンテロトキシンの検出法で、広く利用されている4種類の市販のキットを比較した。サンドイッチELISA（ビーズ）、逆受身ラテックス凝集法キット（RPLA法）、ゲル拡散法、マイクロプレートELISA法の4法を用いて、食中毒事件の原因食品からエンテロトキシンAの検出を行った結果、市販ELISAキットでは15件の原因食品からエンテロトキシンを検出することができた。この15件のうち13件では<I>S.aureus</I> 10E6個/g以上存在したが、残りの2件（チーズサンプル）では<I>S.aureus</I>は検出されないにもかかわらずエンテロトキシンAが検出された。また、マイクロプレートELISAでも同様であった。RPLAキットでは15件中12件の食品からエンテロトキシンAが検出された。ゲル拡散法ではELISA陽性であった9件の食品の6件でエンテロトキシンを検出できた。　
　いずれのキットも<I>S.aureus</I>量が700～10E6個/gの範囲の食品からはエンテロトキシンAを検出できなかった。上述の4種類の市販キットを比較した結果、食品中のエンテロトキシンAの検出法としてはRPLA法が簡便であるものの、感度的にELISA法が必要な場合もある\S（検査法 菌数計測）#7-3\E。
　また、食品中の毒素検出法として、非特異的な交差反応（false negativeやfalse positive）や加熱処理した食品には使えないといった免疫学的検出法（ELISA法など）の欠点を補うものとして、ウエスタンイムノブロッティング法の評価を行った。サンプルはエンテロトキシンAで汚染させたマッシュルーム、牛乳、ポテトサラダ、肉製品で試料は可溶化や前処理せず単に均一化するのみで良い。 SEAの検出阻界は100pg/mlで、エンテロトキシンAのバンド強度をデンシトメーターで測定したところ、エンテロトキシンAのシグナルは0.1-100ng/mlの範囲でエンテロトキシンAの量と比例していた。本法はきのこ、乳、じやがいもサラダ、肉製品を含む食品中未変性及び変性エンテロトキシンAを同定できた。さらにエンテロトキシンAはきのこ中と同様にBHI培地中対数増殖期の中間期で分泌されることが分かった。実用上、本法とELISA法は互いに補完しあうもので、一般に、初期スクリーニングはELISAで行われ、不明瞭あるいは陽性の場合にウェスタンブロットを用いて再検査される\S（検査法 毒素検出 ウェスタンイムノブロッティング法）#7-1-3\E。さらに、ウエスタンイムノブロッティングの欠点である、試料サイズが小さいこと及び試料に含まれる蛋白質によりSDS-PAGEが妨害を受けるという問題を克服するために、トロイダルコイル向流クロマトグラフィーをウェスタン免疫ブロットと組み合わせて用いる方法について評価した。エンテロトキシンAを添加した牛乳からエンテロトキシン抽出に向流クロマトグラフィー（CCC）を実行するためにトロイダルコイル遠心分離を採用した。画フラクションの一部をSDS-PAGEで分析すると主に画分40-48にSEAが見られ、未処理の試料に見られたようなゲル易動度のゆがみはなかった。SEAを含む画分(40-48)を集めて限外ろ過により濃縮し、ウエスタンイムノブロッティングﾞで再チェックした結果、大部分の蛋白質がこの画分から除かれて、エンテロトキシンﾞの感度は上昇し、エンテロトキシンAシグナルは約11倍強くなっていた\S（検査法 毒素検出 ウェスタンイムノブロッティング法）#7-1-3\E。
　
毒素検出法
その他
　新しいタイプのエンテロトキシン検出法も報告されています。
　一つはエバネッセント波バイオセンサーを用いた食品中のブドウ球菌エンテロトキシンA(SEA)のリアルタイム検出システムで、ホットドッグ、ポテトサラダ、ミルク、マッシュルームといった複雑な食品系でも、エンテロトキシンAを検出することが可能であった。 精製エンテロトキシンA及びエンテロトキシンA添加食品の両方において、感度は10～100ng／gで、ネイティブなエンテロトキシンAのみ検出し、熱変性した非活性のエンテロトキシンAは検出しなかった。エバネッセント波バイオセンサー分析は食品加工中の連続監視に適している\S（検査法 毒素検出 酵素免疫測定法）#7-1-2\E。
　もう一つは表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサーを用いて、 食品中の黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)をリアルタイムで分析できるシステムを開発した。抗体チップはBiacore CM5チップの表面のカルボキシメチル-デキストランに抗エンテロトキシンB 抗体を共有結合させ作製した。先ず、サンプルを注入して目的抗原をチップ表面に結合させ、非結合物を洗い去った後にエンテロトキシンB に対する第2抗体を注入し、捕捉抗原に結合させる。非結合物を洗浄後、チップ表面での結合をモニターする。抗体チップは少なくとも70回使用した。純粋なエンテロトキシンB と同様に、乳及び食肉に添加したエンテロトキシンB を検出でき、また｡食品マトリックスによる妨害影響は少なかった｡ 第2抗体を用いたサンドイッチ法により応答信号は増加し、エンテロトキシンB の検出下限は10ng/mlであった。 洗浄及びチップﾟ再生を含む計測の所要時間は1抗体を用いた場合に5分、2抗体を用いた場合に8分であった｡以上のことから、本分析法は食品中のエンテロトキシンBをリアルタイムに分析できる有用な方法である\S（検査法 毒素検出 その他）#7-1-6\E。
