論文 No.：72
タイトル：Detection of <I>Campylobacter jejuni</I> in food and poultry viscera using immunomagnetic separation 
　　　　　and microtitre hybridization
筆頭著者：M．Lamoureux
論文、年、Vol、頁（～）：Journal　of　Applied　Microbiology、Vol.83、641-651、1997
個表分類：検出法
　
<ITEM1> \n調査の目的
 
従来の<I>Campylobacter</I>の検出では2日間の培養と様々な抗生物質、及び培養液等が要求されていた。最終的な同定にはいくつかの化学的試験も必要であった。このことから少ない菌数での検出のための、高感度で特異性の強い手技が求められてきた。PCR法による測定では、食品のサンプルがPCR法に適さず、医療サンプルより感度が落ちるため、感度を高めるために短い期間での増菌が必要であった。
また、PCR法はテクニックを必要とし、扱いにくい物でもある。そこで、食品中及び医療サンプルからの、増菌後の<I>Campylobacter</I>菌を濃縮する免疫磁気的方法を検討する。
　
<ITEM2> \n検体名
 
 
　
<ITEM3>
 
肝臓、胆嚢、深胸筋はと殺後の新鮮な物を採取、採取後は70％エタノールに数分浸し、エタノールを燃やしてコンタミネーションを防ぐ。小売店で得た鶏肉はそれぞれ10g採取し、あらかじめ用意した菌液(<I>C.jejuni</I>(30%),S.enteritidis,E.coli,(<I>C.jejuni</I>(30%),S.enteritidis,E.coli,H.pyiori,Pr.vulgaris,Ser.marcecens,<I>C.fetus</I>(70%)、波長600nmでOD値1.0に調整し、10E3～10E7に希釈）に0.1ml接種。低温殺菌牛乳も同様に行う。各8菌種は×希釈段階5（鶏肉：10E3～10E7、牛乳：10E4～10E8）×検体種類2…80検体
　
<ITEM4>
 
<I>Campylobacter　jejuni</I>
　
<ITEM5>
 
1．免疫磁気ビーズの作成
①菌株と培養液：<I>Campylobacter</I>属、Helicobacter pylory属-Mueller-Hinton培地（10%羊血液加）-10%CO2/5%O2/85%/N2、37℃48～72時間、他の菌株-血液寒天培地、BHI培養液-37℃16時間　
②モノクローナル抗体産生用の抗原：指数増殖期の細菌を用いDC protein Assayで蛋白を濃縮-試料の一部はSDS-PAGEとマウス免疫に使用　
③ポリアクリルアミドゲル電気泳動：Laemmliの方法に従い、Mini-ProteanⅡを使用して分析　
④モノクローナル抗体の産生と精製：Balb/cマウス（メス）を用い、免疫法で作成。脾臓を採取し、アフィニティークロマトグラフィーで分解
⑤免疫ブロット：Mini-proteinⅡに従って行う
⑥Dynabeads M-450及びDynabeads M-450抗マウスIgGの2種のビーズを作成。2．Campの検出：通常に培養されたCampコロニーを接種したRosef液を43℃、20時間培養し、培養液を、作成したビーズと共に室温、15～30分培養し、免疫磁気的に濃縮後、rDNA及び特異性RNAプローブを用い、マイクロタイターハイブリダイゼーションで検出。
　
<ITEM6>
 
モノクローナル抗体は全てのCamp.jejuniに対する高い親和性と高温性Campに対する中程度の親和性を示し、他の菌に対して親和性を持たなかった。2種のビーズでの比較ではそれぞれCamp.jejuniを異なる細菌集落からとらえることが出来、類似していた。また、ビーズの濃度による有意差は無く、過剰なビーズが競合作用を引き起こす証明が出来た。高温性Campには全て反応が認められたが、<I>C.fetus</I>あるいはCamp以外の菌ではほとんど認めなかった。
ハイブリダイゼーションの反応は菌液中の<I>C.jejuni</I>量に比例していた。rDNAプローブと特異性RNAプローブの比較ではrDNAの方が反応が強く、反応するまでの時間も短かった。従来の検出方法に比べ、高い特異性と感度が得られ、検出までの期間を短縮出来る方法を確立できた。
具体的には①少ない菌数で検出が可能②他の菌による反応の妨げが抑えられた③検出までに数日かかり、さらに不明瞭な場合があったものが1日の培養とその後10～12時間で明確に得られるようになった。
 
<ITEM7>
 
Lamoureux M、J Appl Microbiol, 83, 641
　
<PUBMED>

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/query?form=4&db=m&Term=Lamoureux M、J Appl Microbiol, 83, 641