論文 No.：74
タイトル：Occurrence of plasmids and tetracycline resistance among <I>Campylobacter jejuni</I> 
　　　　　and <I>Campylobacter coli</I> isolated from whole market chickens and clinical samples
筆頭著者：Lee, C.Y.
論文、年、Vol、頁（～）：Int J Food Microbiol 24:161-170 (1994)
個表分類：販売店
調査国：台湾
　
<ITEM1> \n調査の目的
 
台北市内の市場で購入した鶏肉の<I>C.jejuni</I>及び<I>C.coli</I>の保菌率の調査及び市場で販売されている鶏肉及び、医療機関から分離された<I>C.jejuni</I>のテトラサイクリン耐性菌の比率と、そのプラスミド（染色体外遺伝子）を解析し、プラスミドに含まれるトテラサイクリン耐性遺伝子とtet O gene probe（tet O 遺伝子部位）の関連性の調査した。
　
<ITEM2> \n検体名
 
鶏胸肉(20検体)、もも肉(20検体)、尾(18検体)
　
<ITEM3>
 
台湾市内のメトロポリタン地域の小売市場(10検体)及びスーパーマーケット(10検体)で購入した鶏胸肉(20検体)、もも肉(20検体)、尾(18検体)の3部位と台湾大学付属病院他2医療機関において分離(41株)した<I>C.jejuni</I>を検体として用いた。鶏肉のサンプリング法は、胸肉、もも肉、尾の各部位を滅菌済の外科用メスを用いて細切し、表皮と筋肉を25g採取し、これを検体とした。検体は、滅菌した箱に氷詰めしてから研究室に輸送し、採取後5時間以内に分析を実施した。
　
<ITEM4>
 
カンピロバクター
　
<ITEM5>
 
1．使用培地の組成
(1)サンプルの洗浄：NBブイヨン液
(2)カンピロバクター増菌培地：ブルセラ培地1㍑、硫酸鉄0.25g、焦性ブドウ酸ナトリウム0.25g、バンコマイシン15mg、トリメトプリム7.8mg、ポリミキシンB5,000単位
(3)カンピロバクター選択培地：CCDA選択培地
2．培養及び分離方法　サンプル25gをそれぞれ225mlのNB液で5分間すすぎ、このすすぎ液を滅菌フィルターを通し、25℃,20分間,23,000gで遠心分離し、ペレットにする。次にペレットを50mlの増菌培地に浮遊させて、微好気条件で42℃、24時間増菌培養する。増菌後、ブイヨン液を0,1～0,2mlを選択培地に塗沫し、微好気状態・42℃、42時間培養する。同定法は疑わしいコロニーをグラム染色後、鏡検、形態を確認し、生化学試験により同定する。カンピロバクターの菌株は、著者の開発したプラスミドDNA分類法により選別する。プラスミドを作成する細胞は、BBL社のカンピロバクター用ブイヨン液を用いる。プラスミドの分子量の指標として、大腸菌のプラスミド(pRK290,pCVD)と、Erwinia stewartii菌のプラスミド(SW2)を用いる。DNAプローブの製法は、tet O 遺伝子を含むプラスミド(pAT121)はBirnboimとDolyの方法で抽出し、Hind111とNde1で分解し、1458Hind111遺伝子断片はアガロースゲルから電気的に溶出、透析し、Elutipカラムにより精製する。精製した遺伝子断片をtet Oプローブとして用い、DNAラベルキットを用い標識する。分離した<I>C.jejuni</I>に含まれるtet O 遺伝子は、標識したtet O 遺伝子断片によるハイブリダゼーションにより特定する。<I>C.jejuni</I>（プラスミド有する142検体、有しない15検体)のプラスミドと染色体遺伝子は、ZetaProbe膜により精製分離する。ハイブリダゼーションのためのプラスミッドDNAの精製法は、BirnboimとDolyの手法に従う。テトラサイクリン感受性株のプラスミド、大腸菌プラスミドATCC25922は、陰性コントロールとして用い、pAT121より精製したtet O 遺伝子断片を、陽性コントロールとして用いた。テトラサイクリン耐性菌の発生率は、著者の開発したブイヨンの希釈法により決定する。
　
<ITEM6>
 
1．市場販売されている鶏肉におけるカンピロバクターの検出率
市場販売されている鶏肉における<I>C.jejuni</I>と<I>C.coli</I>の検出率は、一般小売店で9(90%)、スーパーマーケットで10(100%)であった。鶏肉の部位別でみると、胸肉では15(75%)、もも肉では14(70%)、尾部では15(83%)であった。
2．プラスミドの分析
鶏肉から分離されたカンピロバクターからは152/167(91%)、また、医療機関から分離されたものからは18/41(44%)の比率でプラスミドが認められた。その形態は、鶏肉からの分離菌では80%,また、医療機関からの分離菌の全てが一本鎖のプラスミドであった。プラスミドのサイズは、16～208Kbであった。鶏肉からの分離菌では61Kbのプラスミドが最も多く検出され、50kbのものは、医療機関からの分離菌においてのみ検出された。
3．テトラサイクリン感受性について
鶏肉から分離された165検体の<I>C.jejuni</I>は全てテトラサイクリン耐性菌であり、医療機関からの分離菌の22％はテトラサイクリンに高い感受性を示したが、残りはMIC値が8～256μg/mlであった。
4．テトラサイクリン耐性とプラスミド輸送性との関連
プラスミドを含む<I>C.jejuni</I>のうち、人から分離されたものでは16/18(89%)が、また、鶏から検出されたものの全てがテトラサイクリンに耐性をもっている。鶏から分離された<I>C.jejuni</I>のテトラサイクリン耐性は、61Kbのプラスミドに関連性がある
5．tet O 遺伝子断片を用いたテトラサイクリン耐性菌株のプラスミド及び染色体DNAのハイブリダゼーションについては鶏肉からの分離菌については157検体中154検体がハイブリダゼーション陽性（プラスミドに含むものが137検体、染色体DNAに含むものが17検体）一方医療機関からの分離菌について：32検体中28検体がハイブリダゼーション陽性（プラスミドに含むものが15検体、染色体DNAに含むものが13検体）であった。
　
<ITEM7>
 
Lee CY, Int j Food Microbiol, 24, 161
　
<PUBMED>

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/query?form=4&db=m&Term=Lee CY, Int j Food Microbiol, 24, 161