　
菌数計測法
　通常の食品検査では増菌培養は行われていないが、微量（100個/食品1g）の黄色ブドウ球菌を検出したい時や、加熱および凍結による損傷菌も検出したい場合には増菌法を併用しています。分離には選択剤として高濃度食塩（マンニット卵黄食塩寒天培地など）や亜テルル酸カリウム（ベアード・パーカー寒天培地など）を添加した培地が市販されています。その他にはポリミキシンや塩化リチウムおよびソルビン酸等も選択剤として併用されています。また、加熱や凍結による損傷菌は高濃度（7.5%）の食塩存在下では、増殖が抑制されることから、食塩濃度を減らし塩化リチウムを加えた培地などが使用されています。増菌培地としてはブレインハートインフージョンブイヨンに7%の食塩を添加して使用されています。また、一般的に黄色ブドウ球菌の計測は培地法とMPN法が用いられています。
　最近は、PCR法（遺伝子増幅法）による検出法も正確さや、迅速性に優れていることから普及しており、PCR用のキットも市販されています。しかし、DNAは比較的安定しているため、死菌においても検出されてしまうという問題点も指摘されています。
　黄色ブドウ球菌の単離に用いる培地を比較を行うために、コアグラーゼ活性を持つ黄色ブドウ球菌で試験した。4種類の濃度に希釈したコアグラーゼ凝集活性をもつ黄色ブドウ球菌と、食品由来の細菌叢を培地に接種し、コロニーなどの形態を中心に評価した結果、黄色ブドウ球菌の検出にはベアード・パーカー寒天培地と増菌用培地glucose-free nutrient brothが最も有効であった\S（検査法 菌数計測）#7-3\E。
　黄色ブドウ球菌の遺伝子をPCR法で検討した結果、以下の成績が得られた。黄色ブドウ球菌の核遺伝子はⅠφΧ174DNAマーカーの270/281bpと一致した。また、乳房炎乳から分離した黄色ブドウ球菌は黄色ブドウ球菌ATCC21027株と一致した。黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌はPCR法で増幅しなかった。10%ホルマリン液で固定した乳と純水の場合でもPCR法で黄色ブドウ球菌を検出することができた\S（検査法 その他）#7-5\E。
　PCRを利用した食中毒菌の検出に関する論文は数多く存在するが、それぞれ記述内容が大きく異なっている。そこで、13菌種の食中毒菌について精度の良いポリメラーゼ連鎖反応による検出手法を検討した結果、<I>E.coli</I>-O157:H7、<I>Yersinia pseudotuberculosis</I>、<I>Bacillus cereus</I>の3菌種はPCRプライマーを新規に確立した。その他の10菌種については既存のプライマーを修正して使用した。PCRの検出感度は大部分の食中毒菌において10E2 程度であるが、赤痢菌のみ5x10E7であった。本実験において、食品成分によるPCR反応の阻害は認められなかった。以上のことから、食品を単一の培地で培養し、一定のPCR条件で13種類の食中毒菌を検出が可能となった\S（検査法 その他）#7-5\E。
　<I>S.aureus</I> DS1104株で汚染させたチーズにおいて、サーモヌクレアーゼ遺伝子NUC　269bp断片を標的にリアルタイム定量PCR（RTQ‐PCR）で定量した結果、1.5x10E2～6.4x10E2コピー/2gの感度でNUC遺伝子を検出できること、CFUの対数値とNUC遺伝子コピー数の相関係数は0.979～0.998であることがわかった。 これらの結果から、RTQ‐PCRがチーズ中における<I>S.aureus</I>の定量に利用できることが示唆された\S（検査法 菌数計測）#7-3\E。
