論文 No.：111
タイトル：Detection of Thermophilic <I>Campylobacter</I> spp in Blood-Free Enrichiment Samples of 
　　　　　Inoculated Foods by the Polymerase Chain Reactio
筆頭著者：Thunberg, R.L.
論文、年、Vol、頁（〜）：J Food Protection 63:299-303(2000)
個表分類：検出法
　
<ITEM1> \n調査の目的
 
食品中の<I>C.jejuni</I>を検出する現行の方法では、前培養、選択増菌培養、選択培地による単離、生化学的、血清学的手法による同定など5から6日間要するので、PCRを用いた方法を標準的なBFEB増菌培地による検出法と比較して調査し、検査期間の短縮化を図る。
　
<ITEM2> \n検体名
 
食品：ブロッコリー、かに身、生ガキ、マッシュルーム、生乳
　
<ITEM3>
 
食品：ブロッコリー、かに身、生ガキ、マッシュルーム、生乳（<I>C.jejuni</I>を接種したブロッコリー培養液、かに身、生ガキ、マッシュルーム洗浄液、生乳を入れたblood-free enriched broth（BFEB）
○<I>C.jejuni</I>を接種したブロッコリー培養液（6段階希釈：分離培養用各5検体、PCR用各5検体）blood-free enriched broth（BFEB）；3反復、ブロッコリー、かに身、生ガキ、マッシュルーム洗浄液、生乳を入れたBFEB；2反復
 
菌株：<I>C.jejuni</I> JH93（U.S. Food and Drug Administration）
　
<ITEM4>
 
カンピロバクター
　
<ITEM5>
 
菌株および供試食品への接種方法：接種菌の調整；増菌MP（Modified CCDA-Preton）寒天培地、微好気（5%O2,10%CO2,balanceN2）,42℃24時間培養、回収後0.1%ペプトン水でMcFarland no.3に調整後接種用に連続希釈BFEBによる増菌は常法　6段階希釈された調整液を1mlペアでとり49mlのBFEB、5mlの生乳を入れたBFEB、5mlのかに身、マッシュルーム、生ガキ洗浄液を入れたBFEBに接種50mlの遠心管内で42℃48時間培養、5つの希釈サンプルを培養法とPCRで検査　　　　　　　　　　
分離培養：MP寒天培地、42℃48〜72時間培養　ラテックス凝集反応により同定
DNAプライマーとPCR増幅方法　PCR：プライマー；<I>C.jejuni</I>,<I>C.coli</I>,<I>C.lari</I>,C.upsaliensisから分離した16S rRNAに特異的なプライマー　MW1（5'-ACACTGGAACTGAGACAC-3'）およびMW2（5'-TCGAGTGAAATCAACTCC-3'）　
この2つのプライマーを用いたｷｬﾝﾋﾟｨﾛﾊﾞｸﾀｰのDNAの増幅ではおおよそ1.1kbの位置に増幅産物が産出　
ｻｰﾏﾙｻｲｸﾗｰにより次のｻｲｸﾙで30回増幅（denaturation　94℃ 5min, additional denaturation  94℃ 1min, annealing 57℃ 1min, elongation 72℃ 1min） 1倍のTBE bufferに浸した2% agarose　gel で解析　1 μg/ml ethidium bromideで染色、UV蛍光下で観察
DNA抽出と感度の検定：BFEB中の炭素と鉄濃度がPCR反応を妨害するので2種の抽出方法で実施
1）Percoll抽出法変法　2）10段階希釈法　　50%検出限界値（DL50）：検体の半分から<I>C.jejuni</I>が検出される
最終希釈倍率 統計処理：Spearman-Karberの50%検出限界値（CFU/5g food）を用い、PCRと選択培地による分離を比較、Fortran Computer　program（Dose,USFDA）により分析、有意差検定は感度分析同様, 最小2乗平均とばらつきを求める分析ソフト  （SAS tute,　Cary,　N.C）により分析
　
<ITEM6>
 
接種食品の増菌培養：DL50の平均値　選択培地分離培養0.04(±0.04)(n=10)、PCR0.04(±0.07)(n=10)CFU/5g food　
食品の種類に関係なく、選択培地による分離培養方法とPCR法の間に顕著な検出頻度の差は認められなかった　
BFEBによる増菌培養を48時間行えばどちらの方法でも食品1g中1CFUのｷｬﾝﾋﾟｨﾛﾊﾞｸﾀｰを検出することが出来る
PCR：各方法の評価：BFEBを利用した<I>C.jejuni</I>の好気培養は、明らかに<I>C.jejuni</I>の培養にかかる労力を低減している　
食品中で増菌したｷｬﾝﾋﾟｨﾛﾊﾞｸﾀｰを推定的に証明するには24時間の増菌培養の後、選択培養に2〜3日要する　
選択培地で微好気培養を行っても正確にｷｬﾝﾋﾟｨﾛﾊﾞｸﾀｰの特徴的な形態を確認し証明するためには最低2日必要である　
PCRによるスクリーニングテストでは24時間の増菌では結果にばらつきがある　
Hunt and Tranは選択培地による分離とPCRで比較的留結果を得るためにはHunt brothで48時間の増菌培養が必要で
あると述べている　
増菌後のPCRによる証明をより効果的に行うためには48時間の増菌培養が良い　
BFEBによる増菌培養とPCR法を併用すると食品中の本菌の検出に必要な時間を1日短縮することが出来る 
複数のPCR結果に基づいて24時間の選択培養は古典的な培養法に比べ2〜3日の期間短縮できる　
致命的に至らないまでも損傷を受けたｷｬﾝﾋﾟｨﾛﾊﾞｸﾀｰを生き返らせる方法としてはBFEBが評価が高い
＜要約＞　<I>Campylobacter  jejuni</I> に代表される好熱性<I>Campylobacter</I> の検出をPolymerase chain reaction(PCR)により行い、選択培地による分離培養方法(SAI)と比較して行った。培養し発育停止期となった<I>C.jejuni</I>を10%の割合でブロッコリー、かに身、マッシュルーム、生乳、生ガキの洗浄液を入れた血液無添加増菌培地（BFEB）に接種した。
48時間培養後PCRとSAIで同時に分析するため偶数のテストサンプルを取り出した。増菌培地中の炭素および鉄がPCRの分析に影響することが判明している。そのために3つのDNA抽出法が開発されているが、増菌させた食品中の本菌を検出する値である 
（6段階希釈で最初に<I>C.jejuni</I>が分離される濃度によって決定づけられる）50％検出限界値 （DL50）をSAIとPCRの分離率の差を比較する目的で利用した。
実際はPCRとSAI間では、どの材料をとっても<I>C.jejuni</I>の検出頻度の差はなかった。サンプル数3でおこなった
無添加BFEB、ブロッコリー、かに身、マッシュルーム、生乳、生ガキのDL50を、SAI対PCRで示すと、0.01対0.02、0.06対0.01、0.04対0.07、0.08対0.03、0.01対0.01、0.01 対 0.01（CFU/5g food）であった。
増菌した食品中のPCRによる<I>C.jejuni</I>の検出限界の明白な差はDNA抽出の方法間に認められた。
PCRを行うという条件では48時間の増菌培養を行うことにより、疑わしい食品中の<I>C.jejuni</I>の証明を1日短縮することが出来る
　
<ITEM7>
 
Thunberg RL, J Food Prot, 63, 299
　
<PUBMED>

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/query?form=4&db=m&Term=Thunberg RL, J Food Prot, 63, 299