文献番号：s-60
タイトル：Development of a multiplex polymerase chain reaction assay for detection and
　　　　　differentiation of <I>Staphylococcus aureus</I> in dairy products
邦訳タイトル：乳製品における<I>Staphylococcus aureus</I>の検出と区別のための多重PCR法の開発
著者：Tamarapu S, Drake M, Mckillip J L
誌名､発行年、巻号頁：Journal of  Food Protection　（2001）, <B>64</B>, (5), 664‐668 
菌種：1.<I>Staphylococcus aureus</I>
　
<ITEM1> \n調査の目的
 
乳製品からの <I>S.aureus</I>DNAの有効な抽出法及び毒素産生 <I>S.aureus</I>の検出と区別を行うための多重PCR法を開発する
　
<ITEM2> \n検体名
 
対象試料。1)人為的に汚染させた脱乳およびチェダーチーズ　2)使用菌株　<I>S.aureus</I> LT1、LT2、ATCC12600(ent C)、3862(ent C)、13565(ent A)、13566(ent A)、14458(ent B)の7株および21種の菌。
　
<ITEM3>
 
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<ITEM4> \n検査検体数
 
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<ITEM5>
 
1)DNA抽出。牛乳またはチーズ懸濁液10mlに100%エタノール2ml、濃水酸化アンモニウム2ml、石油エーテル2mlを加えよく混合し、12000xg、10分.遠心分離を行う。その沈殿を300μlの10mMトリスー塩酸緩衝液pH7.8に懸濁する。これに10μlのlysostaphin（5mg/ml）を加え、37℃、5分培養する。これに50μlの10%SDSを加え、5分間ボイルする。等量のクロロホルムを加え、17000xg、10分遠心分離をする。液層を採り、2.5M酢酸アンモン液（pH5.4）を0.1体積、100％冷エタノールを2.5体積、グリコーゲン（10mg/ml）5μlを加え、DNAを沈殿させ、DNAを遠心分離（20000xg、30分）し、DNAﾍﾟﾚｯﾄを乾燥後に30μlの10mMのTris-EDTA緩衝液pH7.2で再縣濁する。
2)PCRプライマー。毒素産生性<I>S.aureus</I>検出に熱安定性ヌクレアーゼ遺伝子(nuc)を選ぶ。nucおよびentC（工ンテロトキシンC遺伝子）のプライマーシーケンスはWilsonらから得る。プライマーは外注した。
3)PCR。抽出NDA 2.5μl、ジメチルスルホオキサイド1μl、フォワードプライマーおよびリバースプライマー各20pmol、PCRスーパーミックス44μlを加え、94℃ 2分変性後、94℃で15秒、54℃で1分、72℃で2分を35サイクル。
4)多重PCR　entCおよび nucの両遺伝子を標的にし、多重PCRを実施した。抽出DNA　2.5μl、ジメチルスルホオキサイド1μl、25mM塩化マグネシウム2μl、（各遺伝子に対し）フォワードプライマーおよびリバースプライマー各20pmol,PCRスーパーミックス44μl加え、アニーリング温度56℃以外は上記方法と同じ。
5)制限酵素分解。PCR産物確認にRFLP法を構築。3種の制限酵素　AluⅠ、RsaⅠ、Hsp92Ⅱ。PCR産物5μl、12.3μl滅菌水、10×制限酵素緩衝液2.3μl、制限酵素0.5μlを加え、37℃で2時間保持した。制限分解物は1%寒天ゲルで分離し臭化エチジウムで染色しUV光で可視化した。
　
<ITEM6>
 
人為的に汚染させた脱脂乳あるいはチェダーチーズからの黄色ブドウ球菌DNAを抽出するため、溶蝶抽出法を改良した。多重PCR法の感度は脱脂乳では100CFU／mlであり、チェダーチーズについては10CFU／20gであった。脱脂乳、チーズ両製品とも多重PCRの増幅感度はユニプレックスPCRに比べて1log低い。多重PCRの開発により、<I>S.aureus</I>の検出と区別を6時間以内に完遂することを可能にした。
　
<ITEM7>
 
Journal of Food Protection, 64, 664
　
<PUBMED>

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/query?form=4&db=m&Term=Journal of Food Protection, 64, 664

<LIST1>

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