　また、オーストラリアの潜在感染牛群から採取した117のミルク試料について、主な4種類の乳房炎原因菌である<I>S.aureus</I>、<I>S.agalactiae</I>、S.dysgalactiae、<I>S.uberis</I>の同時検出法として、16sから23s rRNAスペーサー領域の増幅に基づく多重PCR法を開発した。多重PCRの感度は従来法の培養法より検出感度が低かったが、DNA抽出の前に濃縮することにより感度が改良された。これは、阻害物質が希釈されたことおよび菌数が増加したことによると考えられる。その結果、<I>S.aureus</I>、<I>S.uberis</I>の検出感度は従来法よりも高くなり、<I>S.agalactiae</I>、S.dysgalactiaeは従来法と同等であった。多重PCR法は、乳汁中の4菌種の同時検出を迅速かつ高感度に検出でき、ルーチンの診断法に利用できる（文献13）。更に、人為的に汚染させた脱脂乳あるいはチェダーチーズからの黄色ブドウ球菌DNAを抽出するため、溶媒抽出法を改良した。その結果、多重PCR法の感度は脱脂乳では10E2cfu/mlであり、チェダーチーズについては10 cfu/20gであった。脱脂乳、チーズ両製品とも多重PCRの増幅感度はユニプレックスPCRに比べて1log低いことが判明した。多重PCRの開発により、<I>S.aureus</I>の検出と区別を6時間以内に完遂することを可能にした\S（検査法 菌数計測）#7-3\E。
　一方、<I>S.aureus</I>の標準株の1つである<I>S.aureus</I> Wood46に対するモノクロ一ナル抗体と、ウサギの免疫血清から作製したポリクローナル抗体を用いたサンドイッチELISA法でウシの乳汁から分離された<I>S.aureus</I>の検出について検討した。<I>S.aureus</I>標準株2株（<I>S.aureus</I> Wood46と<I>S.aureus</I> CowanI）10E8 cfu/ml以上の濃度で反応が認められたが、それ以外の細菌の標準株との反応は認められなかった。これらの結果より、このモノクローナル抗体が認識する抗原は<I>S.aureus</I>に特異的なものである可能性が高いことが示唆された。 同 ELISA法による<I>S.aureus</I>野外株24株の反応では、10E7 cfu/ml以上の濃度ですべて反応が認められ、モノクローナル抗体は標準株及び野生株に共通して存在する抗原を認識するものと考えられた。他に直列式水晶発振子を使用して、牛乳の凝固を指標とした黄色ブドウ球菌の迅速測定法も報告されています\S（検査法 菌数計測）#7-3\E。
　
菌の同定法
　食中毒菌を食品中から迅速に検出するには、その標的菌に特異的なマーカーを検出する方法が広く利用されています。標的微生物の特異的酵素を検出する方法、標的微生物に特異的な抗原を認識する抗体を用いる方法、標的微生物の特異的な遺伝子を検出する方法などがあります。
　牛乳中の黄色ブドウ球菌NUC遺伝子を検出するためのPCR法について、実験的に<I>S.aureus</I>を感染させた9頭の牛やイリノイ大農場でランダムに選ばれた100頭の牛及び家畜病院の臨床的乳房炎の牛からの乳を用いて検討した。<I>S.aureus</I>のNUC遺伝子用の21及び24塩基対プライマーは既公表のシーケンスから合成し、PCR増幅はTaq DNAポリメラーゼあるいはTth（<I>thermophilus</I>）DNAポリメラーゼを用い、サーマルサイクラーで実施した。実験的感染牛乳房炎乳試料中の <I>S.aureus</I>の検出における微生物培養法の感度は96.7%であった。一方、Tth-PCR法の感度は80%、Taq-PCR法の感度は65%であったが、Tth-PCRと50%のChelex-100処理（PCRインヒビターの影響を除く）を組み合わせた方法の検出感度は100%になった。本法は<I>E.coli</I>、E.cloacae、K.pneumoniaeなどの病原菌では増幅を示さず、100%の特異性であった。さらに、ウシ乳房炎の臨床的乳試料においても、100％の感度と特異性が認められた\S（検査法 菌の同定法）#7-4\E。
　黄色ブドウ球菌の同定のためのアクリフラビン/ディスク法を開発し、この方法が牛乳から分離した他のブドウ球菌から黄色ブドウ球菌を判別することに使えるかどうかをテストした。サンプルは牛乳から分離した882のブドウ球菌分離株及び犬から分離した3株の<I>S.intermedius</I>分離株を用いた。アクリフラビン/ディスク法において、10μgのアクリフラビン/ディスク濃度が最も適切な濃度であった。自動同定システムでS. aureusと同定された112の分離株は全て上記濃度に対して耐性であり、非S. aureusと同定された236分離株の内1株のみがこの濃度に耐性であった。S. aureusと非S. aureusブドウ球菌を判別する診断基準として、アクリフラビン/ディスク法と自動同定システムの結果は実質的に同一であった。臨床上、10μgのアクリフラビン/ディスクを用いたアクリフラビン/ディスク法は、<I>S.aureus</I>と非<I>S.aureus</I>ブドウ球菌を区別するための実用的かつ正確な方法である\S（検査法 菌の同定法）#7-4\E。
