文献番号：s-57
タイトル：Enzyme immunoassay of Staphylococcal enterotoxins in dairy products with cleanup
　　　　　 and concentration by immunoaffinity column
邦訳タイトル：免疫アフィニティーカラムによる精製と濃縮を行った乳製品におけるブドウ球菌属エンテロトキシンの酵素抗体法
著者：LAPEYRE C, MAIRE T, MESSIO S, DRAGACCI S
誌名､発行年、巻号頁：Journal of AOAC International, (2001), <B>84</B>, (5), 1587‐1592
菌種：1.<I>Staphylococcus aureus</I>
　
<ITEM1> \n調査の目的
　
エンテロトキシンの新しい抽出−濃縮法として、ブドウ球菌属エンテロトキシンに対するモノ特異的あるいは多特異的免疫アフィニティーカラムを用いた、乳製品中エンテロトキシンの酵素免疫測定法を検証する。
　
<ITEM2> \n検体名
　
人為的にブドウ球菌属エンテロトキシンで汚染させたソフトチーズ、及び自然汚染の食品
　
<ITEM3>
　
-
　
　
<ITEM4>　\n検査検体数
　

　
<ITEM5>
　
1)汚染乳製品の調製。人為的汚染チーズの作製は25gのソフトチーズを水50mlと混合、できたスラリーに種々のレベルでエンテロトキシンを添加する。エンテロトキシン抽出操作前に30分静置する。自然汚染食品では25gの食品を水50mlと混合。エンテロトキシン抽出操作前に30分静置する。
2)特異的アフィニティーカラム(IAC-1)の調製。抗SEAmAb（モノクローナル抗体）をNHS活性化HiTrapアフィニティーゲルに結合させる。次にカップリングバッファー中の精製mAb 1mgを基質に注入し、カラムをシールし室温で1時間静置した後に3mlのカップリングバッファーで洗浄後、6mlの0.5M エタノールアミン、0.5M　NaCl,pH8.3もしくは0.1Mアセテート,0.5M NaCl,pH4で3回洗って、非活性化する。調製したIAC-1は、0.1%アジ化Na含有PBS中で保存する。
3)多特異的アフィニティーカラム(IAC-2)の調製。IAC-2は精製抗SEA,SEB,SECS,SED抗体の混合物をゲルに同様に結合させることで調製する。次に1mgの各mAb(抗SEA, SECS,SED)と1mgの抗SEBウサギIgGを使用してIAC-2を調製する。
4)人為的あるいは自然汚染抽出物の免疫アフィニティークロマトグラフィー。抽出物は予め5mlのPBSで平衡化した免疫アフィニティークロマトグラフィ-（IAC-1またはIAC-2）にアプライする。非結合分子を排出後2mlのPBSで洗浄後に0.1M 酢酸、0.250M NaCL pH2.5でエンテロトキシンを溶出させる。その溶出画分(0.5ml)はEIAによるエンテロトキシン検出の前にpH7.1-7.6に中和する。エンテロトキシンの溶出後カラムは10mlのPBSで洗浄し、保存液中で保存する。
　
<ITEM6>
　
特異的IAC-1で免疫アフィニティークロマトグラフィー後、人為的汚染チーズ中でSEAは0.04ngの低レベルで検出された。IAC-1でのエンテロトキシンAの回収率は5回の平均で81.2%と良好で、10回繰り返し使用しても、回収率は平均91.5%であった。多特異的IAC-2でSEA、SEB、 SECs、SEDは人為的汚染乳製品中で0.1ngの低レベルで検出された。IAC-2による混合エンテロトキシンの回収率もSEAが81%,、SECが77%、SEBとSEDは75%と良好であった。この新しい抽出‐濃縮‐免疫アフィニティークロマトグラフィー法(ECIC)は、ブドウ球菌属エンテロトキシンの検出の改良及び乳製品の酵素免疫測定法におけるマトリックス効果を排除するのに有効であった。
　
<ITEM7>
　
Journal of AOAC International,  84, 1587
　
<PUBMED>

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/query?form=4&db=m&Term=Journal of AOAC International,  84, 1587

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