文献番号：s-56
タイトル：Comparison of different approaches to quantify <I>Staphylococcus aureus</I> cells by real‐time
　　　　　 quantitative PCR and application of this technique for examination of cheese
邦訳タイトル：リアルタイム定量PCRによって<I>Staphylococcus aureus</I>菌体を定量する際の異なる手法の比較
　　　　　　　ならびにチーズ検査へのこの方法の応用
著者：HEIN I, LEHNER A, RIECK P, BRANDL E, WAGNER M, KLEIN K
誌名､発行年、巻号頁：Applied and environmental microbiology　（2001）, <B>67</B>, (7),  3122‐3126 
菌種：1.<I>Staphylococcus aureus</I>
　
<ITEM1> \n調査の目的
 
サーモヌクレアーゼ遺伝子nucを標的として，<I>S.aureus</I>をリアルタイム 定量PCR(RTQ-PCR)で定量する際の、手法の比較を行う。
　
<ITEM2> \n検体名
 
<I>S.aureus</I> DS1104株の純培養物及びそれを人工的に汚染させたチーズ
　
<ITEM3>
 
-
　
 
<ITEM4> \n検査検体数
 
-
　
<ITEM5>
 
1)RTQ-PCR。RTQ-PCR によるDNA定量のため、PCRの間の標的遺伝子の初期コピー数に比例した蛍光の増加を検出する。dsDNA-binding 蛍光色素あるいは蛍光プローブを用いる。
2)SYBR GreenⅠを使用するLightCyclerシステムによるRTQ-PCR。SYBR GreenⅠを使用するRTQ-PCRはLightCycler-DNA Master SYBR GreenⅠキット、LightCycler-FastStart DNA Master SYBR GreenⅠキットを使用した。
3)TaqManプローブを使用するLightCyclerシステム及びABI PRISM 7700　SDSシステム。TaqManプローブを使用するRTQ-PCRは、LightCycler-DNA Master Hybridization プローブキット、あるいはLightCycler　-FastStart DNA Maste Hybridization プローブキットを用いた。
4)チーズの人為的汚染。チルジット型セミソフトチーズ、生乳からのフレンチカマンベールチーズ、生山羊乳からのフレッシュチーズを使用した。<I>S.aureus</I>の純培養物を緩衝化ペプトン水で10倍希釈系列を作り、各希釈段階の1mlを2gのチーズに45mlの1：10希釈の消化緩衝液とともに加える。
5)人為的汚染チーズからのDNA単離。2gのチーズを、12ユニット/mlのプロナーゼを含む1:10希釈消化緩衝液に加えストマッカーで1分均質後、40℃　3時間保持し、4℃で5,700xg15分遠心分離を行いペレットをTE緩衝液で3回、PCR緩衝液で1回洗浄する。ペレットを25μl（チルジットチーズ）あるいは250μl（カマンベールチーズ）のPCR緩衝液に溶かし、143ユニット/mlのリゾスタフィンを加える。室温で15分保持後に8ユニット/mlのプロテイナーゼKを加え、60℃1時間保持し、その後95℃15分保持後に13,000xgで5分遠心分離を行い、その上清5μlをRTQ-PCRに供する。
　
<ITEM6>
 
nuc遺伝子の269bp断片を、RTQ-PCRによる<I>S.aureus</I>細胞の検出及び定量用の標的として選んだ。SYBR　GreenIを使用するLightCyclerシステムによりRTQ‐PCRを行ったところ，その感度はTaqManプローブを使用する場合に比べて低いことがわかった。TaqManプローブを使用する限り、LightCyclerシステムにおける感度や再現性は、ABIPrism7700　SDSシステムを用いた場合とほぼ同等であった。 そこでTaqManプローブ‐LightCyclerプロトコルを人工的に<I>S.aureus</I>を汚染させたチーズの検査に適用した。その結果、1.5xE+2～6.4xE+2コピー/2gの感度でnuc遺伝子を検出できること、CFUの対数値とnucコピー数の相関係数は0．979～0．998であることがわかった。 これらの結果から、RTQ‐PCRがチーズ中における<I>S.aureus</I>の定量に利用できることを示唆した。
　
<ITEM7>
 
Applied and Environmental Microbiology, 67, 3122
　
<PUBMED>

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/query?form=4&db=m&Term=Applied and Environmental Microbiology, 67, 3122

<LIST1>

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