　簡単で直接的な検出法として、チューブコアグラーゼ試験(TCT)による乳中の黄色ブドウ球菌検出について検討した。乳を37℃で4時間強化培養した乳試料300μlを300μlのウサギクエン酸血漿に加え、37℃で培養し凝固状態を観察する。陽性の場合、試験管を90度傾けても動かない不透明の固まりとなる。<I>S.aureus</I>が1000細胞/ml以下の場合、ε-ACA（アミノカプロン酸）の添加が必要である。本法は、<I>S.aureus</I>を含有する試料78中69試料を正確に同定した（感度88.5％）。また、<I>S.aureus</I>を含まない試料27は全て陰性と判定した(特異性100％)。この方法は、限られた設備しかない開業獣医師や酪農家などが使える簡単な診断法である\S（検査法 菌の同定法）#7-4\E。
　
その他
　自然感染で慢性乳房炎を発症しているウシ乳汁から胞状細胞とマクロファージを蛍光活性化セルソーティング(FACS)分析により単離し、細胞内に生きた<I>S.aureus</I>が存在しているかどうかを検証した。FACSにより分離した細胞の血液寒天による<I>S.aureus</I>の増殖結果は、<I>S.aureus</I>はマクロファージや胞状細胞に取り込まれた後でも増殖することができることを示した。細胞からDNAを抽出し、PCRによる細菌DNAの増幅を行い、これをサザンハイブリダイゼーション法で解析した結果、<I>S.aureus</I>に特異的なDNAが検出された｡<I>S.aureus</I>感染牛乳汁から分離した胞状細胞やマクロファージ内に、生きた<I>S.aureus</I>やそのDNAが存在することを始めて証明した\S（検査法 その他）#7-5\E。
　貪食性白血球が放出する化学発光（CL）の量を指標に用いるウシ乳房炎の早期診断法を開発した。さらに化学発光法（CL法）を用いてサイトカイン、GM-CSFによる潜在性乳房炎の治療効果を調べた。従来法としての乳房炎診断法は、体細胞数（SCC）とカリフォルニア乳房炎テスト（CMT）を用いた。乳房炎の診断は、従来法のCMT法では体細胞数が50×10E4cell/ml以上で診断可能であったが、CL法は10×10E4cell/ml以上で診断ができ、乳房炎初期の細菌感染が検出できた。また、ウシ乳房炎に対するGM-CSFの治療効果は、感染の初期段階での適用であれば、最も治療の難しい<I>S.aureus</I>乳房炎も完全な回復が可能であるがことが示唆された\S（検査法 菌数計測）#7-3\E。
　市販滅菌牛乳に懸濁した各種食品由来細菌の加熱生残曲線を得ること、加熱損傷菌の検出には、リカバリーテストが有効であることの検証を行った。各供試菌を市販滅菌牛乳に懸濁させ55℃、60℃、62.5℃で加熱した後の生菌数は、TSA培地で35℃または20℃で48時間培養して測定し、さらに24時間培養後の増殖を確認した。また、<I>Staphylococcus aureus</I>は<I>Staphylococcus</I> medium 110(S110)培地、<I>Escherichia coli</I>はVRBA培地、Streptococcus faecalisはm-EA培地またはE.Conf.A培地、<I>Pseudomonas</I> fragi, Psudomonas fluorescens, Psudomonas sp.(No.18)はBMMA培地でも培養して生菌数を測定し生残曲線を求めた。また、加熱後の供試菌が完全に死滅したかどうかを確認するために、リカバリーテストを実施した。リカバリーテストの方法は、TSB培地に各温度で加熱した試料1mlを添加し、35℃または20℃のいずれかで6日間培養し、24時間ごとにその培養液をTSA培地で培養した。さらに、供試菌に適した選択培地またはBMMA培地でも培養し、各加熱温度で細菌が検出されなくなる加熱時間を測定した。
　55℃、60℃、62.5℃で加熱した時の商業的滅菌牛乳における供試菌の生残曲線は、いずれも非対数的であった。Streptococcus faecalisは、62.5℃、30分の加熱でも生残したため、液状乳製品の加熱後の汚染の有無を示す指標菌としては適切でないことが明らかになった。加熱を受けた<I>Escherichia coli</I>をVRBA培地で、<I>Staphylococcus aureus</I>をS110培地で培養した場合、増殖が十分でないことが確認された。各温度で加熱処理したサンプルを直接TSA培地あるいは、その他の寒天培地で培養して生菌数を測定する通常の方法と、TSB培地で一度培養後、TSA培地あるいはその他の寒天培地で培養して生菌数を測定するリカバリーテストの方法を比較すると、リカバリーテストの方が、各加熱温度で細菌が検出されなくなる加熱時間が長くなる事が分かった。これにより、加熱処理された牛乳中から細菌を検出する場合のリカバリーテストの有効性と必要性を確認することが出来た\S（検査法 菌数計測）#7-3\E。
