文献番号：s-62
タイトル：Optimization of the PCR for detection of <I>Staphylococcus aureus</I> nuc gene in bovine milk
邦訳タイトル：牛乳における黄色ブドウ球菌nuc遺伝子を検出するためのPCR法の最適化
著者：Kim C-H, Khan M, Morin D E, Hurley W L, Ripathy D N, Oluoch A O, Kakoma I
誌名､発行年、巻号頁：Journal of  Dairy Science (2001), <B>84</B>, (1), 74-83  
菌種：1.<I>Staphylococcus aureus</I>
　
<ITEM1> \n調査の目的
 
PCRインヒビターの影響を除くことにより、高感度かつ高特異性の方法を開発する。
　
<ITEM2> \n検体名
 
対象試料
実験的に<I>S.aureus</I>を感染させた9頭の牛、イリノイ大農場でランダムに選ばれた100頭の牛及び家畜病院の臨床的乳房炎の牛からの乳、さらに病原菌でspikedされた乳およびPBS
　
<ITEM3>
 
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<ITEM4> \n検査検体数
 
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<ITEM5>
 
1)微生物学的試験。ミルクサンプル10μlを血液寒天培地に接種し37℃で48時間培養した。コロニー同定はNational Mastisis Council　ガイドラインによって実施した。2)DNAの抽出。標的DNAの単離と精製は、迅速煮沸法を改良して実施した。3)メタノール処理(阻害物質の除去)。粗DNA抽出物を900μlの純メタノールに懸濁し、4℃で48時間保持後、13600xg15分遠心分離し、そのペレットを900μlの純メタノールに再懸濁した後に13600g、15分遠心分離を行った。DNAペレットを脱水し、緩衝液中で−20度保存した。4)Chelx-100処理。粗DNA抽出物を1mlの血球溶解緩衝液に懸濁後に、15分静置後13600g、10分遠心分離（2回）を行い、そのペレットを1mlPBSに懸濁しボルテックス処理した後、13600gで10分遠心分離した。その上澄の大部分を捨て残液でペレットをボルテックス処理後に50%Chelex水懸濁液200μl加え、95℃1〜分加熱し、13,600gで30秒遠心分離した。5)オリゴヌクレオチドプライマー。<I>S.aureus</I>のnuc遺伝子用の21及び24塩基対プライマーは既公表のシーケンスから合成した。6)PCR増幅。Taq DNAポリメラーゼあるいはTth（<I>thermophilus</I>）　DNAポリメラーゼを用い、サーマルサイクラーで実施した。増幅後電気泳動で分離し、臭化エチジウムで染色、可視化して写真撮影した。
　
<ITEM6>
 
実験的感染牛の乳房炎乳試料中の <I>S.aureus</I>検出の微生物培養法の感度は96.7%であった。実験的感染牛の乳房炎乳試料からの抽出DNA試料のTaq-PCR感度は65%であった。 実験的感染牛の乳房炎乳試料からの抽出DNA試料のTth-PCR感度は80%であった。Tth-PCRとChelex-100処理を組み合わせた検出感度は100%になった。本法は<I>E.coli</I>,E.cloacae,K.pneumoniaeなどの病原菌では増幅を示さず、100%の特異性であった。更にウシ乳房炎の臨床的乳試料においても、100％の感度と特異性があった。
　
<ITEM7>
 
Journal of Dairy Science,  84, 74
　
<PUBMED>

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/query?form=4&db=m&Term=Journal of Dairy Science,  84, 74

<LIST1>

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