論文 No.：76
タイトル：Frequency of occurrence of <I>Campylobacter spp.</I> in red meats and poultry in Northern Ireland 
　　　　　and their subsequent subtyping using polymerase chain reaction-restriction fragment length 
　　　　　polymorphism and the random amplified polymorphic DNA method
筆頭著者：Madden, R.H.
論文、年、Vol、頁（～）：J Appl Microbiol 84:703-708 (1998)
個表分類：販売店
調査国：アイルランド
　
<ITEM1> \n調査の目的
 
北アイルランドで生産された赤肉や鶏肉中のカンピロバクター汚染の許容レベルを評価すること。菌分離して得られたカンピロバクター属菌は、Penner血清型とカンピロバクター･サブタイピングの遺伝学的方法であるPCR-RFLP法及びNachamkinの方法をベースとしたRAPD法の3つのバイオタイピング方法論を用いて、そのサブタイプを確定する方法を評価すること。そして、自然界で散発的に起こる食中毒からカンピロバクター菌を分離し、関係する共通の原因を発見すること。
　
<ITEM2> \n検体名
 
検体は、北アイルランドで生産された子羊肉(n=100)、牛肉(n=100)、牛肉(n=50)と豚肉(n=50)の小売りパック、鶏の部分肉の小売りパック(n=120)
　
<ITEM3>
 
検体は、北アイルランドで生産された子羊肉(n=100)、牛肉(n=100)、牛肉(n=50)と豚肉(n=50)の小売りパック、鶏の部分肉の小売りパック(n=120)とした。
枝肉のふき取り検査のサンプリングは、北アイルランド内のと畜場10施設全てを対象に実施した。
子羊の枝肉は、最大回収希釈液(Oxoid,Basingstoke)で湿らせた標準綿棒を用い胸部を(100c㎡)拭き取り、クーラーボックスに入れ3時間以内に検査した。
牛の枝肉は、採取部分が、10cm×10cm×3mm厚の十分な大きさの頸肉部の1区画を切り取ってサンプルとした。
その後、研究室で余分な部分をトリミングして、無菌のハサミを用いて、そのうちの10gを90mlのプレストン培地に加え溶かした。
食肉の小売りパックの細菌検査は、重さが200-500gの全てパックされたもので、別々の地方のスーパーマーケットから購入されたものとした。これを毎月10パックづつ購入し、購入の2時間以内に検査し、もう一度ハサミを使って細かく叩き切ったサンプルから10gを採って検体とした。
　
<ITEM4>
 
カンピロバクター
　
<ITEM5>
 
カンピロバクターは、枝肉の拭取った綿棒の先をFBP(鉄、重硫酸塩、焦性ブドウ酸塩)を添加した90mlプレストン選択培地の中で撹拌し、これを微好気条件下(85%N2,10%CO2,5%O2)で42℃48時間インキュベートする。増菌はプレストン選択培地に画線し、再インキュベート(42℃24～48時間)し、特有のコロニーを選び出す前に、通常のバイオタイピング手順でカンピロバクターの存在を確認する。キャンピロバクターのバイオタイピング方法については、Penner血清型の場合マンチェスター保健研究所で管理されているものを使用した。
PCR-RFLP法は、Nachamkinの方法(1993)で実施し、プライマーは増幅したflaA遺伝子を 1･7kb増幅→Dde1制限酵素で消化→消化された生成物は、2%アガロースゲル上(6時間、70V)で分解→エチレンジュウムブロマイド着色→アガロースゲル上でバンドパターンの確認。
RAPD法は、Nachamkinの方法をベースとし、プライマーは10-merプライマー(5'-CCTGTTAGCC-3') を使用した。
　
<ITEM6>
 
牛、子羊の枝肉、小売りパックの牛肉と豚肉からは、カンピロバクター属は検出されなかった。鶏肉の小売りパックからは、46(38%)からカンピロバクター属を検出し、<I>C.jejuni</I>と<I>C.coli</I>がほぼ同数検出された。この鶏肉パックは、1ｹ所の地方生産者より搬入されたことから、その生産者を一年間以上繰り返し菌分離したところ、特有のサブタイプが見られた。
この調査で鶏肉から分離された<I>C.jejuni</I>と<I>C.coli</I>の計32株のタイピングについては、Penner血清型では5タイプに分類し、PCR-RFLP法を使ったところ9タイプ、RAPD法では18タイプに分類された。このことから遺伝学的タイピングとして、特にRAPD法は血清学的タイピングより、大きな識別力がみられた。しかしながら処理スピードと血清型の比較単純さは初期のバイオタイピング法と同じく妥当なところであった。遺伝学的タイピング方法は、今回の調査で、小売りパックや消費者へいく製造過程を通じてカンピロバクターを追跡する大変有効な道具であることが明らかとなった。RAPD法が最も高感度な識別力があり、次にPCR-RFLP法で、初期のバイオタイピングとして使われたPenner血清型より優れた方法であることがわかった。
　
<ITEM7>
 
Madden RH, J Appl Microbiol, 84, 703
　
<PUBMED>

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/query?form=4&db=m&Term=Madden RH, J Appl Microbiol, 84, 703